Monitorización bioluminiscente de la supervivencia del injerto en un modelo de transferencia adoptiva de diabetes autoinmune en ratones
Summary
Este protocolo describe un método sencillo y mínimamente invasivo para trasplantar e imágenes de células NIT-1 en ratones inmunodeficientes combinados diabéticos no obesos (NOD) graves desafiados con esplenocitos purificados de ratones NOD espontáneamente diabéticos.
Abstract
La diabetes tipo 1 se caracteriza por la destrucción autoinmune de las células beta productoras de insulina del páncreas. Un tratamiento prometedor para esta enfermedad es el trasplante de células beta derivadas de células madre. Sin embargo, las modificaciones genéticas pueden ser necesarias para proteger las células trasplantadas de la autoinmunidad persistente. Los modelos de ratón diabético son una herramienta útil para la evaluación preliminar de estrategias para proteger las células trasplantadas del ataque autoinmune. Aquí se describe un método mínimamente invasivo para trasplantar e imágenes de injertos celulares en un modelo de transferencia adoptiva de diabetes en ratones. En este protocolo, las células de la línea celular beta pancreática murina NIT-1 que expresan el transgén luciferasa luc2 se trasplantan por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes diabéticos no obesos (NOD) inmunodeficientes combinados graves (scid). Estos ratones se inyectan simultáneamente por vía intravenosa con esplenocitos de ratones NOD espontáneamente diabéticos para transferir la autoinmunidad. Los injertos se visualizan a intervalos regulares a través de imágenes bioluminiscentes no invasivas para monitorear la supervivencia celular. La supervivencia de las células mutantes se compara con la de las células de control trasplantadas en el mismo ratón.
Introduction
La diabetes tipo 1 (DT1) es causada por la destrucción autoinmune de las células beta productoras de insulina del páncreas. La pérdida de masa de células beta resulta en deficiencia de insulina e hiperglucemia. Los pacientes con DT1 dependen de múltiples inyecciones diarias de insulina exógena y experimentan episodios de hiperglucemia e hipoglucemia graves a lo largo de sus vidas. Las complicaciones relacionadas con estos episodios incluyen retinopatía diabética, disminución de la función renal y neuropatía1.
Las inyecciones de insulina son un tratamiento, pero no una cura para la DT1. Sin embargo, reemplazar la masa de células beta perdidas tiene el potencial de revertir la enfermedad al permitir que los pacientes produzcan su propia insulina. Sin embargo, el suministro de islotes donantes cadavéricos es limitado2. Los islotes derivados de células madre (islotes SC) pueden proporcionar un suministro prácticamente ilimitado de células beta para trasplante. Varios grupos han demostrado que las células madre embrionarias humanas (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden diferenciarse para generar células similares a beta funcionales 3,4,5. Los datos prometedores de los primeros ensayos clínicos indican que estas células mantienen su función después del trasplante y pueden permitir que los pacientes se vuelvan independientes de la insulina6. Sin embargo, se requiere inmunosupresión crónica, lo que aumenta su susceptibilidad al cáncer y la infección. Además, los agentes inmunosupresores pueden ser citotóxicos para los injertos a largo plazo7. Para eliminar la necesidad de inmunosupresión, los islotes SC pueden modificarse genéticamente para protegerlos de la autoinmunidad recurrente, así como de la aloinmunidad después del trasplante.
La investigación con células madre es muy exigente en costos y mano de obra. Las líneas celulares de ratón y los modelos animales son herramientas útiles para la identificación inicial y validación experimental de estrategias para proteger las células trasplantadas de la autoinmunidad. El ratón NOD desarrolla diabetes autoinmune espontánea con muchas similitudes con la DT1 humana8, y la línea celular de insulinoma NIT-1 comparte un fondo genético con esta cepa de ratón9. La diabetes puede ser transferida adoptivamente a la cepa de ratón NOD-scid inmunodeficiente relacionada a través de la inyección de esplenocitos diabéticos de ratones NOD para sincronizar temporalmente el inicio de la diabetes en ratones experimentales replicados10. Este modelo se puede utilizar para identificar objetivos genéticos de forma relativamente rápida y económica para su posterior validación en islotes SC. Recientemente, el método se aplicó para identificar y validar RNLS, un objetivo que se encontró que protege los islotes humanos primarios de la autoinmunidad in vivo y los islotes derivados de iPSC del estrés de las células beta in vitro11. Aquí se describe un protocolo sencillo para trasplantar células NIT-1 genéticamente modificadas y monitorear de forma no invasiva su supervivencia en un modelo de transferencia adoptiva de diabetes autoinmune en ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
La DT1 es una enfermedad devastadora para la que actualmente no existe cura. La terapia de reemplazo de células beta ofrece un tratamiento prometedor para los pacientes con esta enfermedad, pero la barrera crítica para esta estrategia es el potencial de ataque autoinmune recurrente contra las células beta trasplantadas. La ingeniería genética de las células SC-beta para reducir su visibilidad o susceptibilidad inmune es una posible solución a este problema. Aquí se describe un protocolo para obtener imágenes no …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Erica P. Cai y al Dr. Yuki Ishikawa por desarrollar el método descrito en este protocolo (ver ref. 11). La investigación en los laboratorios de S.K. y P.Y. está respaldada por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, el Instituto de Células Madre de Harvard y la Fundación Beatson. T.S. fue apoyado por una beca postdoctoral del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) (T32 DK007260-45), y K.B. fue apoyado en parte por una beca de la Fundación Mary K. Iacocca.
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
- Katsarou, A., et al. Type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021)
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
