Monitoramento Bioluminescente da Sobrevida do Enxerto em Modelo de Transferência Adotiva de Diabetes Autoimune em Camundongos
Summary
Este protocolo descreve um método simples e minimamente invasivo para transplante e obtenção de imagens de células NIT-1 em camundongos imunodeficientes combinados não-obesos diabéticos (NOD)-graves desafiados com esplenócitos purificados de camundongos NOD espontaneamente diabéticos.
Abstract
O diabetes tipo 1 é caracterizado pela destruição autoimune das células beta produtoras de insulina do pâncreas. Um tratamento promissor para essa doença é o transplante de células-tronco derivadas de células-tronco. Modificações genéticas, no entanto, podem ser necessárias para proteger as células transplantadas da autoimunidade persistente. Modelos de camundongos diabéticos são uma ferramenta útil para a avaliação preliminar de estratégias para proteger células transplantadas do ataque autoimune. Descrito aqui é um método minimamente invasivo para transplante e imagem de enxertos celulares em um modelo de transferência adotiva de diabetes em camundongos. Neste protocolo, células da linhagem beta pancreática murina NIT-1 expressando o transgene luciferase luciferase luc2 são transplantadas subcutaneamente em camundongos imunodeficientes diabéticos não obesos (NOD)-imunodeficientes combinados graves (scid). Esses camundongos são injetados simultaneamente por via intravenosa com esplenócitos de camundongos NOD espontaneamente diabéticos para transferir autoimunidade. Os enxertos são imageados em intervalos regulares por meio de imagens bioluminescentes não invasivas para monitorar a sobrevivência celular. A sobrevivência das células mutantes é comparada à das células controle transplantadas no mesmo camundongo.
Introduction
O diabetes tipo 1 (DM1) é causado pela destruição autoimune das células beta produtoras de insulina do pâncreas. A perda de massa da célula beta resulta em deficiência de insulina e hiperglicemia. Os pacientes com DM1 dependem de múltiplas injeções diárias de insulina exógena e experimentam episódios de hiperglicemia grave e hipoglicemia ao longo de suas vidas. As complicações relacionadas a esses episódios incluem retinopatia diabética, diminuição da função renal eneuropatia1.
As injeções de insulina são um tratamento, mas não uma cura para a DM1. A substituição da massa perdida de células beta, no entanto, tem o potencial de reverter a doença, permitindo que os pacientes produzam sua própria insulina. No entanto, a oferta de ilhotas doadoras cadáveres é limitada2. As ilhotas derivadas de células-tronco (ilhotas SC) podem fornecer um suprimento virtualmente ilimitado de células beta para transplante. Vários grupos têm demonstrado que células-tronco embrionárias humanas (CTEs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem ser diferenciadas para gerar células beta-like funcionais 3,4,5. Dados promissores de ensaios clínicos iniciais indicam que essas células mantêm sua função após o transplante e podem permitir que os pacientes se tornem independentes de insulina6. No entanto, a imunossupressão crônica é necessária, aumentando sua suscetibilidade ao câncer e à infecção. Além disso, agentes imunossupressores podem ser citotóxicos para enxertos em longo prazo7. Para eliminar a necessidade de imunossupressão, as ilhotas SC podem ser geneticamente modificadas para protegê-las da autoimunidade recorrente, bem como da aloimunidade após o transplante.
A pesquisa com células-tronco é altamente exigente em custos e mão de obra. Linhagens celulares de camundongos e modelos animais são ferramentas úteis para a identificação inicial e validação experimental de estratégias para proteger células transplantadas da autoimunidade. O camundongo NOD desenvolve diabetes autoimune espontâneo com muitas semelhanças com a DM1 humana8, e a linhagem celular insulinoma NIT-1 compartilha um background genético com essa linhagem de camundongo9. O diabetes pode ser transferido adotivamente para a linhagem de camundongos NOD-scid imunodeficiente relacionada através da injeção de esplenócitos diabéticos de camundongos NOD, a fim de sincronizar temporalmente o início do diabetes em camundongos experimentais replicados10. Este modelo pode ser usado para identificar alvos genéticos de forma relativamente rápida e barata para posterior validação em ilhotas SC. Recentemente, o método foi aplicado para identificar e validar RNLS, um alvo que foi encontrado para proteger ilhotas humanas primárias da autoimunidade in vivo e ilhotas derivadas de iPSC do estresse da célula beta in vitro11. Descrito aqui é um protocolo simples para transplantar células NIT-1 geneticamente modificadas e monitorar de forma não invasiva sua sobrevivência em um modelo de transferência adotivo de diabetes autoimune em camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A DM1 é uma doença devastadora para a qual não existe cura atualmente. A terapia de reposição de células beta oferece um tratamento promissor para pacientes com essa doença, mas a barreira crítica a essa estratégia é o potencial de ataque autoimune recorrente contra as células beta transplantadas. A engenharia genética de células SC-beta para reduzir sua visibilidade imunológica ou suscetibilidade é uma solução potencial para este problema. Descrito aqui é um protocolo para imagens não invasivas de cé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Dra. Erica P. Cai e ao Dr. Yuki Ishikawa pelo desenvolvimento do método descrito neste protocolo (ver ref. 11). A pesquisa nos laboratórios de S.K. e P.Y. é apoiada por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Instituto de Células-Tronco de Harvard e Fundação Beatson. T.S. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) (T32 DK007260-45), e K.B. foi apoiado em parte por uma bolsa da Fundação Mary K. Iacocca.
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
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