Summary
社会的コロニーケージ設定内で自己開始された個人行動セッションからデータを取得するためのシステムが提示されます。このシステムの有効性は、自動化された熟練したリーチ評価を使用して実証され、脳卒中後の運動障害、モチベーションに関連する潜在的な行動変化、概日変動、およびその他の革新的な従属変数の特性評価を可能にします。
Abstract
ラットモデルでの行動試験は、心理学的、生物医学的、行動学的研究など、さまざまな目的で頻繁に利用されています。従来のアプローチの多くは、実験において、1人の研究者と各動物との間で1対1の個別の試験セッションを行うものです。この設定は研究者にとって非常に時間がかかる可能性があり、それらの存在は望ましくない方法で行動データに影響を与える可能性があります。さらに、ラット研究のための従来のケージは、通常種に典型的である濃縮、運動、および社会化の欠如を課し、この文脈は行動データの結果を歪める可能性もあります。これらの制限を克服することは、後天性脳損傷の研究を含むいくつかの研究用途にとって価値があるかもしれません。ここでは、ヒトがいないコロニーケージ内で個々のラットの行動を自動的に訓練およびテストするための方法の例が示されています。無線周波数識別を利用して、個々のラットに合わせてセッションを調整することができます。このシステムの検証は、脳卒中前後の熟練した前肢運動能力を測定する例のコンテキストで行われました。脳卒中後の行動障害の従来の特性と、成功率、引っ張り力のさまざまな側面、発作分析、開始率とパターン、セッション時間、概日パターンなど、システムによって可能になる新しい測定が測定されます。これらの変数は、いくつかの制限なしに自動的に収集できます。この装置は、曝露、タイミング、および実践の実験的制御を取り除きますが、検証により、動物間でこれらの変数に合理的な一貫性がもたらされました。
Introduction
ラットモデルを用いた行動訓練と試験は、認知過程の探索から病態など、数え切れないほどの研究分野で重要である1。通常、このトレーニングとテストは、研究者が手動で動物を自宅のケージから取り出し、一時的に何らかの装置に入れて、1対1のセッションで1匹の動物で実施されます。残念ながら、このアプローチにはいくつかの困難と制限があります。まず、行動テストは研究者にとって非常に時間がかかる可能性があり、トレーニングが必要な場合、その時間要件はさらに大きくなります。第二に、このアプローチは、他の場所で確立されたように、取得したデータに自動的に影響を与えるか、潜在的に混乱させることさえあります2。これらの交絡は、濃縮関連の変数を考慮するときに特に顕著です。具体的には、実験用ラットは伝統的に1匹または2匹のラットにちょうど十分な大きさの小さなケージに収容されており3、ランニングホイールが提供されない場合、彼らは運動する有意義な機会なしに一生を過ごす可能性があります。さらに、孤立した住居は、ラット4などの社会種の主要なストレス源になる可能性があります。これらの福祉関連の欠点のいくつかは、ラットの生理機能5,6に影響を与える可能性が高く、種に典型的な行動発現4の発達を先取りし、人間の状況に適用されるげっ歯類モデルの質に影響を与える可能性があります。
近年、研究者はこれらの問題に対するいくつかのタイプの解決策を追求してきました。最も単純なタイプの解決策は、行動テストとトレーニングを自動化することでした 7,8,9,10、したがって、1人の研究者が1匹の動物に注意を向ける必要がなくなります。追加の解決策は、実験チャンバー11,12への動物の移動を自動化することで、人間の関与の必要性をさらに排除することである。最後に、動物を他の動物と一緒にコロニーケージに収容し、探索と濃縮のためのより多くの余地を与えることを可能にするいくつかの設定が検討されています13。これらの利点にもかかわらず、このようなコロニーのセットアップは、個別に差別化された行動データを収集する努力を制限したり、複雑にしたりする可能性があります(ただし、コンピュータービジョンを使用する取り組みを参照)14,15。個々の行動データが必要な場合、行動セッションのためにコロニーケージから動物を識別して回収することも、より困難または複雑になる可能性があります。現在、(濃縮された)コロニーハウジング16,17,18から個々の行動データを収集するためのシステムはほとんど存在しない。
これらの欠点は、後天性脳損傷の行動への影響に関する研究に特に影響を与える可能性があります。第一に、人間の存在および/または性別、および取り扱い慣行がげっ歯類の行動に影響を与えることは明らかであり2,19、これらの変数は、以前のラットとラットの行動に異なる影響を与える可能性があります。脳卒中後。第二に、脳卒中後の人間の行動結果は、リハビリテーション運動の推奨用量への関与を自発的に減少させることによって悪化する可能性があります20。現在、げっ歯類の実験では、ラットは行動セッションに参加するか棄権するかを自由に選択できないため、この種のコンテキストをモデル化しない傾向があります。
この記事では、濃縮コロニーケージの枠組みの中で個々の行動テストを容易にするために設計されたプロトコルを紹介します。このアプローチは、現在の慣行の制約に対処するだけでなく、革新的な対策を探求するための道を開きます。1匹のラット回転式改札口(ORT)が開発され、コロニーケージに取り付けることができるため、動物は独立して行動室に入り、独自のトレーニングとテストセッションを開始できます。このシステムは手頃な価格です。各ORTは低コストで組み立てることができます(3Dプリンターへのアクセスがある場合)。過去には、このシステムの検証は、基本的なオペラント室を用いて行われ、実験者の立ち会いなしに、動物が単純なオペラントレバープレスを行うように一貫して訓練され得ることを示した16。それにもかかわらず、この構成が他のシナリオに適用できるかどうかという問題は未解決のままです。目的は、以前に確立されたORTコロニーケージセットアップの有効性を検証することです 脳卒中後の運動障害に関連する熟練したリーチ行動をトレーニングおよび定量化します。この構成は、脳卒中研究では通常調査されない新しい変数を生成するために利用されました。これらの変数には、熟練したリーチタスクのパフォーマンス指標と、モチベーションと意思決定に関連する可能性のある自己開始の測定が含まれます。さらに、脳卒中による24時間にわたる毎日の自己開始の概日パターンの変化が効果的に検出された。
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Protocol
すべての手順と動物の世話は、ノーステキサス大学の施設の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドに準拠しています。本研究で使用した成体の雄および雌のLong-Evansラット(400-800 g、1.5歳)をコロニーケージに収容しました。
1.機器の準備
- 設計ファイルと建設説明書に従って、1ラット回転式改札口(ORT)を入手または組み立てます( 補足ファイル1 および 補足コーディングファイル1を参照)。詳細については、Butcher et al.16 を参照してください。
注:ORTはラットのサイズに固有であるため、コロニーケージにはほぼ同じサイズの動物を含める必要があります。ORTを自己組み立てたくない場合は、組み立て済みの状態で購入できます( 材料の表を参照)。 - 無線周波数識別(RFID、 資料表を参照)リーダーを入手して取り付け、RFIDタグを取得して動物に注入します。
注:RFID全二重(FDX)タグを注入する場合、ラットがORTを通過するときに、方向がRFIDアンテナに対して垂直である必要があります。この検証では、脊椎と平行な平面上の肩甲骨の間にタグを皮下に埋め込んだ。 - RFIDアンテナをORTのチューブに取り付けます。
- 実験的な問題に適した行動装置およびコロニーケージを構築および/または取得します。この例では、特注のコロニーケージ21,22が市販のオペラントチャンバーと組み合わせて使用されました(材料の表を参照)が、理論的には任意の機器を使用できます。
注:ORT を介した 行動装置へのアクセスをめぐるコロニー飼育動物の競争を検討する必要があります。4〜6匹の動物ごとに1つのORT +行動装置が必要になることを予想してください。 - 行動装置とコロニーケージの間にORTを取り付けます。
- ドレメル回転工具( 材料の表を参照)または同様の器具を使用して、行動装置およびコロニーケージにポータル穴を開けます。内径は、建設したORTトンネルの外径と等しくなければなりません。
注:ORTを操作するには数インチ高くする必要があるため、コロニーケージと装置の高さを揃えるために小さなプラットフォームまたはスタンドが必要になります。 - 動物がORTを通過するときに動物を読み取るRFIDシステムを設置し、必要に応じて行動装置と統合します。
2.術前行動訓練
- 同じサイズのラットのコホートを入手し、コロニーケージに導入します。
注:隔離された、または同種の動物がほとんどいない状態で広範囲に飼育または飼育された動物は、特にコロニーケージの社会的領域を横断する場合、チャンバーを探索するのに苦労する可能性があります。動物は、この落とし穴を避けるために、人生の早い段階でグループケージにさらされるべきです。 - 行動装置内のマニプランダへのアクセスを削除し、占有時に平均して60秒ごとに報酬を自動配信するようにチャンバーを設定します。
注:この研究では、報酬としてショ糖水(30%〜40%)を使用しましたが、加糖練乳も効果的です。 - すべてのラットを訓練して、ORT を介して 行動装置に定期的に侵入します。
- 少なくとも1日に1回は、すべてのデータがORTに入っていることを確認するためにデータをチェックしてください。動物が入ってこない場合は、ペンサイズの物体をロック機構に挿入して、動物がより自由に探索できるように一時的にロックされないようにします。それでも動物が入らない場合は、回転式改札口を取り外し、一時的な側壁を取り付けて、チャンバーへのトンネルへの自由なアクセスを許可します。
- すべての動物が定期的にチャンバーに入ったら、ロック(および回転式改札口)を戻し、再評価します。
注:動物は、他のラットからの一時的な猶予としてORTとチャンバーを占有することもできます。チャンバーのこの種の独占を未然に防ぐ1つの方法は、単純な分離チャンバーにブリッジする追加のORTを取り付けることです。 - マニプランダム(この例ではプルハンドル)を導入し、最高の感度に設定します。ハンドルをボックスのすぐ内側(最大2 cm)またはボックスのすぐ外側に挿入します。
注意: ペインターのテープは、ハンドルの後ろの手の届かないところに貼られていると、リーチの試みを呼び起こすことができます。 - 報酬(30%のショ糖水)が自動配信される頻度を減らします(例:90〜120秒ごと)。実験者のニーズと動物の好みに合った報酬を利用できることを忘れないでください。
- データを毎日チェックして、すべての動物がレバーを作動させることを学習したことを確認してください。すべての動物が引っ張られるまで、レバーに餌をやったり、挿入レベルを変更したりします。
- 報酬の自動配信を中止し、プルハンドルを作動 させることによって のみ報酬を利用できるようにします。
- 以前に挿入した場合は、レバーがチャンバーの外側の1 cmから1.25 cmの最終位置になるまで、毎日レバーを0.25 mmから0.5 mm引っ込めます(すべてのラットがその収縮レベルで引っ張り続ける場合)。
注:レバーの正確な位置は、ラットのサイズによって異なります。目的の到達地形になる位置を選択してください。 - パーセンタイルまたはその他のトレーニングプログラムを開始して、ハンドルをアクティブにするために必要な引っ張り力を徐々に増やします。
注:この研究では、前の15の回答の上位四分位数で強化の基準を設定するパーセンタイルスケジュールを使用しました。あるいは、プル基準の段階的な増加を用いることもできる7。 - 動物が最終的な基準範囲である120 gのプルに確実に到達したら、パーセンタイルトレーニングプログラムを削除し、ハンドル活性化の基準を120 gの定数に固定します。
- 成功率が約1週間安定している(傾向がない)まで、この戦力要件でベースラインデータを収集します。
3.脳卒中を誘発する
- すべてのコロニーケージに入れられた動物で同時に脳卒中を外科的に誘発します。
注:脳卒中を誘発するために、脳卒中の内皮-1モデルが用いられたが、これは他の場所で説明されている23。 - 動物が3〜7日間、個別に隔離された従来のケージで回復するのを待ちます。
4.術後行動検査
- 回復後、ORTに取り付けられた熟練したリーチ装置を使用して動物をコロニーケージに戻します。
- 脳卒中後の欠損を評価するのに十分なデータが収集されるまで(1〜数日)、プル要件を最終的に120 gに保ち(ステップ2に従う)、行動テストを実行します。
- 脳卒中後または回復に関連する独立変数は、動物がチャンバーにアクセスしている間、その後の数日間に実装します。
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Representative Results
動物は、1つのコロニーケージで4匹の雌ラット、別のコロニーケージで4匹のオスラットで訓練およびテストされました。すべてのラットは、4日以内にORTを通過することを学びました。4匹の雌ラットは、約6週間の訓練で120gの力の必要量で>85%の成功した発作に達し、雄ラットは10週間で同じ基準に達しました(恵まれないラットでの標準的な訓練では約3週間と比較して)7。このトレーニング期間は、2週目から6週目にかけて継続的なトラブルシューティングを必要とするいくつかのハードウェアとソフトウェアの不具合により、大幅に延長されました。これらの不具合が解消されると、訓練は順調に進み、その後の訓練スケジュールは現在の文献7に匹敵することが期待されます。雄のラットはまた、1匹の雄のラットが引っ張り始める機会を増やすために、より長く訓練されました。しかし、彼はそうすることはなく、7週目以降のさらなる分析と手術から除外されました。ラットの性能がベースラインで安定したら、各ケージについて5日間の脳卒中前のベースラインデータを取得しました。データは、ORTが一日中ケージに接続されたままである日数に限定されていました(一部の日は、飼育関連の一時的な切断が必要でした)。雌のケージの場合、ベースラインの日数は脳卒中の7、8、9、10、および12日前でした。男性の場合、ベースライン日は脳卒中8日前、9日前、10日前、11日前、および13日前でした。
脳卒中導入手術中、この検証の動物は、基底前脳(座標-5.8 mm前後、左内側/外側0.7 mm、背側/腹側8.3 mm)または腹側被蓋野(座標-2.3 mm前後、左内側/外側3.3 mm、7.0 mm背/腹側)のいずれかにワイヤレス受信チップに接続された電極を同時に埋め込みました。これらのインプラントは、その後の回収実験で使用するためのものであり、ここで報告されたコロニーケージORTの検証とは関係ありません。インプラントは、皮膚をその上で閉じることができるように設計されており、受けチップは左腕の皮下に配置されています。
1匹の雌動物は脳卒中誘発中に死亡しました。別の女性は、脳卒中後にハンドルを引いたことがなく、回復後数日で衰え始めました。安楽死後、彼女は脳卒中後のある時期に脳出血を経験した可能性があることがわかりました。これら2匹の動物は、脳卒中前の評価を含め、データセットから完全に除外されました。
脳卒中後、動物はORT を介して チャンバーに入り続け、手動成形の短いセッション(つまり、レバーの距離を短縮し、レバーに近づくか、レバーを引こうとすると報酬が得られる)を介して奨励されなければなりませんでしたが、通常のレバーを引くことをすぐに再開しませんでした。雌ラットは脳卒中後4〜7日目に引っ張らなかったため、8〜11日目に補助的なレバーベイト(つまり、レバーにピーナッツバターを軽くたたく)と手動成形が与えられました。彼らは11日目に自律的に引っ張り始めました。オスは、メスとの以前の経験に基づいて、6日目まで回復することを許可されました。彼らは脳卒中後6日目に引っ張らなかった。彼らは7日目に補助餌を与えられました。彼らは脳卒中後8日目に 自律的に引っ張り始めました。動物が再び引っ張ろうとする補強に接触すると、補助的な餌付けや整形は中止され、脳卒中後のデータが収集されました。オスは、より複雑な従属変数(概日測定と試合後の一時停止)を完全に分析するのに十分なプルを8日目に行わなかったため、同じ基準で9日目、10日目、11日目 にプルし続けることが許されました。8日目、10日目、11日目 は完全な日でした。脳卒中後の引っ張りの初日は、概日分析と試合間の休止の分析を除くすべての分析に使用されました。この分析では、女性の1日と男性の3日間を使用しました。脳卒中後の分析では、2匹の雌ラットは1日で55回と844回、3匹の雄ラットは3日間で536回、153回、190回引きました。
データは、プルと試合に従って整理されました。機器自体から生じる揺れの記録を回避するために、プルは+/-1gのヒステリシスを持つ5gの閾値を使用して測定されました。動物が6gを超える圧力をかけると引っ張りが記録され、ハンドルが4g未満の力を記録すると停止しました。動物は、いくつかの急速な引っ張りの発作で引き寄せる傾向がありました。1回の引っ張りが120gに達すると、補強材が供給されました。試合は、ピークがすべて1秒未満で分離されたプルのクラスターと見なされました。この閾値は、1秒未満のピーク間隔クラスターが自然に発達し、他のピーク間間隔がはるかに確実に長いことを示す以前のデータに基づいて選択されました。ラットは一般的に、フィーダーを訪れる前に、試合でフィーダーを活性化した場合でも、何度も連続して引っ張ります。
合計7つの従属変数が分析されました。対応のある t検定 は、ベースライン平均と脳卒中後の測定値の間で実行され、 図1、 図2、および 図3で報告されています。これらの数値には、個々の動物ごとのデータも表示され、予想される各測定値の日間および個体間の変動の印象を提供します。
図1は、熟練したリーチ評価7,8,10に典型的ないくつかのパフォーマンス指標に沿った脳卒中前後のパフォーマンスを示しています。脳卒中後のすべてのデータは、十分な試験を収集するのに数日かかった場合でも、単一のデータポイントに集約されました。プロトコルと自動化された自発的なシステムは、試合ごとの成功率、プルあたりの平均力、および試合ごとの引っ張りの評価に成功し、これらはすべて、さまざまな程度の統計的有意性で脳卒中に対する感度を示しました。
図2 は、コロニーケージORTのセットアップから生じる2つの新しい変数、つまりセッション開始と累積セッション期間を示しています。驚くべきことに、脳卒中はセッションの開始に影響を与えませんでした。脳卒中前後の両方で、女性は男性よりも確実にセッションを開始しましたが、脳卒中後の割合は変化しませんでした。逆に、ほとんどのラットでチャンバーで過ごす時間が長くなりましたが、これはおそらく発作の成功率が低下したためです(その結果、報酬の割合が低下します)
セッションの開始(コロニーケージで利用可能な濃縮と社会的報酬と食物強化の間の選択を表す)とチャンバー内の時間(報酬の値を伴う条件付けられた場所の好みの場合)も、動機付けの指標と見なすことができます24、25、26、27。図3に見られるように、セッション分28あたりのプルと試合間の一時停止29によって定量化された「努力」など、追加の動機ベースの測定が含まれていました。これらの変数は脳卒中の影響を受けました。予想通り、セッション分あたりのプル数は減少し、試合間の一時停止の時間は長くなりました。しかし、後者の尺度の変更は複雑でした。試合の休止の分布は、より長い休止、いくつかの非常に長い休止、そしてより短い休止など、より混沌としているように見えました。これは、元の熟練した運動ユニットの故障を示している可能性があります。もしそうなら、それは同じものの簡単に測定可能な指標かもしれません。
グループサイズが小さいにもかかわらず、測定された変数のいずれかが成功率と相関関係を示し、機能的重要性を示唆している可能性があるかどうかを判断するための調査が行われました。Shapiro Wilk 検定は、成功率、平均ピークプル、1 分あたりの試合、累積セッション時間、試合間の一時停止、および試合ごとのプルの変数のデータの分布が等しいかどうかを評価するために実行されました。シャピロ・ウィルク検定は、いくつかの変数の分布が正規性から有意に逸脱していることを示しました。したがって、スピアマンの順位相関を実行して、脳卒中前または脳卒中後の成功率と次の変数との関係を決定しました:平均ピーク、1分あたりのプル試合、累積セッション時間、試合間の一時停止、および試合ごとのプル。平均引張力以外のストローク前の変数は、成功率と有意な相関がありませんでした( 表1を参照)。脳卒中後、平均引張力を除いて、ほとんどの変数は成功率と有意な相関関係を示しませんでした(表1)。
最後に、ORTは熟練した運動行動だけでなく、概日パターンの分析も可能にします。図4は、ORTが占有された各ケージの各時間の割合を、ベースラインおよび脳卒中後の日数の平均として示しています。図の青い線は、1日を通して行われた1時間あたりのエントリ数の平均数を示しています。脳卒中前、動物は朝に高いレベルで熟練したリーチタスクに従事し、一日を通して持続時間を短縮していました。点灯の数時間前に、エンゲージメントは再び急増するか(メス)、ごくわずかに増加し(オス)、ライトが点灯した直後に中止されました。この二峰性の概日分布は、脳卒中後に完全に変化しました。動物は朝の関与が少なくなり、部屋での時間はその日の後半にピークに達しました。このようなパターン化は、脳卒中30,31,32,33の後にしばしば観察される一般的な睡眠および概日リズムの乱れを反映している可能性があります。
図1:ORT手順を使用して、脳卒中後の熟練リーチの典型的なパフォーマンスの変化を測定します。 ストローク前後の熟練したリーチのパフォーマンスを測定しました。1試合あたりの成功率、1回のプルあたりの平均力、および1試合あたりのプル回数の動物ごとの1日の平均は、ベースラインの5日間と脳卒中後1日(左)およびベースラインの平均と脳卒中後1日(脳卒中後)の間で、対応のある t検定が報告されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:自己開始セッションパラメータが異なれば、脳卒中後に変化する傾向も異なります。 脳卒中前後の熟練したリーチ行動セッションの自己開始の測定は、ORT手順によって可能になりました。セッション開始の動物ごとの1日平均と累積1日セッション時間は、ベースラインの5日間と脳卒中後1日(左)およびベースラインの平均と脳卒中後1日(脳卒中後)の間で、対応のある t検定が報告されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:モチベーション関連の変数は脳卒中後に変化します。 モチベーションに関連する脳卒中前後の熟練したリーチ行動セッションのパフォーマンス測定が決定されました。発作間の一時停止期間とセッション分あたりの1日の発作率の動物ごとの1日平均は、ベースラインの5日間と脳卒中後1日(左)およびベースラインの平均と脳卒中後1日(脳卒中後)の間で、対応のある t検定が報告されています。試合間の休止は、これらの1日の平均値で変化しましたが、さらに驚くべきことに、脳卒中後の個々の休止の長さの分布も平均の両側で変化しました。個々の休止時間はすべての動物についてプールされ、対数軸(右端)に分布として表示されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:脳卒中後の自発的セッションの変化の概日パターン化。 すべての動物、雌、および雄について、脳卒中前(左)および脳卒中後(右)の自発的な熟練したリーチ行動セッションの概日パターンの尺度が決定された。これらのデータには、脳卒中前と脳卒中後の日の平均で、ケージごとのすべてのエントリとチャンバー占有のすべての時間が含まれます。次に、2つのケージを再度平均化して、合計分布を示します(上の行)。脳卒中前のパターンには、朝の高いエンゲージメントが含まれていましたが、覚醒時間を通じて減少し、睡眠段階の直前に新しいピークに達しました。脳卒中後のパターンは、セッションの継続時間が一日を通して増加し、睡眠段階の前にピークに達することを示しています。ネズミは住居の部屋で逆光サイクルをしていました。ライトオン期間は、ラットの通常の非アクティブ期間を示すために灰色で網掛けされて表示されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 相関 | ||||||
| 変数 | 比較変数 | スピアマン | ||||
| n | ストローク前 rs | p | ストローク後r s | p | ||
| 平均引張力 | 成功率 | 5 | 1 | <0.001 | -0.975 | 0.005 |
| 毎分引き試合 | 成功率 | 5 | 0.3 | 0.624 | -0.154 | 0.805 |
| 累積セッション期間 | 成功率 | 5 | -0.1 | 0.873 | 0.564 | 0.322 |
| 試合間の一時停止 | 成功率 | 5 | -0.6 | 0.285 | 0.205 | 0.741 |
| 試合ごとの引き込み | 成功率 | 5 | 0.1 | 0.873 | -0.821 | 0.089 |
表1:変数間のスピアマン相関係数。 脳卒中前または脳卒中後の成功率との関係を決定するためにスピアマンの順位相関が実行され、次の変数が決定されました:平均ピーク、1分あたりのプル試合、累積セッション時間、試合間の一時停止、および試合あたりのプル。相関の前に、Shapiro Wilk検定を実行して、すべての検定変数の成功率が等しい分布を評価し、一部の変数が正規性から大きく逸脱していることを示しました。平均引張力以外のストローク前の変数は、成功率と有意に相関していませんでした。この表は、成功率と5つの検定変数の間に関係がある場合に評価されたスピアマン相関係数(ρ)の結果を示しています。
補足ファイル1:ORTを構築する手順。 「1つのラット回転式改札口」を印刷および構築するための指示。説明書には、必要なすべての資料のリストとステップバイステップの説明(画像付き)が含まれています。このファイルには、入口と出口を登録するためのマイクロスイッチの取り付け方、およびRFIDリーダーを取り付けるための配線とプログラミングも含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1: これには、「One Rat Turnstile」の3Dプリントに必要なすべてのコンポーネントが含まれます。このファイルは、直接使用することも、 補足ファイル 1 の指示に従ってアクセスすることもできます。このファイル内のすべてのコンポーネントは、含まれている「定規」ピースを使用してスケーリングする必要があります(詳細については、 補足ファイル1 を参照してください)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルには複数の用途があります。まず、最も広くは、ORTは、社会的で豊かな住宅の文脈で、自動化された単一被験者の行動トレーニングとデータ収集を可能にする目的で開発されました。この研究では、典型的な行動指標を収集し、脳卒中の文脈でそれらを詳しく説明するというアイデアをテストしましたが、他のアプリケーションや行動課題についても同じことができます。この検証で収集された測定値でさえ、必要に応じて調整して、代替の強化スケジュール、代替行動などを含めることもできます。 第二に、この研究では、脳卒中後の熟練者の到達範囲の障害に関連するデータを収集するシステムの能力を評価しました。現在のプロトコルは、基本的なレバー押し16のティーチングと測定について以前に検証されています。現在のデータは、脳卒中関連の運動障害に関するデータを収集するための有効なアプローチであり、従来の熟練したリーチ評価に典型的な測定と新しい測定が可能であることを示しています。コロニーケージORTシステムのトラブルシューティングを行う際、大きな疑問は、動物が十分な頻度で行動セッションを自発的に開始するかどうか、そして特に脳卒中後のさまざまな実験状況でそうするかどうかでした。すべてまたはほとんどすべての動物が、単純なオペラント手順に十分に参加するように促すことができ、現在は脳卒中後の行動テストに参加できることが発見されました。脳卒中後の期間には手作業による成形が必要でしたが、動物はすぐに実験者の立ち会いなしに行動課題に従事するようになりました。
トラブルシューティング中に、成功の可能性を高めるいくつかの手順上のポイントが発見され、これらはプロトコルに統合されました。これらには、ラットのサイズに応じてORTをスケーリングし、動物が社会的文脈で同様のサイズと飼育であることを保証する必要性が含まれていました。さらに、チャンバーの競争が激しい可能性があるため、単一のORTが4〜6匹のラットを収容するのに最も効果的であることが発見されました。この競争は、従来の方法と比較して大きなストレスを誘発するようには見えないことは注目に値します。以前の実験では、従来の行動テストとは対照的に、コロニーケージのセットアップでコルチゾールレベルの低下が記録されました16。さらに、臆病な動物の場合、最初の訓練段階で回転式改札口を取り外したり、ロックを解除したままにしておくと、複数のラットが一緒にチャンバーを探索できるようになることがわかりました。
このアプローチは脳卒中後の運動障害の評価に効果的ですが、いくつかの制限を認識することが不可欠です。第一に、脳卒中後の動物はすぐに引っ張りを再開しない場合があり、数回の手動成形および/または餌付けが必要になる場合があります。このようなアプローチでは、トレーニングとテストの完全自動化がより困難になる可能性があります。しかし、これはORTコロニーケージのセットアップに特有の制限ではなく、実験者が開始した行動セッションの動物はしばしば同じ問題を抱えています。
もう一つの制限は、本来の目的以外にチャンバーを使用する可能性があることです。逸話的に、動物が行動室に入り、行動課題に積極的に参加することなく、室内でかなりの時間を過ごしたいくつかの例が観察されました。これは時折、すべての動物に起こりましたが、特にオスに起こりました。これは単に、ORTが動物が社会的に関与することを望まないときに、動物に少しプライバシーを提供したからかもしれません。とはいえ、他のORTを使用してコロニーケージに「一人」の部屋を追加すると、この問題が軽減されます。
また、動物がORTを半開いた状態でトンネル内で停止し、一定期間そこにとどまることも観察されました。これが、RFIDリーダーを行動室の近くに置き、動物が完全に入るまで動物が登録されないようにするのが最善である理由です。ORTにとどまるのは、スクイーズシュートと同じように心地よいと推測されるかもしれません。いずれにせよ、動物はデータ収集を妨げるような方法でそこにとどまることはなく、特に代替のORTが取り付けられた分離チャンバーが利用可能な場合にはそうではありません。
別の制限は、自発的なセッションは、グループ内の個人間の行動セッション時間または行動反応の機会を均等にすることがより困難になる可能性があることです。この制限は、累積トレーニング時間と回復との関係を考えると、脳卒中関連の研究に特に関連している可能性があります。ただし、この制限は少なくとも部分的に対処できます。実験が必要な場合、目標の持続時間または目標の応答数に達したときにセッションを終了するように多くの行動装置をプログラムすることができます(つまり、報酬の終了またはマニプランダムの収縮によって)。このソリューションは、個人が目標を達成できない傾向には対処しません。しかし、繰り返しになりますが、その制限はこの設定に固有のものではありません。
この設定には、行動トレーニングや曝露が数回の制限された時間ではなく、一日中行われるという利点もあります。これは、いくつかの状況で役立つ可能性があります。特に脳卒中では、行動リハビリテーションアプローチの投与量効果を調査するために利用できます。
最後に、ORTは、社会的敗北、強制水泳、条件付けされた恐怖などの嫌悪的処置には使用できない可能性があります。ORTは、行動パラダイムが食欲をそそることを要求します。そうでなければ、動物は単に行動室を避ける可能性が高いです。
制限はあるものの、この手順は、ラットに対して現在利用可能な行動パラダイムに大きな利点を追加します。まず、このセットアップにより、実験者の時間を解放しながら、継続的なハイスループットデータ収集が可能になります。機器と動物を継続的に監視することは重要ですが、実験者は一日を通して短時間しか立ち会う必要はありません。8匹の動物に対して行動セッションを実行するには、従来のアプローチを使用して、毎日4〜10時間のセッションが必要でした。ORTコロニーケージアプローチは、その時間を実質的にゼロに短縮するだけでなく(機能し自動化された装置を想定)、週末にデータ収集を行うことができ、追加の存在はほとんど必要ありません。週末に行動活動を継続的に利用できるようにすることで、動物が利用できる全体的な濃縮も増加します。
ORTコロニーケージプロトコルは、データの利点とロジスティックの利点を提供します。ペーシング、期間、またはここで検討したような自発的なセッションの他のパラメーターなど、従来は不可能だった多くの従属変数が利用可能です。概日変数は、多くの場合、走行輪を使用して測定されます。ただし、このプロトコルを使用すると、他の種類の動作のパターン化と選択パラメーターを調べることができます。ORTは、コロニーケージを接続し、異性に視覚的または嗅覚的なアクセスを提供するために使用することもでき、動機を評価するだけでなく、配偶者追跡の概日パターンを評価することも可能になります。この研究は、脳卒中後に発生する可能性のあるモチベーションの喪失とうつ病に関連する、または文脈で翻訳された質問を調査するのに役立つ可能性のある概日変数や開始関連変数など、脳卒中研究に役立つ可能性のあるいくつかの新しい従属変数を特徴付けました34,35。ここでは取り上げませんが、リーチキネマティクスの定性分析など、脳卒中に関連する他の重要な変数も、モーション起動カメラを介してこのORTコロニーケージプロトコルで簡単に対処できるはずです。
最後に、このプロトコルの重要な利点は、動物が生涯のほとんどを大規模で豊かな社会環境にとどまることができることです。動物福祉の進歩は、倫理的な理由だけでなく、科学的な理由からも、基礎的な実験室では重要です。動き回って社会化できる動物は、自然に制限や剥奪を伴わない病状のより良いモデルとして機能するはずです。さらに、このプロトコルの行動セッションの自給自足の性質は、行動データが収集されている間、人間が存在する必要がないことを意味します。実験室に人間がいると、行動データに影響を与える可能性があり、問題の人間、人間の訓練の程度、動物の扱い方によって異なる場合があります2,19。このようなデータに対する制御不能で変動する影響は、現在のプロトコルで最小限に抑えることができます。
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Disclosures
著者らには、開示すべき矛盾はない。
Acknowledgments
この研究は、ノーステキサス大学(UNT)への神経オペラント関係の研究のためのベアトリスH.バレット基金によって部分的に資金提供されました。神経可塑性および修復研究所のすべてのメンバー、特にValerie Rojas、Mary Kate Moore、Cameron Scallon、Hannah McGeeの意見と支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Consult with local makerspace | ||
| bolt | Boltdepot | 1346 | 6-32 or 8-32 by 0.5" |
| bolt | Boltdepot | 1348 | 6-32 or 8-32 by 0.75" |
| door hinge | XJS (Amazon) | 43398-16234 | 1" cabinet stainless steel door hinge set; Optional (if "perfect hinge" is not printed) |
| drill | Any electric drill works | ||
| extension spring | Nieko (Amazon) | 50456A | Choose and adjust spring based on ORT sized and desired tension |
| granulated sugar | |||
| lock nuts | Boltdepot | 2551 | 6-32 or 8-32 |
| measuring tape | |||
| microcontroller | Arduino | A000066 | Arduino Uno |
| microswitch | Sparkfun | KW4-Z5F | mini microswitch (SPDT-roller lever) |
| One Rat Turnstile (ORT) | Vulintus | Contact company to request quote if not self-assembling | |
| Operant Chambers as desired for behavioral assessment: For this experiment we used automated isometric pull chambers from Vulintus | Vulintus | No cat #: contact Vulintus | Contact Vulintus for quote |
| PLA filament | OVERTURE (Amazon) | UK-MATTEPLA17511 | |
| plexiglass | Lesnlok (Amazon) | B09P74K7BR | clear, 1/8" thickness, Cut to size |
| plexiglass cutter | |||
| python program | Python Software Foundation | software available on request | |
| RFID reader | Priority 1 Design | RFIDRW-E-USB | With antenna |
| RFID tag | Unified Information Devices | UC-1485-10 | |
| rod | Boltdepot | 23632 | cut to > 3.5" |
| Rotary tool | Used to bore hole in apparatus and colony caging for ORT; any hardware usable | ||
| sand paper | HSYMQ (Amazon) | TOMPOL-1118-1915-11 | |
| socket wrench set | Any socket wrench set works | ||
| soldering iron | |||
| super glue | 234790 | ||
| wire | Plusivo (Amazon) | EAN0721248989789 |
References
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