Summary
Se presenta un sistema para adquirir datos de sesiones de comportamiento individual autoiniciadas dentro de un entorno de jaula de colonia social. La eficacia de este sistema se demuestra utilizando una evaluación automatizada de alcance experto, que permite la caracterización de las alteraciones motoras posteriores al accidente cerebrovascular, las posibles alteraciones del comportamiento relacionadas con la motivación, las variaciones circadianas y otras variables dependientes innovadoras.
Abstract
Las pruebas de comportamiento en modelos de ratas se utilizan con frecuencia para diversos fines, incluida la investigación psicológica, biomédica y conductual. Muchos enfoques tradicionales implican sesiones de prueba individuales e individuales entre un solo investigador y cada animal en un experimento. Esta configuración puede llevar mucho tiempo para el investigador, y su presencia puede afectar a los datos de comportamiento de formas no deseadas. Además, el enjaulamiento tradicional para la investigación con ratas impone una falta de enriquecimiento, ejercicio y socialización que normalmente sería típica de la especie, y este contexto también puede sesgar los resultados de los datos de comportamiento. Superar estas limitaciones puede valer la pena para varias aplicaciones de investigación, incluido el estudio de la lesión cerebral adquirida. Aquí, se presenta un método de ejemplo para entrenar y probar automáticamente el comportamiento individual de ratas en una jaula de colonia sin la presencia de humanos. La identificación por radiofrecuencia se puede utilizar para adaptar las sesiones a cada rata. La validación de este sistema se produjo en el contexto del ejemplo de medición del rendimiento motor de las extremidades anteriores antes y después de un accidente cerebrovascular. Se miden las características tradicionales de las alteraciones conductuales posteriores a un accidente cerebrovascular y las nuevas medidas habilitadas por el sistema, incluida la tasa de éxito, varios aspectos de la fuerza de tracción, el análisis de combates, la tasa y los patrones de inicio, la duración de la sesión y los patrones circadianos. Estas variables se pueden recopilar automáticamente con pocas limitaciones; Aunque el aparato elimina el control experimental de la exposición, el tiempo y la práctica, la validación produjo una consistencia razonable en estas variables de un animal a otro.
Introduction
El entrenamiento conductual y las pruebas con modelos de ratas son importantes en innumerables áreas de investigación, desde la exploración de los procesos cognitivos hasta los estados de enfermedady más. Por lo general, este entrenamiento y pruebas se llevan a cabo con animales individuales en sesiones individuales, con un investigador retirando manualmente al animal de su jaula doméstica y colocándolo temporalmente en algún tipo de aparato. Desafortunadamente, existen varias dificultades y limitaciones con este enfoque. En primer lugar, las pruebas de comportamiento pueden llevar una gran cantidad de tiempo para los investigadores, y cuando es necesaria la formación, ese requisito de tiempo se vuelve aún mayor. En segundo lugar, este enfoque afecta automáticamente -o incluso potencialmente confunde- a los datos adquiridos, como se ha establecido en otro lugar2. Estos factores de confusión son especialmente notables cuando se consideran las variables relacionadas con el enriquecimiento. Específicamente, las ratas de laboratorio se alojan tradicionalmente en jaulas pequeñas que son lo suficientemente grandes para una o dos ratas, y si no se les proporcionan ruedas para correr, pueden pasar toda la vida sin oportunidades significativas para hacer ejercicio. Además, la vivienda aislada puede ser una fuente importante de estrés en una especie social como la rata4. Es probable que algunos de estos inconvenientes relacionados con el bienestar afecten a la fisiología de las ratas 5,6, lo que puede impedir el desarrollo de la expresión conductual típica de la especie4 e impactar en la calidad de los modelos de roedores aplicados a contextos humanos.
Los investigadores han buscado varios tipos de soluciones a estos problemas en los últimos años. El tipo de solución más simple ha sido automatizar las pruebas de comportamiento y el entrenamiento 7,8,9,10, eliminando así el requisito de que un solo investigador atienda a un solo animal. Una solución adicional ha sido automatizar la transferencia de animales a las cámaras experimentales11,12, eliminando aún más la necesidad de la participación humana. Por último, se han explorado varias configuraciones que permiten alojar a los animales en jaulas en colonias con otros animales y con más espacio para la exploración y el enriquecimiento13. A pesar de estas ventajas, estas configuraciones de colonias pueden limitar o complicar los esfuerzos para recopilar datos de comportamiento diferenciados individualmente (aunque véanse los esfuerzos para usar la visión artificial)14,15. Si se requieren datos de comportamiento individual, puede ser más difícil o complejo identificar y recuperar animales de las jaulas de las colonias para las sesiones de comportamiento. En la actualidad, existen pocos sistemas para recolectar datos de comportamiento individual de colonias (enriquecidas) que albergan 16,17,18.
Estos inconvenientes pueden afectar específicamente la investigación sobre los efectos conductuales de las lesiones cerebrales adquiridas. En primer lugar, está claro que la presencia y/o el sexo de los humanos, así como las prácticas de manipulación, afectan el comportamiento de los roedores 2,19, y estas variables pueden afectar diferencialmente el comportamiento de las ratas antes de frente a las ratas 2,19. después de un derrame cerebral. En segundo lugar, los resultados del comportamiento humano después de un accidente cerebrovascular pueden empeorar si disminuyen voluntariamente el compromiso con la dosis recomendada de ejercicios de rehabilitación20. Actualmente, los experimentos con roedores tienden a no modelar este tipo de contexto, porque las ratas no son libres de elegir participar o abstenerse de sesiones de comportamiento.
Este artículo presenta un protocolo diseñado para facilitar las pruebas de comportamiento individual en el marco del enjaulamiento en colonias enriquecidas. Este enfoque no solo aborda las limitaciones de las prácticas actuales, sino que también abre vías para la exploración de medidas innovadoras. Se ha desarrollado un torniquete para una rata (ORT) que se puede fijar a la jaula de una colonia, lo que permite a los animales entrar en las cámaras de comportamiento de forma independiente e iniciar sus propias sesiones de entrenamiento y pruebas. El sistema es asequible; cada ORT se puede ensamblar a bajo costo (dado acceso a una impresora 3D). En el pasado, la validación de este sistema se llevó a cabo utilizando una cámara operante básica, demostrando que los animales podían ser entrenados consistentemente para realizar una simple presión de palanca operante sin la presencia de un experimentador16. Sin embargo, la cuestión de si esta configuración es aplicable a otros escenarios sigue sin resolverse. El objetivo es validar la efectividad de la configuración de jaula de colonias ORT, que se estableció previamente, para entrenar y cuantificar el comportamiento de alcance hábil relevante para el deterioro motor después de un accidente cerebrovascular. La configuración se utilizó para generar nuevas variables que normalmente no se exploran en la investigación del ictus. Estas variables incluyen métricas de rendimiento para la tarea de alcance calificado y mediciones de autoiniciación, que podrían ser pertinentes para la motivación y la toma de decisiones. Además, se detectaron eficazmente los cambios inducidos por el accidente cerebrovascular en los patrones circadianos de autoinicio diario a lo largo de todo el período de 24 horas.
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Protocol
Todos los procedimientos y el cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Norte de Texas (IACUC) y se adhirieron a la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Las ratas Long-Evans macho y hembra adultas (400-800 g, 1,5 años de edad), utilizadas en el presente estudio, se alojaron en jaulas de colonia.
1. Preparación del equipo
- Obtenga o ensamble el torniquete de una rata (ORT) de acuerdo con los archivos de diseño y las instrucciones de construcción (consulte el Archivo Complementario 1 y el Archivo de codificación Suplementario 1). Consulte Butcher et al.16 para obtener más detalles.
NOTA: Las ORT son específicas para el tamaño de la rata, por lo que una jaula de colonia debe incluir animales que tengan aproximadamente el mismo tamaño. Si uno no desea autoensamblar los ORT, se pueden comprar preensamblados (ver Tabla de Materiales). - Obtener y conectar un lector de identificación por radiofrecuencia (RFID, ver Tabla de Materiales) y obtener e inyectar a los animales etiquetas RFID.
NOTA: Al inyectar etiquetas RFID full duplex (FDX), la orientación debe ser perpendicular a la antena RFID a medida que la rata camina a través del ORT. En esta validación, los papillos se implantaron por vía subcutánea entre el omóplato en un plano paralelo a la columna vertebral. - Fije la antena RFID al tubo del ORT.
- Construir y/o obtener el/los aparato(s) conductual(es) y la jaula de colonias apropiadas para la pregunta experimental. En este ejemplo, se utilizó una jaula de colonia21,22 hecha a medida junto con cámaras operantes disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales), aunque teóricamente se podría usar cualquier equipo.
NOTA: Se debe considerar la competencia de los animales alojados en colonias para acceder a los aparatos conductuales a través de la ORT. Anticipe la necesidad de un aparato de comportamiento ORT + por cada 4 a 6 animales. - Coloque la(s) ORT(s) entre el aparato conductual y la jaula de la colonia.
- Corta un agujero de portal en el aparato conductual y en la jaula de las colonias con una herramienta rotativa Dremel (consulta la Tabla de materiales) o un instrumento similar. El diámetro interno debe ser igual al diámetro exterior del túnel ORT construido.
NOTA: La ORT debe elevarse unas pulgadas para funcionar, por lo que se necesitará una pequeña plataforma o soporte para alinear las alturas de la jaula de la colonia y del aparato. - Instalar un sistema RFID para leer a los animales a su paso por la ORT y, si se desea, integrarlo con el aparato conductual.
2. Entrenamiento conductual prequirúrgico
- Obtenga una cohorte de ratas del mismo tamaño e introdúzcalas en la jaula de la colonia.
NOTA: Los animales que han sido criados o alojados extensamente en aislamiento o con pocos congéneres pueden tener más problemas para explorar la cámara, especialmente cuando implica atravesar áreas sociales de la jaula de la colonia. Los animales deben ser expuestos a jaulas grupales temprano en la vida para evitar este escollo. - Elimine el acceso a cualquier manipulanda dentro del aparato de comportamiento y configure la cámara para que entregue recompensas automáticamente cada 60 s, en promedio, cuando esté ocupada.
NOTA: Este estudio utilizó agua de sacarosa (30% a 40%) como recompensa, pero la leche condensada azucarada también es efectiva. - Entrene a todas las ratas para que ingresen regularmente a los aparatos conductuales a través de la ORT.
- Al menos una vez al día, verifique los datos para asegurarse de que todos los animales ingresen a la TRO. Si los animales no están entrando, inserte un objeto del tamaño de un bolígrafo en el mecanismo de bloqueo para evitar que se bloquee temporalmente y permitir que los animales exploren más libremente. Si los animales aún no ingresan, retire el torniquete y coloque una pared lateral temporal para permitir el acceso libre del túnel a la cámara.
- Una vez que todos los animales ingresen regularmente a la cámara, devuelva la cerradura (y el torniquete) y vuelva a evaluar.
NOTA: Los animales también pueden ocupar la ORT y la cámara como un respiro temporal de otras ratas. Una forma de evitar este tipo de monopolización de la cámara es conectar un ORT adicional que se conecte a una cámara de aislamiento simple. - Introduzca el manipulándum (el tirador, en este caso de ejemplo) y ajústelo a la sensibilidad más alta. Inserte el asa justo dentro de la caja (hasta 2 cm) o justo fuera de la caja.
NOTA: La cinta de pintor puede evocar intentos de alcance si se coloca en la parte posterior del mango, justo fuera de su alcance. - Reduzca la frecuencia con la que la recompensa (es decir, 30% de agua con sacarosa) se administra automáticamente (por ejemplo, cada 90-120 s). Recuerde que se puede utilizar cualquier recompensa que se adapte a las necesidades del experimentador y a las preferencias de los animales.
- Verifique los datos diariamente para asegurarse de que todos los animales hayan aprendido a activar la palanca. Ceba la palanca y/o cambie el nivel de inserción hasta que todos los animales estén tirando.
- Suspenda la entrega automática de recompensas para que solo estén disponibles a través de la activación de la manija de extracción.
- Si se ha insertado previamente, retraiga la palanca cada día (siempre que todas las ratas continúen tirando a ese nivel de retracción) de 0,25 mm a 0,5 mm hasta que la palanca esté en su posición final, de 1 cm a 1,25 cm fuera de la cámara.
NOTA: La posición exacta de la palanca depende del tamaño de las ratas. Asegúrese de elegir una posición que dé como resultado la topografía de alcance deseada. - Inicie un percentil u otro programa de entrenamiento para aumentar progresivamente las fuerzas de tracción requeridas para activar el mango.
NOTA: En este estudio se utilizó un programa de percentiles que establece el criterio de refuerzo en el cuartil superior de las 15 respuestas anteriores. Alternativamente, se pueden utilizar aumentos escalonados del criterio de atracción7. - Una vez que los animales alcancen de manera confiable el rango de criterio final de 120 g de tirones, retire el programa de entrenamiento de percentiles y fije el criterio para la activación del mango en una constante de 120 g.
- Recopile datos de referencia en este requisito de fuerza hasta que las tasas de éxito hayan sido estables (sin tendencia) durante aproximadamente una semana.
3. Inducción de un accidente cerebrovascular
- Inducir quirúrgicamente el accidente cerebrovascular en todos los animales enjaulados de la colonia al mismo tiempo.
NOTA: Para inducir el accidente cerebrovascular se utilizó un modelo endoteliano-1 de accidente cerebrovascular, que se ha descrito en otro lugar23. - Permita que los animales se recuperen en jaulas tradicionales, aislados individualmente, durante 3-7 días.
4. Pruebas conductuales postquirúrgicas
- Después de la recuperación, regrese a los animales a la jaula de la colonia con el aparato de alcance experto conectado a ORT.
- Realice la prueba de comportamiento, manteniendo los requisitos de tracción al final de 120 g (siga el paso 2) hasta que se recopilen datos suficientes para evaluar los déficits posteriores al accidente cerebrovascular (de uno a varios días).
- Implemente cualquier variable independiente relacionada con el accidente cerebrovascular o la recuperación durante los días posteriores mientras los animales acceden a la cámara.
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Representative Results
Los animales fueron entrenados y probados con cuatro ratas hembras en una jaula de colonia y cuatro ratas macho en una jaula de colonia separada. Todas las ratas aprendieron a pasar a través de las ORT en cuatro días o menos. Las cuatro ratas hembras alcanzaron un >85% de éxito en los combates con el requerimiento de fuerza de 120 g en aproximadamente 6 semanas de entrenamiento y las ratas macho alcanzaron el mismo criterio en 10 semanas (en comparación con aproximadamente 3 semanas con el entrenamiento estándar con ratas desfavorecidas)7. La duración de esta formación se alargó considerablemente debido a varios fallos de hardware y software que requirieron una solución continua de problemas, entre las semanas 2 y 6. Una vez que se abordaron estos problemas, la capacitación se desarrolló sin problemas, y se espera que los plazos de capacitación posteriores sean comparables a la literatura actual7. Las ratas macho también fueron entrenadas durante más tiempo para proporcionar más oportunidades para que una rata macho comenzara a tirar; Sin embargo, nunca lo hizo y fue excluido de más análisis y cirugía después de la semana 7. Una vez que el rendimiento de la rata se estabilizó en la línea de base, se obtuvieron 5 días de datos de referencia previos al accidente cerebrovascular para cada jaula. Los datos se limitaron a los días durante los cuales la ORT permaneció conectada a la jaula durante todo el día (algunos días requirieron desconexiones temporales relacionadas con la cría). Para la jaula de la hembra, los días basales fueron 7, 8, 9, 10 y 12 días antes del accidente cerebrovascular. Para los hombres, los días de referencia fueron 8, 9, 10, 11 y 13 días antes del accidente cerebrovascular.
Durante sus cirugías de inducción de accidente cerebrovascular, a los animales de esta validación se les implantaron simultáneamente electrodos conectados a chips receptores inalámbricos en su prosencéfalo basal (coordenadas -5,8 mm anterior/posterior, 0,7 mm medial/lateral izquierdo, 8,3 mm dorsal/ventral) o en su área tegmental ventral (coordenadas -2,3 mm anterior/posterior, 3,3 mm medial/lateral izquierdo, 7,0 mm dorsal/ventral). Estos implantes fueron utilizados en un experimento de recuperación posterior y no son relevantes para la validación de ORT en jaula de colonias reportada aquí. Los implantes fueron diseñados para que la piel pudiera cerrarse sobre ellos, con los chips receptores ubicados subcutáneamente debajo del brazo izquierdo.
Un animal hembra murió durante la inducción de un derrame cerebral. Otra hembra comenzó a declinar varios días después de la recuperación, sin haber tirado nunca de la manija después de un derrame cerebral. Después de su eutanasia, se descubrió que probablemente había experimentado una hemorragia cerebral en algún momento después de su accidente cerebrovascular. Estos dos animales se eliminaron por completo del conjunto de datos, incluida la evaluación previa al accidente cerebrovascular.
Después del golpe, los animales no reiniciaron inmediatamente el tirón regular de la palanca, aunque continuaron ingresando a la cámara a través de la ORT y tuvieron que ser alentados a través de sesiones cortas de modelado manual (es decir, reducción de la distancia de la palanca y recompensas entregadas supeditadas a acercarse o intentar tirar de la palanca). Las ratas hembras no tiraron durante los días 4-7 después del accidente cerebrovascular y, por lo tanto, se les administró un cebo de palanca suplementario (es decir, un poco de mantequilla de maní en la palanca) y un moldeado manual en los días 8-11. Comenzaron a tirar de forma autónoma el día 11. A los machos se les permitió recuperarse hasta el día 6 en función de la experiencia previa con las hembras. No tiraron durante el día 6 después del derrame cerebral. Se les administró cebo suplementario el día 7. Comenzaron a tirar de forma autónoma aloctavo día después del accidente cerebrovascular. Una vez que los animales volvieron a entrar en contacto con el refuerzo para los intentos de tracción, se cesó el cebo o modelado suplementario y se recopilaron datos posteriores al accidente cerebrovascular. Los machos no tiraron lo suficiente el día 8 para un análisis completo de las variables dependientes más complejas (medidas circadianas y pausa posterior a la pelea), por lo que se les permitió seguir tirando el9º,10º y11º día bajo el mismo criterio. Losdías 8, 10 y 11 fueron días completos. El primer día de extracción después del accidente cerebrovascular se utilizó para todos los análisis, excepto el análisis circadiano y el análisis de las pausas entre combates; Para este análisis se utilizó el día para las hembras y los tres días completos para los machos. Para el análisis posterior al accidente cerebrovascular, las dos ratas hembras proporcionaron 55 y 844 tirones en un día, y las tres ratas macho proporcionaron 536, 153 y 190 tirones en tres días.
Los datos se organizaron de acuerdo con tirones y combates. Para evitar el registro de temblores derivados del propio equipo, los tirones se midieron utilizando un umbral de 5 g con una histéresis de +/- 1 g. Se registró un tirón cuando el animal ejerció una presión superior a 6 g y se detuvo cuando el mango registró una fuerza inferior a 4 g. Los animales tendían a tirar en episodios de varios tirones rápidos. Una vez que cada tirón alcanzaba los 120 g, se entregaba el refuerzo. Un combate se consideraba un grupo de tirones cuyos picos estaban todos separados por menos de 1 s. Este umbral se seleccionó sobre la base de datos previos, que indicaban que se desarrollaba naturalmente un grupo de intervalos entre picos de menos de 1 s, y otros intervalos entre picos eran mucho más largos. Por lo general, las ratas tiraban muchas veces seguidas antes de visitar el comedero, incluso cuando los tirones anteriores en el episodio activaban el comedero.
Se analizaron un total de 7 variables dependientes. Se realizó una prueba t pareada entre los promedios basales y las medidas posteriores al accidente cerebrovascular, que se informan en la Figura 1, Figura 2 y Figura 3. Estas cifras también muestran datos de animales individuales para proporcionar una impresión de la variación a lo largo de los días y entre los individuos para cada medida que podría esperarse.
La Figura 1 muestra el rendimiento antes y después del accidente cerebrovascular a lo largo de varias medidas de rendimiento típicas de las evaluaciones de alcance calificado 7,8,10. Todos los datos posteriores al accidente cerebrovascular se agregaron en un solo punto de datos, incluso si se necesitaron varios días para recopilar suficientes ensayos. El protocolo y el sistema automatizado autoiniciado evaluaron con éxito la tasa de éxito por combate, la fuerza media por tirón y los tirones por combate, que mostraron una sensibilidad al golpe con diversos grados de significación estadística.
La Figura 2 muestra dos variables novedosas que surgen de la configuración de la ORT en jaulas de colonias: los inicios de sesión y la duración acumulada de la sesión. Sorprendentemente, el accidente cerebrovascular no afectó a los inicios de las sesiones. Las mujeres iniciaron sesiones de manera confiable más que los hombres tanto antes como después del accidente cerebrovascular, sin embargo, ninguno cambió su tasa después del accidente cerebrovascular. Por el contrario, la duración de las ratas en la cámara aumentó, tal vez debido a la disminución de la tasa de éxito de los combates (cuyo resultado es una disminución de las recompensas)
El inicio de la sesión (que representa una elección entre el enriquecimiento y las recompensas sociales disponibles en la jaula de la colonia y el refuerzo alimenticio) y la duración del tiempo en la cámara (en el caso de una preferencia de lugar condicionada con el valor de la recompensa) también podrían tomarse como índices de motivación 24,25,26,27. Se incluyeron medidas adicionales basadas en la motivación, como el "esfuerzo" cuantificado por tirones por sesión en el minuto28 y las pausas entre episodios29, que se pueden ver en la Figura 3. Estas variables se vieron afectadas por el accidente cerebrovascular. Como se anticipó, el número de tirones por minuto de sesión disminuyó y la duración de las pausas entre combates aumentó. Sin embargo, los cambios en esta última medida fueron complejos. La distribución de las pausas de los combates pareció volverse más caótica, incluyendo pausas más largas, algunas pausas muy largas y también más pausas cortas. Esto puede indicar una avería en la unidad motora original calificada; Si es así, podría ser un índice fácilmente medible de la misma.
A pesar del pequeño tamaño del grupo, se llevó a cabo una investigación para determinar si alguna de las variables medidas presentaba correlaciones con la tasa de éxito, lo que podría implicar su significación funcional. Se realizaron pruebas de Shapiro Wilk para evaluar distribuciones equitativas de los datos para las variables tasa de éxito, tirón pico medio, combate por minuto, duración acumulada de la sesión, pausas entre combates y tirones por combate. La prueba de Shapiro Wilk indicó que la distribución de algunas variables se alejó significativamente de la normalidad. Por lo tanto, se realizaron correlaciones de orden de rango de Spearman para determinar la relación entre la tasa de éxito antes o después del accidente cerebrovascular y las siguientes variables: pico medio, tirón por minuto, duración acumulada de la sesión, pausas entre episodios y tirones por combate. Ninguna variable antes de la carrera, aparte de la fuerza de tracción media, se correlacionó significativamente con la tasa de éxito (ver Tabla 1). Después del accidente cerebrovascular, la mayoría de las variables tampoco mostraron una correlación significativa con la tasa de éxito, excepto la fuerza de tracción media (Tabla 1).
Por último, la ORT permite un análisis no solo del comportamiento motor experto, sino también del patrón circadiano. En la Figura 4 se muestra la proporción de cada hora por cada jaula en la que se ocupó la TRO, presentada como promedio durante los días basales y posteriores al accidente cerebrovascular. La línea azul de la figura indica un recuento promedio del número de entradas por hora realizadas a lo largo del día. Antes del accidente cerebrovascular, los animales se involucraban en la tarea de alcance hábil a niveles altos por la mañana, disminuyendo sus duraciones a lo largo del día. Unas horas antes de que se encendieran las luces, el compromiso volvió a aumentar (hembras) o aumentó muy ligeramente (machos) antes de interrumpirse poco después de que se encendieran las luces. Esta distribución circadiana bimodal cambió por completo después de un accidente cerebrovascular. Los animales se involucraban menos por las mañanas, y su tiempo en la cámara alcanzaba su punto máximo más tarde en el día. Este patrón puede ser un reflejo de las alteraciones generales del sueño y circadianas que se observan a menudo después de un accidente cerebrovascular 30,31,32,33.
Figura 1: Medición de los cambios típicos en el rendimiento en el alcance hábil después de la carrera utilizando el procedimiento ORT. Se midió el rendimiento del alcance hábil antes y después del accidente cerebrovascular. Los promedios diarios por animal para la tasa de éxito por combate, la fuerza media por tirón y el número de tirones por combate se muestran durante 5 días de referencia y un día después del accidente cerebrovascular (izquierda) y entre un promedio de la línea de base y un día después del accidente cerebrovascular (después del accidente cerebrovascular) con pruebas t emparejadas informadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los diferentes parámetros de sesión autoiniciada muestran diferentes tendencias a cambiar después de un accidente cerebrovascular. Las medidas de auto-iniciación para las sesiones de comportamiento de alcance hábil antes y después del accidente cerebrovascular fueron posibles gracias al procedimiento ORT. Los promedios diarios por animal para los inicios de sesión y las duraciones acumuladas de las sesiones diarias se muestran durante 5 días desde el inicio y un día después del accidente cerebrovascular (izquierda) y entre un promedio desde el inicio y un día después del accidente cerebrovascular (después del accidente cerebrovascular) con pruebas t emparejadas informadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las variables relacionadas con la motivación cambian después de un accidente cerebrovascular. Se determinaron las medidas de rendimiento de las sesiones de comportamiento de alcance hábil antes y después del accidente cerebrovascular relacionadas con la motivación. Los promedios diarios por animal para la duración de la pausa entre sesiones y la tasa diaria de sesiones por minuto de sesión se muestran durante 5 días de referencia y un día después del accidente cerebrovascular (izquierda) y entre un promedio de referencia y un día después del accidente cerebrovascular (después del accidente cerebrovascular) con pruebas t emparejadas informadas. Las pausas entre episodios cambiaron en términos de estos promedios diarios, pero aún más sorprendentemente, la distribución de las duraciones de las pausas individuales después de un golpe también cambió en ambos lados del promedio. Las longitudes de pausa individuales se agrupan para todos los animales y se muestran como distribuciones en un eje logarítmico (extremo derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cambios en el patrón circadiano de las sesiones autoiniciadas después de un accidente cerebrovascular. Se determinaron las medidas de los patrones circadianos de las sesiones de comportamiento de alcance hábil autoiniciadas antes (izquierda) y después (derecha) del accidente cerebrovascular para todos los animales, hembras y machos. Estos datos incluyen todas las entradas y todos los tiempos de ocupación de la cámara por jaula, promediados entre los días previos y posteriores al accidente cerebrovascular. A continuación, se promedian de nuevo las dos jaulas para mostrar las distribuciones totales (fila superior). Los patrones previos al accidente cerebrovascular incluían un alto compromiso por la mañana, que disminuía a lo largo del período de vigilia con un nuevo pico justo antes de la fase de sueño. Los patrones posteriores al accidente cerebrovascular muestran que la duración de las sesiones aumenta a lo largo del día y alcanza su punto máximo antes de la fase de sueño. Las ratas estaban en ciclos de luz inversos en su habitación. El período de encendido de las luces se muestra sombreado en gris para indicar el período normal de inactividad de la rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Correlaciones | ||||||
| Variables | Variable de comparación | Spearman | ||||
| n | Antes de Stroke rs | p | Después de la carrera rs | p | ||
| Fuerza de tracción media | Tasa de éxito | 5 | 1 | <0,001 | -0.975 | 0.005 |
| Tirón de Combate por Minuto | Tasa de éxito | 5 | 0.3 | 0.624 | -0.154 | 0.805 |
| Duración acumulada de la sesión | Tasa de éxito | 5 | -0.1 | 0.873 | 0.564 | 0.322 |
| Pausas entre combates | Tasa de éxito | 5 | -0.6 | 0.285 | 0.205 | 0.741 |
| Tirones por combate | Tasa de éxito | 5 | 0.1 | 0.873 | -0.821 | 0.089 |
Tabla 1: Coeficientes de correlación de Spearman entre variables. Se realizaron correlaciones de orden de rango de Spearman para determinar la relación entre la tasa de éxito antes o después del accidente cerebrovascular y se determinaron las siguientes variables: pico medio, tirón por minuto, duración acumulada de la sesión, pausas entre episodios y tirones por combate. Antes de la correlación, se realizaron pruebas de Shapiro Wilk para evaluar la tasa de éxito de todas las variables de la prueba, e indicaron que algunas variables se alejaban significativamente de la normalidad. Ninguna variable antes de la carrera, aparte de la fuerza de tracción media, se correlacionó significativamente con la tasa de éxito. Esta tabla muestra los resultados de los coeficientes de correlación de Spearman (ρ) evaluados si había una relación entre la tasa de éxito y cinco variables de la prueba.
Archivo complementario 1: Pasos para la construcción de la ORT. Instrucciones para imprimir y construir un "torniquete de una rata". En las instrucciones se incluye una lista de todos los materiales necesarios, así como instrucciones paso a paso (con imágenes). El archivo también incluye instrucciones para conectar un microinterruptor para registrar entradas y salidas, así como el cableado y la programación para conectar un lector RFID. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Fichero de codificación suplementario 1: Esto incluye todos los componentes necesarios para imprimir en 3D el "torniquete de una rata". Este archivo se puede utilizar directamente o se puede acceder a él siguiendo las instrucciones del Archivo Complementario 1. Todos los componentes de este archivo deben escalarse utilizando la pieza de "regla" que se incluye (consulte el Archivo complementario 1 para obtener más detalles). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este protocolo tiene múltiples usos. En primer lugar, y en términos más generales, la ORT se desarrolló con el propósito de permitir el entrenamiento conductual automatizado de un solo sujeto y la recopilación de datos en el contexto de la vivienda social enriquecida. Si bien este estudio probó la idea de recopilar medidas conductuales típicas y elaborarlas en el contexto del accidente cerebrovascular, se puede hacer lo mismo con otras aplicaciones y tareas conductuales. Incluso las medidas recogidas en esta validación también se pueden ajustar según sea necesario para incluir programas de refuerzo alternativos, comportamientos alternativos, etc. En segundo lugar, este estudio evaluó la capacidad del sistema para recopilar datos relacionados con el deterioro del alcance hábil después de un accidente cerebrovascular. El protocolo actual ha sido validado previamente para la enseñanza y medición del prensado básico de palanca16. Los datos actuales muestran que es un enfoque válido para recopilar datos sobre los déficits motores relacionados con el accidente cerebrovascular, y que son posibles medidas típicas de las evaluaciones tradicionales de alcance de habilidades, así como medidas novedosas. Mientras se solucionaban los problemas del sistema ORT de las jaulas de las colonias, una gran pregunta era si los animales iniciarían sesiones de comportamiento por sí mismos con suficiente frecuencia, y si lo harían en varios contextos experimentales, particularmente después de un accidente cerebrovascular. Se descubrió que se puede alentar a todos o casi todos los animales a participar lo suficiente en procedimientos operantes simples y ahora en las pruebas de comportamiento posteriores al accidente cerebrovascular. Los períodos posteriores al accidente cerebrovascular requirieron un poco de modelado manual, pero los animales volvieron rápidamente a participar en la tarea conductual sin la presencia del experimentador.
Durante la resolución de problemas, se descubrieron varios puntos de procedimiento que aumentan la probabilidad de éxito, y estos se han integrado en el protocolo. Estos incluían la necesidad de escalar la ORT de acuerdo con el tamaño de la rata y asegurar que los animales tuvieran un tamaño similar y se criaran en un contexto social. Además, se descubrió que una sola ORT es la más efectiva para acomodar de 4 a 6 ratas debido a la alta competencia potencial por la cámara. Vale la pena señalar que esta competencia no parece inducir un mayor estrés en comparación con los métodos tradicionales; Un experimento previo registró niveles reducidos de cortisol en la configuración de jaulas de colonias en comparación conlas pruebas de comportamiento tradicionales. Además, se descubrió que, para los animales tímidos, quitar el torniquete o dejarlo abierto durante la fase de entrenamiento inicial ayuda a permitir que varias ratas exploren la cámara juntas.
Aunque este enfoque es eficaz para evaluar los déficits motores posteriores a un accidente cerebrovascular, es esencial reconocer algunas limitaciones. En primer lugar, es posible que los animales después de un accidente cerebrovascular no reinicien inmediatamente el tirón y requieran algunas sesiones de modelado manual y/o cebo. Con este y otros enfoques específicos, la automatización completa de la capacitación y las pruebas puede ser más difícil. Sin embargo, esta no es una limitación exclusiva de la configuración de la jaula de la colonia de ORT, y los animales en sesiones de comportamiento iniciadas por el experimentador a menudo tienen el mismo problema.
Otra limitación es la posibilidad de que las cámaras se utilicen para fines distintos de los previstos. Como anécdota, se observaron varios casos en los que los animales entraron en las cámaras conductuales y pasaron una cantidad significativa de tiempo en el interior sin participar activamente en la tarea conductual. Esto sucedía ocasionalmente con todos los animales, pero especialmente con los machos. Esto puede haber sido simplemente porque la ORT proporcionaba un poco de privacidad a los animales cuando no deseaban participar socialmente. Dicho esto, agregar habitaciones "solas" a la jaula de la colonia usando otros ORT mitiga este problema.
También se observó que los animales ocasionalmente se detenían en el túnel con la ORT entreabierta y permanecían allí por períodos de tiempo. Esta es la razón por la que es mejor tener el lector RFID cerca de la cámara de comportamiento para que el animal no quede registrado hasta que ingresa por completo. Se podría especular que permanecer en la ORT es agradable de la misma manera que un conducto de apretamiento. En cualquier caso, los animales no permanecen allí de manera que impidan la recopilación de datos, especialmente cuando se dispone de cámaras de aislamiento alternativas conectadas a la ORT.
Otra limitación es que la sesión autoiniciada puede ser más difícil para igualar el tiempo de la sesión conductual o las oportunidades de respuesta conductual entre los individuos en grupos. Esta limitación puede ser especialmente relevante para los estudios relacionados con el ictus, dada la relación entre el tiempo de entrenamiento acumulado y la recuperación. Sin embargo, esta limitación puede abordarse, al menos parcialmente. Si un experimento lo requiere, es posible programar muchos aparatos conductuales para terminar las sesiones cuando se alcanza una duración objetivo o un número objetivo de respuestas (es decir, mediante la terminación de las recompensas o la retracción del manipulando). Esta solución no aborda ninguna tendencia de las personas a no alcanzar sus objetivos. Pero, de nuevo, esa limitación no es exclusiva de esta configuración.
Esta configuración también tiene la ventaja de que el entrenamiento conductual o la exposición pueden ocurrir durante todo el día en lugar de en unos pocos momentos restringidos. Esto podría ser útil en varios contextos; Específicamente en el accidente cerebrovascular, podría utilizarse para investigar el efecto de la dosis de los enfoques de rehabilitación conductual.
Finalmente, es probable que la ORT no se pueda usar para procedimientos aversivos como la derrota social, la natación forzada, el miedo condicionado, etc. La ORT requiere que el paradigma conductual sea apetitivo; De lo contrario, es probable que los animales simplemente eviten las cámaras de comportamiento.
A pesar de las limitaciones, este procedimiento añade ventajas significativas a los paradigmas de comportamiento actualmente disponibles para las ratas. En primer lugar, la configuración permite la recopilación continua de datos de alto rendimiento al tiempo que libera tiempo del experimentador. Si bien es importante monitorear continuamente el equipo y los animales, los experimentadores necesitan estar presentes solo por períodos cortos de tiempo a lo largo del día. Realizar sesiones de comportamiento para 8 animales habría requerido de 4 a 10 horas de sesiones diarias utilizando el enfoque tradicional. El enfoque de jaulas de colonias ORT no solo reduce ese tiempo a prácticamente cero (suponiendo que el aparato funcione y esté automatizado), sino que también permite la recopilación de datos durante los fines de semana con poca necesidad de presencia adicional; Esta disponibilidad continua de actividades conductuales durante los fines de semana también aumenta el enriquecimiento total disponible para los animales.
El protocolo de jaulas de colonias ORT proporciona ventajas en los datos, así como ventajas logísticas. Hay muchas variables dependientes disponibles que tradicionalmente no son posibles, como el ritmo, la duración u otros parámetros de las sesiones autoiniciadas, como las que se exploran aquí. Las variables circadianas a menudo se miden utilizando ruedas para correr; Sin embargo, este protocolo permite observar los patrones, así como los parámetros de elección en otros tipos de comportamiento. La ORT podría incluso usarse para conectar jaulas de colonias y proporcionar acceso visual u olfativo al sexo opuesto, lo que permite no solo evaluar la motivación, sino también el patrón circadiano de búsqueda de pareja. Este estudio ha caracterizado varias variables dependientes nuevas que podrían ser útiles en la investigación del accidente cerebrovascular, incluidas las variables circadianas y las variables relacionadas con la iniciación que pueden ayudar a explorar preguntas traslacionales relacionadas con o en el contexto de la pérdida de motivación y la depresión que pueden ocurrir después del accidente cerebrovascular34,35. Aunque no se abordan aquí, otras variables importantes relevantes para el ictus, como los análisis cualitativos de la cinemática de alcance, también deberían ser fácilmente abordables con este protocolo de jaula de colonias ORT a través de cámaras activadas por movimiento.
Finalmente, una ventaja significativa de este protocolo es su capacidad para permitir que los animales permanezcan en entornos grandes, enriquecidos y sociales durante la mayor parte de sus vidas. Los avances en el bienestar animal son importantes en los laboratorios básicos, no solo por razones éticas, sino también por razones científicas. Los animales que pueden moverse y socializar deberían servir como mejores modelos para los estados de enfermedad que no implican naturalmente restricción o privación. Además, la naturaleza autosuficiente de las sesiones de comportamiento en este protocolo significa que los humanos no necesitan estar presentes mientras se recopilan los datos de comportamiento. La presencia de humanos en un laboratorio puede afectar los datos de comportamiento, a veces de manera diferencial dependiendo del humano en cuestión, qué tan bien están entrenados y cómo manejan a los animales 2,19. Estos impactos incontrolados y variables en los datos se pueden minimizar con el protocolo actual.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación Beatrice H. Barrett para la investigación de las relaciones neurooperantes de la Universidad del Norte de Texas (UNT). Agradecemos el aporte y la asistencia de todos los miembros del Laboratorio de Neuroplasticidad y Reparación, especialmente a Valerie Rojas, Mary Kate Moore, Cameron Scallon y Hannah McGee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Consult with local makerspace | ||
| bolt | Boltdepot | 1346 | 6-32 or 8-32 by 0.5" |
| bolt | Boltdepot | 1348 | 6-32 or 8-32 by 0.75" |
| door hinge | XJS (Amazon) | 43398-16234 | 1" cabinet stainless steel door hinge set; Optional (if "perfect hinge" is not printed) |
| drill | Any electric drill works | ||
| extension spring | Nieko (Amazon) | 50456A | Choose and adjust spring based on ORT sized and desired tension |
| granulated sugar | |||
| lock nuts | Boltdepot | 2551 | 6-32 or 8-32 |
| measuring tape | |||
| microcontroller | Arduino | A000066 | Arduino Uno |
| microswitch | Sparkfun | KW4-Z5F | mini microswitch (SPDT-roller lever) |
| One Rat Turnstile (ORT) | Vulintus | Contact company to request quote if not self-assembling | |
| Operant Chambers as desired for behavioral assessment: For this experiment we used automated isometric pull chambers from Vulintus | Vulintus | No cat #: contact Vulintus | Contact Vulintus for quote |
| PLA filament | OVERTURE (Amazon) | UK-MATTEPLA17511 | |
| plexiglass | Lesnlok (Amazon) | B09P74K7BR | clear, 1/8" thickness, Cut to size |
| plexiglass cutter | |||
| python program | Python Software Foundation | software available on request | |
| RFID reader | Priority 1 Design | RFIDRW-E-USB | With antenna |
| RFID tag | Unified Information Devices | UC-1485-10 | |
| rod | Boltdepot | 23632 | cut to > 3.5" |
| Rotary tool | Used to bore hole in apparatus and colony caging for ORT; any hardware usable | ||
| sand paper | HSYMQ (Amazon) | TOMPOL-1118-1915-11 | |
| socket wrench set | Any socket wrench set works | ||
| soldering iron | |||
| super glue | 234790 | ||
| wire | Plusivo (Amazon) | EAN0721248989789 |
References
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