Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi
Summary
Questo protocollo descrive un metodo semplice e minimamente invasivo per il trapianto e l’imaging delle cellule NIT-1 in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD) gravi sfidati con splenociti purificati da topi NOD spontaneamente diabetici.
Abstract
Il diabete di tipo 1 è caratterizzato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta produttrici di insulina del pancreas. Un trattamento promettente per questa malattia è il trapianto di cellule beta derivate da cellule staminali. Le modificazioni genetiche, tuttavia, possono essere necessarie per proteggere le cellule trapiantate dall’autoimmunità persistente. I modelli murini diabetici sono uno strumento utile per la valutazione preliminare delle strategie per proteggere le cellule trapiantate dall’attacco autoimmune. Descritto qui è un metodo minimamente invasivo per il trapianto e l’imaging di innesti cellulari in un modello di trasferimento adottivo del diabete nei topi. In questo protocollo, le cellule della linea cellulare beta pancreatica murina NIT-1 che esprime il transgene luciferasi luc2 della lucciola vengono trapiantate per via sottocutanea in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD)-gravi immunodeficienti combinati (SCID). Questi topi vengono iniettati simultaneamente per via endovenosa con splenociti da topi NOD spontaneamente diabetici per trasferire l’autoimmunità. Gli innesti vengono ripresi a intervalli regolari tramite imaging bioluminescente non invasivo per monitorare la sopravvivenza cellulare. La sopravvivenza delle cellule mutanti è paragonata a quella delle cellule di controllo trapiantate nello stesso topo.
Introduction
Il diabete di tipo 1 (T1D) è causato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta produttrici di insulina del pancreas. La perdita di massa delle cellule beta provoca carenza di insulina e iperglicemia. I pazienti T1D si affidano a più iniezioni giornaliere di insulina esogena e sperimentano episodi di grave iperglicemia e ipoglicemia per tutta la vita. Le complicanze correlate a questi episodi includono retinopatia diabetica, diminuzione della funzionalità renale e neuropatia1.
Le iniezioni di insulina sono un trattamento ma non una cura per il T1D. La sostituzione della massa delle cellule beta persa, tuttavia, ha il potenziale per invertire la malattia consentendo ai pazienti di produrre la propria insulina. Tuttavia, la fornitura di isole donatrici cadaveriche è limitata2. Le isole derivate dalle cellule staminali (isole SC) possono fornire una fornitura virtualmente illimitata di cellule beta per il trapianto. Diversi gruppi hanno dimostrato che le cellule staminali embrionali umane (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere differenziate per generare cellule beta-simili funzionali 3,4,5. I promettenti dati dei primi studi clinici indicano che queste cellule mantengono la loro funzione dopo il trapianto e possono consentire ai pazienti di diventare insulino-indipendenti6. L’immunosoppressione cronica è necessaria, tuttavia, aumentando così la loro suscettibilità al cancro e alle infezioni. Inoltre, gli agenti immunosoppressori possono essere citotossici per gli innesti a lungo termine7. Per eliminare la necessità di immunosoppressione, le isole SC possono essere geneticamente modificate per proteggerle dall’autoimmunità ricorrente e dall’alloimmunità dopo il trapianto.
La ricerca sulle cellule staminali è molto impegnativa in termini di costi e manodopera. Le linee cellulari di topo e i modelli animali sono strumenti utili per l’identificazione iniziale e la validazione sperimentale di strategie per proteggere le cellule trapiantate dall’autoimmunità. Il topo NOD sviluppa diabete autoimmune spontaneo con molte somiglianze con ilT1D 8 umano e la linea cellulare di insulinoma NIT-1 condivide un background genetico con questo ceppo di topo9. Il diabete può essere trasferito in modo adottivo al ceppo murino NOD-scid immunodeficiente correlato tramite l’iniezione di splenociti diabetici da topi NOD al fine di sincronizzare temporalmente l’insorgenza del diabete in topi sperimentali replicati10. Questo modello può essere utilizzato per identificare bersagli genetici in modo relativamente rapido ed economico per un’ulteriore convalida nelle isole SC. Recentemente, il metodo è stato applicato per identificare e convalidare RNLS, un bersaglio che è stato trovato per proteggere le isole umane primarie dall’autoimmunità in vivo e le isole derivate da iPSC dallo stress delle cellule beta in vitro11. Descritto qui è un semplice protocollo per trapiantare cellule NIT-1 geneticamente modificate e monitorare in modo non invasivo la loro sopravvivenza in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il T1D è una malattia devastante per la quale attualmente non esiste una cura. La terapia sostitutiva delle cellule beta offre un trattamento promettente per i pazienti con questa malattia, ma la barriera critica a questa strategia è il potenziale di attacchi autoimmuni ricorrenti contro le cellule beta trapiantate. L’ingegneria genetica delle cellule SC-beta per ridurre la loro visibilità o suscettibilità immunitaria è una potenziale soluzione a questo problema. Descritto qui è un protocollo per l’imaging non inva…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Dott.ssa Erica P. Cai e la Dott.ssa Yuki Ishikawa per aver sviluppato il metodo descritto in questo protocollo (vedi rif. 11). La ricerca nei laboratori di SK e P.Y. è supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute e Beatson Foundation. T.S. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), e K.B. è stato supportato in parte da una borsa di studio della Mary K. Iacocca Foundation.
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
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