Summary
Представлена система получения данных о самоинициируемых индивидуальных поведенческих сессиях в условиях социальной клетки. Эффективность этой системы демонстрируется с помощью автоматизированной квалифицированной оценки охвата, позволяющей охарактеризовать двигательные нарушения после инсульта, потенциальные поведенческие изменения, связанные с мотивацией, циркадные вариации и другие инновационные зависимые переменные.
Abstract
Поведенческое тестирование на крысовых моделях часто используется для различных целей, включая психологические, биомедицинские и поведенческие исследования. Многие традиционные подходы включают в себя индивидуальные сеансы тестирования один на один между одним исследователем и каждым животным в эксперименте. Эта установка может занять очень много времени для исследователя, и их присутствие может повлиять на поведенческие данные нежелательным образом. Кроме того, традиционное содержание в клетке для исследований на крысах требует отсутствия обогащения, упражнений и социализации, которые обычно типичны для вида, и этот контекст также может исказить результаты поведенческих данных. Преодоление этих ограничений может быть целесообразным для нескольких исследовательских приложений, включая изучение приобретенных повреждений головного мозга. Здесь представлен пример метода автоматического обучения и тестирования индивидуального поведения крыс в клетке колонии без присутствия человека. Радиочастотная идентификация может быть использована для адаптации сеансов к конкретной крысе. Валидация этой системы произошла в контексте измерения моторики передних конечностей до и после инсульта. Измеряются традиционные характеристики постинсультных поведенческих нарушений и новые показатели, доступные с помощью системы, включая частоту успеха, различные аспекты силы тяги, анализ схватки, частоту и модели инициации, продолжительность сеанса и циркадные паттерны. Эти переменные могут собираться автоматически с небольшими ограничениями; Несмотря на то, что аппарат устраняет экспериментальный контроль над воздействием, временем и практикой, валидация обеспечила разумную согласованность этих переменных от животного к животному.
Introduction
Поведенческое обучение и тестирование на крысовых моделях важны в бесчисленных областях исследований, от изучения когнитивных процессов до болезненных состоянийи многого другого. Как правило, это обучение и тестирование проводится с отдельными животными в индивидуальных занятиях, при этом исследователь вручную извлекает животное из домашней клетки и временно помещает его в какой-либо аппарат. К сожалению, в этом подходе есть несколько трудностей и ограничений. Во-первых, поведенческое тестирование может занять много времени у исследователей, а когда требуется обучение, это время становится еще больше. Во-вторых, этот подход автоматически влияет на полученные данные или даже потенциально искажает их, как было установлено в другом месте2. Эти путаницы особенно заметны при рассмотрении переменных, связанных с обогащением. В частности, лабораторные крысы традиционно содержатся в небольших клетках, которые достаточно велики для одной или двух крыс, и если не предоставить беговые колеса, они могут всю жизнь не иметь значимых возможностей для физических упражнений. Кроме того, изолированное жилье может быть основным источником стресса у социальных видов, таких как крысы4. Некоторые из этих недостатков, связанных с благополучием, вероятно, влияют на физиологию крыс 5,6, что может предвосхитить развитие типичного для вида поведенческоговыражения4 и повлиять на качество моделей грызунов применительно к человеческому контексту.
В последние годы исследователи искали несколько типов решений этих проблем. Простейшим решением было автоматизировать поведенческое тестирование и обучение 7,8,9,10, тем самым устранив необходимость одного исследователя заниматься одним животным. Дополнительным решением является автоматизация перемещения животных в экспериментальные камеры11,12, что еще больше устраняет необходимость участия человека. Наконец, было исследовано несколько установок, которые позволяют размещать животных в клетках колонии с другими животными и с большим пространством для исследования иобогащения. Несмотря на эти преимущества, такие колонии могут ограничить или усложнить усилия по сбору индивидуально дифференцированных поведенческих данных (хотя см. усилия по использованию компьютерного зрения)14,15. Если требуются индивидуальные поведенческие данные, может быть сложнее или сложнее идентифицировать и извлекать животных из клеток колонии для поведенческих сеансов. В настоящее время существует несколько систем для сбора индивидуальных поведенческих данных из (обогащенных) колоний, в которых содержится 16,17,18.
Эти недостатки могут конкретно повлиять на исследования поведенческих эффектов приобретенной черепно-мозговой травмы. Во-первых, ясно, что присутствие и/или пол людей, а также методы обращения с ними влияют на поведение грызунов 2,19, и эти переменные могут по-разному влиять на поведение крыс до и до 2000 года. после инсульта. Во-вторых, поведенческие результаты человека после инсульта могут ухудшиться из-за добровольного снижения вовлеченности в рекомендуемую дозировку реабилитационныхупражнений. В настоящее время эксперименты на грызунах, как правило, не моделируют такой контекст, потому что крысы не свободны в выборе участия или воздержания от поведенческих сеансов.
В этой статье представлен протокол, предназначенный для облегчения индивидуального поведенческого тестирования в рамках обогащенной клетки колоний. Этот подход не только устраняет ограничения, связанные с нынешней практикой, но и открывает возможности для изучения новаторских мер. Был разработан турникет для одной крысы (ОРТ), который может быть прикреплен к клетке колонии, что позволяет животным самостоятельно входить в поведенческие камеры и инициировать свои собственные сеансы обучения и тестирования. Система доступна по цене; каждый ОРТ может быть собран с небольшими затратами (при наличии доступа к 3D-принтеру). В прошлом валидация этой системы проводилась с использованием базовой оперантной камеры, показывая, что животных можно последовательно обучать выполнять простое оперантное нажатие рычага без присутствия экспериментатора16. Тем не менее, вопрос о том, применима ли эта конфигурация к другим сценариям, остается нерешенным. Цель состоит в том, чтобы подтвердить эффективность ранее созданной системы ORT-colony для обучения и количественной оценки квалифицированного поведения, связанного с двигательными нарушениями после инсульта. Конфигурация была использована для создания новых переменных, которые обычно не изучаются в исследованиях инсульта. Эти переменные включают в себя показатели эффективности для задачи по охвату квалифицированных специалистов и измерения самоинициации, которые могут иметь отношение к мотивации и принятию решений. Кроме того, были эффективно обнаружены индуцированные инсультом изменения в циркадных паттернах ежедневной самоинициации в течение всего 24-часового периода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры и уход за животными были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Северного Техаса и соответствовали руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Взрослые самцы и самки крыс породы Лонг-Эванс (400-800 г, 1,5 года), использованные в настоящем исследовании, содержались в клетке колонии.
1. Подготовка оборудования
- Приобретите или соберите однокрысовый турникет (ОРТ) в соответствии с проектными файлами и инструкциями по изготовлению (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный кодировочный файл 1). Более подробную информацию см. в Butcher et al.16 .
ПРИМЕЧАНИЕ: ОРТ специфичны для размера крысы, поэтому в клетке колонии должны быть животные, которые примерно такого же размера. Если вы не хотите самостоятельно собирать ОРТ, их можно приобрести в предварительно собранном виде (см. Таблицу материалов). - Получите и прикрепите считыватель радиочастотной идентификации (RFID, см. Таблицу материалов), а также получите и введите животным RFID-метки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При введении полнодуплексных (FDX) RFID-меток ориентация должна быть перпендикулярна RFID-антенне, когда крыса проходит через ОРТ. В этой валидации метки имплантировались подкожно между лопатками в плоскости, параллельной позвоночнику. - Прикрепите RFID-антенну к трубке ОРТ.
- Сконструируйте и/или получите поведенческий аппарат (аппараты) и клетки колоний, подходящие для экспериментального вопроса. В этом примере была использована специально построенная колония 21,22 в сочетании с коммерчески доступными оперантными камерами (см. Таблицу материалов), хотя теоретически можно было использовать любое оборудование.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует учитывать конкуренцию животных, содержащихся в колониях, за доступ к поведенческому аппарату (аппаратам) через ОРТ. Ожидайте, что потребуется один ОРТ + поведенческий аппарат на каждые 4-6 животных. - Прикрепите ОРТ (ОРТ) между поведенческим аппаратом и клеткой колонии.
- Прорежьте портальное отверстие в поведенческом аппарате и клетке колонии с помощью вращающегося инструмента Dremel (см. Таблицу материалов) или аналогичного инструмента. Внутренний диаметр должен быть равен внешнему диаметру построенного тоннеля ОРТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: ОРТ должен быть поднят на несколько дюймов для работы, поэтому потребуется небольшая платформа или подставка, чтобы выровнять клетки колонии и высоту аппарата. - Установите RFID-систему для считывания показаний животных при прохождении через ОРТ и, при желании, интегрируйте ее с поведенческим аппаратом.
2. Предоперационная поведенческая подготовка
- Получить когорту крыс одинакового размера и ввести их в клетку колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которые были выращены или содержались в изоляции или с небольшим количеством сородичей, могут иметь больше проблем с исследованием камеры, особенно когда это связано с пересечением социальных зон клетки колонии. Животные должны подвергаться групповому содержанию в клетках в раннем возрасте, чтобы избежать этой ловушки. - Уберите доступ ко всем манипуляторам в поведенческом аппарате и настройте камеру на автоматическую выдачу наград в среднем каждые 60 с, когда она занята.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в качестве вознаграждения использовалась сахарозная вода (от 30% до 40%), но подслащенное сгущенное молоко также эффективно. - Обучить всех крыс регулярно входить в поведенческий аппарат (аппараты) через ОРТ.
- Не реже одного раза в день проверяйте данные, чтобы убедиться, что все животные входят в ПРТ. Если животные не входят, вставьте объект размером с загон в механизм блокировки, чтобы предотвратить его блокировку и временно позволить животным исследовать его более свободно. Если животные по-прежнему не заходят, снимите турникет и прикрепите временную боковую стенку, чтобы обеспечить свободный доступ к камере через туннель.
- Как только все животные будут регулярно входить в камеру, верните замок (и турникет) и проведите повторную оценку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные также могут занимать ОРТ и камеру в качестве временной передышки от других крыс. Один из способов предотвратить такого рода монополизацию камеры — прикрепить дополнительный ОРТ, который соединяется с простой изоляционной камерой. - Введите манипуландум — в данном примере ручку — и установите максимальную чувствительность. Вставьте ручку внутрь коробки (до 2 см) или снаружи коробки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Малярная лента может вызвать попытки досягаемости, если она прикреплена к задней части ручки, просто вне досягаемости. - Уменьшите частоту, с которой вознаграждение (например, 30% сахарозной воды) доставляется автоматически (например, каждые 90-120 с). Помните, что можно использовать любое вознаграждение, которое соответствует потребностям экспериментатора и предпочтениям животных.
- Ежедневно проверяйте данные, чтобы убедиться, что все животные научились активировать рычаг. Наживите рычаг и/или измените уровень вставки, пока все животные не будут тянуть.
- Отключите автоматическую доставку наград, чтобы они были доступны только при активации ручки pull.
- Если он был вставлен ранее, отводите рычаг каждый день (при условии, что все крысы продолжают тянуть на этом уровне втягивания) на 0,25-0,5 мм, пока рычаг не окажется в своем конечном положении, на расстоянии от 1 см до 1,25 см от камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точное положение рычага зависит от размера крыс. Убедитесь, что выбрано положение, которое приводит к желаемой топографии достижения. - Инициируйте процентиль или другую программу тренировок, чтобы постепенно увеличивать необходимое тяговое усилие для активации рукоятки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался процентильный график, который устанавливает критерий подкрепления в верхнем квартиле предыдущих 15 ответов. В качестве альтернативы можно использовать ступенчатое увеличение критерия натяжения7. - Как только животные надежно достигнут конечного критериального диапазона тяг 120 g, удалите программу тренировки процентиля и зафиксируйте критерий активации ручки на постоянной 120 g.
- Собирайте исходные данные при этом требовании силы до тех пор, пока показатели успеха не станут стабильными (без тенденции) в течение примерно недели.
3. Индуцирование инсульта
- Хирургическим путем вызывает инсульт у всех животных в клетках колоний одновременно.
Примечание: Чтобы вызвать инсульт, использовали эндотелиан-1 модель инсульта, которая была описана в другом месте23. - Дайте животным восстановиться в традиционной клетке, изолированной индивидуально, в течение 3-7 дней.
4. Послеоперационное поведенческое тестирование
- После выздоровления верните животных в клетку колонии с помощью аппарата ОРТ, прикрепленного к квалифицированному досягаемому аппарату.
- Проводите поведенческое тестирование, сохраняя потребность в вытягивании на конечном уровне 120 г (выполните шаг 2) до тех пор, пока не будет собрано достаточно данных для оценки постинсультного дефицита (от одного до нескольких дней).
- Применяйте любые независимые переменные, связанные с инсультом или восстановлением, в течение последующих дней, пока животные получают доступ к камере.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Животные были обучены и протестированы с четырьмя самками крыс в одной клетке колонии и четырьмя самцами крыс в отдельной клетке колонии. Все крысы научились проходить через ОРТ за четыре дня или меньше. Четыре крысы-самки достигли >85% успешных схваток при требуемой силе 120 g примерно за 6 недель обучения, а крысы-самцы достигли того же критерия через 10 недель (по сравнению с примерно 3 неделями при стандартном обучении с крысами)7. Продолжительность обучения была значительно увеличена из-за нескольких аппаратных и программных сбоев, которые требовали постоянного устранения неполадок в период со 2 по 6 неделю. После устранения этих сбоев обучение прошло гладко, и ожидается, что последующие сроки обучения будут сопоставимы с текущими литературными 7. Самцов крыс также обучали дольше, чтобы дать больше возможностей одному самцу крысы начать тянуть; Однако он так и не сделал этого и был исключен из дальнейшего анализа и операции после 7-й недели. После того, как производительность крыс стабилизировалась на исходном уровне, для каждой клетки были получены исходные данные за 5 дней до инсульта. Данные были ограничены днями, в течение которых ПРТ оставался подключенным к клетке в течение всего дня (в некоторые дни требовались временные отключения, связанные с содержанием). Для женской клетки исходными днями были 7, 8, 9, 10 и 12 дней до инсульта. Для мужчин исходными днями были 8, 9, 10, 11 и 13 дней до инсульта.
Во время операций по индукции инсульта животным, участвовавшим в этой валидации, были одновременно имплантированы электроды, подключенные к беспроводным приемным чипам либо в базальном переднем мозге (координаты -5,8 мм спереди/сзади, 0,7 мм слева медиально/латерально, 8,3 мм дорсально/вентрально), либо в вентральной тегментальной области (координаты -2,3 мм спереди/сзади, 3,3 мм слева медиально/латерально, 7,0 мм дорсально/вентрально). Эти имплантаты предназначались для использования в последующем эксперименте по восстановлению и не имеют отношения к валидации ПРТ в клетке колонии, описанной здесь. Имплантаты были спроектированы таким образом, чтобы кожа могла быть закрыта поверх них, а принимающие чипы располагались подкожно под левой рукой.
Одна самка животного умерла во время индукции инсульта. Другая самка начала снижаться через несколько дней после выздоровления, ни разу не потянув за ручку после инсульта. После эвтаназии было обнаружено, что у нее, вероятно, произошло кровоизлияние в мозг через некоторое время после инсульта. Эти два животных были полностью исключены из набора данных, включая оценку до инсульта.
После инсульта животные не сразу возобновляли регулярное нажатие на рычаг, хотя они продолжали входить в камеру через ОРТ, и их нужно было поощрять короткими сеансами ручного формования (т.е. уменьшали расстояние до рычага и доставляли вознаграждение в зависимости от приближения или попытки натянуть рычаг). Самки крыс не тянули в течение 4-7 дней после удара, поэтому им давали дополнительную рычажную приманку (т.е. немного арахисового масла на рычаге) и ручную формовку на 8-11 день. Они начали тянуть автономно на 11-й день. Самцам было позволено восстановиться до 6-го дня на основе предыдущего опыта общения с самками. Они не тянули в течение 6-го дня после инсульта. На 7-й день им дали дополнительную приманку. Они начали автономно тянуть на8-й день после инсульта. Как только животные снова контактировали с подкреплением для попыток вытягивания, дополнительная приманка или формирование были прекращены, и были собраны данные после инсульта. Самцы не набирали достаточно сил на 8-й день для полного анализа более сложных зависимых переменных (циркадные измерения и паузы после схватки), поэтому им было разрешено продолжать тянуть на9-й,10-й и11-й день по тому же критерию. 8-й,10-й и11-й день были полными днями. Первый день подтягивания после инсульта использовался для всех анализов, кроме циркадного анализа и анализа пауз между схватками; Для этого анализа использовался один день для женщин и три полных дня для мужчин. Для анализа после инсульта две самки крыс сделали 55 и 844 рывка за один день, а три крысы-самца — 536, 153 и 190 за три дня.
Данные были организованы в соответствии с вытягиванием и схватками. Чтобы избежать регистрации толчков, возникающих от самого оборудования, растяжение измеряли с помощью порога 5 g с гистерезисом +/- 1 g. Тяга регистрировалась, когда животное оказывало давление выше 6 g, и останавливалось, когда рукоятка регистрировала усилие ниже 4 g. Животные, как правило, тянули в приступах по несколько быстрых рывков. Как только любое разовое натяжение достигало 120 g, доставлялось усиление. Схваткой считалось скопление тяг, пики которых разделяли менее 1 с. Этот порог был выбран на основе предыдущих данных, которые указывали на то, что кластер межпиковых интервалов менее 1 с развивался естественным образом, а другие межпиковые интервалы были достоверно намного длиннее. Крысы, как правило, тянули много раз подряд перед посещением кормушки, даже если более ранние тяги активировали кормушку.
Всего было проанализировано 7 зависимых переменных. Парный t-критерий был выполнен между исходными средними значениями и показателями после инсульта, которые представлены на рисунках 1, 2 и 3. Эти цифры также отображают данные по отдельным животным, чтобы дать представление о различиях между днями и между особями для каждого показателя, который можно было бы ожидать.
На рисунке 1 показаны показатели до и после инсульта по нескольким показателям эффективности, типичным для оценки уровня квалифицированного доступа 7,8,10. Все данные после инсульта были агрегированы в одну точку данных, даже если для сбора достаточного количества испытаний потребовалось несколько дней. Протокол и автоматизированная самоинициируемая система успешно оценивали частоту успеха за схватку, среднее усилие на тягу и тягу за схватку, которые показали чувствительность к инсульту с разной степенью статистической значимости.
На рисунке 2 изображены две новые переменные, возникающие в результате установки ПРТ в клетке колонии: инициация сеанса и совокупная продолжительность сеанса. Удивительно, но инсульт не повлиял на начало сеанса. Женщины достоверно начинали сеансы чаще, чем мужчины, как до, так и после инсульта, однако ни один из них не изменил свою частоту после инсульта. И наоборот, продолжительность пребывания в камере увеличилась для большинства крыс, возможно, из-за снижения процента успешных схваток (результатом чего является снижение уровня вознаграждения)
Инициация сеанса (представляющая собой выбор между обогащением и социальным вознаграждением, имеющимся в клетке колонии и подкреплением пищи) и продолжительность времени пребывания в камере (в случае условного предпочтения места со значением вознаграждения) также могут быть приняты в качестве индексов мотивации 24,25,26,27. Были включены дополнительные показатели, основанные на мотивации, такие как «усилие», количественно выраженное в подтягивании за сеанс на минуту28 и паузы между подходами29, которые можно увидеть на рисунке 3. На эти переменные повлиял инсульт. Как и предполагалось, количество тяг в минуту сеанса уменьшилось, а продолжительность пауз между схватками увеличилась. Однако изменения в последнем показателе были сложными. Распределение пауз в схватках, казалось, стало более хаотичным, включая больше длинных пауз, несколько очень длинных пауз, а также больше коротких пауз. Это может указывать на поломку оригинального квалифицированного моторного блока; если это так, то это может быть легко измеримым показателем того же самого.
Несмотря на небольшой размер группы, было проведено исследование, чтобы определить, демонстрируют ли какие-либо из измеренных переменных корреляцию с частотой успеха, потенциально подразумевая их функциональную значимость. Тесты Шапиро Уилка были проведены для оценки равного распределения данных по таким переменным, как частота успеха, среднее пиковое вытягивание, поединок в минуту, совокупная продолжительность сеанса, паузы между схватками и вытягивания за схватку. Тест Шапиро Уилка показал, что распределение некоторых переменных значительно отклоняется от нормы. Поэтому ранговые корреляции Спирмена были выполнены для определения взаимосвязи между частотой успеха до или после инсульта и следующими переменными: средний пик, вытягивание в минуту, совокупная продолжительность сеанса, паузы между приступами и тяги за подход. Никакие переменные до инсульта, кроме средней силы тяги, не были значимо коррелированы с вероятностью успеха (см. Таблицу 1). После инсульта большинство переменных также не показали значимой корреляции с частотой успеха, за исключением средней силы тяги (Таблица 1).
Наконец, ПРТ позволяет анализировать не только квалифицированное двигательное поведение, но и циркадные паттерны. На рисунке 4 показана доля каждого часа для каждой клетки, в которой была занята ПРТ, представленная в виде среднего показателя за исходные и постинсультные дни. Синяя линия на рисунке показывает усредненное количество записей в час, сделанных в течение дня. До инсульта животные выполняли задачу на высоком уровне утром, сокращая продолжительность в течение дня. За несколько часов до включения огней вовлеченность либо снова возрастала (самки), либо увеличивалась очень незначительно (самцы), прежде чем прекратиться вскоре после включения огней. Это бимодальное циркадное распределение полностью изменилось после инсульта. Животные меньше занимались по утрам, и их время в камере достигало пика позже в течение дня. Такой паттерн может отражать общие нарушения сна и циркадные ритмы, часто наблюдаемые после инсульта 30,31,32,33.
Рисунок 1: Измерение типичных изменений производительности в квалифицированной работе после инсульта с использованием процедуры ПРТ. Измерялась эффективность квалифицированного охвата до и после инсульта. Среднесуточные значения по животным по коэффициенту успеха за схватку, средней силе на тягу и количеству тяг за схватку отображаются за 5 дней от исходного уровня и через один день после инсульта (слева) и между средним значением исходного уровня и одним днем после инсульта (после инсульта) с помощью парных t-тестов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Различные параметры сеанса, инициируемого самостоятельно, показывают разную тенденцию к изменению после инсульта. Показатели самоинициации для сеансов квалифицированного поведения до и после инсульта стали возможными благодаря процедуре ПРТ. Среднесуточные значения по животным для начала сеанса и кумулятивная ежедневная продолжительность сеанса отображаются за 5 дней исходного уровня и один день после инсульта (слева), а также между средним значением исходного уровня и одним днем после инсульта (после инсульта) с помощью парных t-тестов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Переменные, связанные с мотивацией, изменяются после инсульта. Были определены показатели эффективности сеансов квалифицированного поведения до и после инсульта, связанные с мотивацией. Среднесуточные значения по животным для продолжительности паузы между схватками и суточной частоты схваток за минуту сеанса отображаются за 5 дней исходного уровня и один день после инсульта (слева), а также между средним значением исходного уровня и одним днем после инсульта (после инсульта) с помощью парных t-тестов. Паузы между схватками изменились с точки зрения этих среднесуточных показателей, но еще более поразительно, что распределение индивидуальной продолжительности пауз после инсульта также изменилось в обе стороны от среднего. Отдельные длины пауз объединяются для всех животных и отображаются в виде распределений на логарифмической оси (крайний справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Циркадный паттерн самоинициируемых сеансов изменяется после инсульта. Были определены показатели циркадного паттерна самоинициируемых сеансов квалифицированного поведения до (слева) и после (справа) инсульта для всех животных, самок и самцов. Эти данные включают все записи и все время заполнения камеры по клетке, усредненные по дням до и после инсульта. Затем две клетки снова усредняются, чтобы показать общее распределение (верхний ряд). Модели до инсульта включали высокую вовлеченность утром, которая уменьшалась в течение всего периода бодрствования с новым пиком непосредственно перед фазой сна. Модели после инсульта показывают, что продолжительность сеанса увеличивается в течение дня и достигает пика перед фазой сна. Крысы находились на обратных световых циклах в своей комнате. Период включения света показан заштрихованным серым цветом, чтобы указать на нормальный период неактивности крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Корреляции | ||||||
| Переменные | Переменная сравнения | Копьеносец | ||||
| n | До инсульта | p | После инсульта | p | ||
| Среднее тяговое усилие | Процент успеха | 5 | 1 | <0,001 | -0.975 | 0.005 |
| Вытягивание в минуту | Процент успеха | 5 | 0.3 | 0.624 | -0.154 | 0.805 |
| Совокупная продолжительность сеанса | Процент успеха | 5 | -0.1 | 0.873 | 0.564 | 0.322 |
| Паузы между схватками | Процент успеха | 5 | -0.6 | 0.285 | 0.205 | 0.741 |
| Вытягивание за бой | Процент успеха | 5 | 0.1 | 0.873 | -0.821 | 0.089 |
Таблица 1: Коэффициенты корреляции Спирмена между переменными. Ранговые корреляции Спирмена были выполнены для определения взаимосвязи между частотой успеха до или после инсульта, и были определены следующие переменные: средний пик, вытягивание в минуту, кумулятивная продолжительность сеанса, паузы между приступами и вытягивания за схватку. Перед корреляцией были проведены тесты Шапиро Уилка для оценки равномерного распределения всех тестовых переменных, и они показали, что некоторые переменные значительно отклоняются от нормы. Никакие переменные до инсульта, кроме средней силы тяги, не были значимо коррелированы с вероятностью успеха. В этой таблице представлены результаты коэффициентов корреляции Спирмена (ρ), оцененных при наличии связи между частотой успеха и пятью тестовыми переменными.
Дополнительный файл 1: Этапы создания ОРТ. Инструкция по печати и изготовлению турникета «Одна крыса». В инструкции включен список всех необходимых материалов, а также пошаговые инструкции (с изображениями). Файл также содержит инструкции по подключению микропереключателя для регистрации входов и выходов, а также проводку и программирование для подключения RFID-считывателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный кодировочный файл 1: Это включает в себя все компоненты, необходимые для 3D-печати турникета «Одна крыса». Этот файл можно использовать либо напрямую, либо получить доступ с помощью инструкций в дополнительном файле 1. Все компоненты в этом файле должны быть масштабированы с помощью входящей в комплект части «линейки» (дополнительные сведения см. в дополнительном файле 1 ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол имеет множество применений. Во-первых, и это наиболее широко, ОРТ был разработан с целью обеспечения автоматизированного однопредметного поведенческого обучения и сбора данных в контексте социального, обогащенного жилья. В то время как это исследование проверило идею сбора типичных поведенческих показателей и их разработки в контексте инсульта, то же самое можно сделать и для других приложений и поведенческих задач. Даже показатели, собранные в ходе этой валидации, также могут быть скорректированы по мере необходимости, чтобы включить альтернативные графики подкрепления, альтернативные модели поведения и т. д. Во-вторых, в этом исследовании оценивалась способность системы собирать данные, связанные с нарушением квалифицированного доступа после инсульта. Текущий протокол был ранее валидирован для обучения и измерения основных нажатий рычага16. Текущие данные показывают, что это правильный подход к сбору данных о двигательном дефиците, связанном с инсультом, и что возможны меры, типичные для традиционных оценок охвата квалифицированных специалистов, а также новые измерения. При устранении неполадок в системе ПРТ в клетке колонии большой вопрос заключался в том, будут ли животные самостоятельно инициировать поведенческие сеансы с достаточной частотой, и будут ли они делать это в различных экспериментальных контекстах, особенно после инсульта. Было обнаружено, что всех или почти всех животных можно поощрять к достаточному участию в простых оперантных процедурах, а теперь и в постинсультном поведенческом тестировании. Периоды после инсульта требовали некоторого ручного формирования, но животные быстро возвращались к участию в поведенческой задаче без присутствия экспериментатора.
Во время устранения неполадок было обнаружено несколько процедурных моментов, которые повышают вероятность успеха, и они были интегрированы в протокол. Они включали в себя необходимость масштабирования ПРТ в соответствии с размером крыс и обеспечения того, чтобы животные одинакового размера и выращивались в социальном контексте. Кроме того, было обнаружено, что одна ОРТ наиболее эффективна для размещения 4-6 крыс из-за потенциальной высокой конкуренции за камеру. Стоит отметить, что это соревнование, по-видимому, не вызывает большего стресса по сравнению с традиционными методами; Предыдущий эксперимент зафиксировал снижение уровня кортизола в клетке колонии по сравнению с традиционным поведенческимтестированием. Кроме того, было обнаружено, что для пугливых животных снятие турникета или оставление его незапертым во время начальной фазы обучения помогает нескольким крысам исследовать камеру вместе.
Хотя этот подход эффективен для оценки двигательного дефицита после инсульта, важно признать несколько ограничений. Во-первых, животные после инсульта могут не сразу возобновить вытягивание, и им может потребоваться несколько сеансов ручной формовки и/или приманки. При этом и других специфических подходах полная автоматизация обучения и тестирования может быть затруднена. Тем не менее, это ограничение не уникально для клетки колонии ОРТ, и животные в поведенческих сеансах, инициированных экспериментатором, часто сталкиваются с той же проблемой.
Еще одним ограничением является возможность использования камер не по назначению. Как ни странно, наблюдалось несколько случаев, когда животные входили в поведенческие камеры и проводили значительное количество времени внутри, не принимая активного участия в поведенческой задаче. Иногда это случалось со всеми животными, но особенно с самцами. Возможно, это было просто потому, что ОРТ предоставлял животным немного конфиденциальности, когда они не хотели участвовать в общественной жизни. Тем не менее, добавление «одиночных» комнат в клетку колонии с использованием других ОРТ смягчает эту проблему.
Также было замечено, что животные иногда останавливались в туннеле с полуоткрытым ОРТ и оставались там в течение определенного периода времени. По этой причине лучше всего располагать RFID-считыватель рядом с поведенческой камерой, чтобы животное не регистрировалось до тех пор, пока оно полностью не войдет. Можно предположить, что задерживаться в ОРТ так же приятно, как и выжимной желоб. В любом случае, животные не задерживаются там таким образом, чтобы помешать сбору данных, особенно когда доступны альтернативные изоляционные камеры, прикрепленные к ПРТ.
Еще одно ограничение заключается в том, что самоинициируемый сеанс может быть более трудным для выравнивания времени поведенческого сеанса или возможностей поведенческого реагирования между людьми в группах. Это ограничение может быть особенно актуально для исследований, связанных с инсультом, учитывая связь между совокупным временем тренировки и восстановлением. Однако это ограничение может быть хотя бы частично устранено. Если эксперимент требует, можно запрограммировать многие поведенческие аппараты на прерывание сеансов при достижении целевой продолжительности или целевого количества реакций (т.е. путем прекращения вознаграждения или втягивания манипулятива). Это решение не устраняет тенденцию к тому, чтобы люди не достигали своих целей. Но, опять же, это ограничение не уникально для этой системы.
Эта установка также имеет то преимущество, что поведенческая дрессировка или воздействие могут происходить в течение дня, а не в несколько ограниченных случаев. Это может быть полезно в нескольких контекстах; В частности, при инсульте он может быть использован для исследования дозировочного эффекта подходов к поведенческой реабилитации.
Наконец, ПРТ, вероятно, не может быть использован для аверсивных процедур, таких как социальное поражение, принудительное плавание, условный страх и т.д. ОРТ требует, чтобы поведенческая парадигма была аппетитной; в противном случае животные, скорее всего, просто будут избегать поведенческих камер.
Несмотря на ограничения, эта процедура добавляет значительные преимущества к существующим в настоящее время поведенческим парадигмам для крыс. Во-первых, установка позволяет непрерывно собирать данные с высокой пропускной способностью, высвобождая время экспериментатора. Хотя важно постоянно следить за оборудованием и животными, экспериментаторы должны присутствовать только в течение коротких периодов времени в течение дня. Проведение поведенческих сессий для 8 животных потребовало бы 4-10 часов ежедневных сессий при традиционном подходе. Подход с клеткой колонии ОРТ не только сокращает это время практически до нуля (при условии наличия работающего и автоматизированного аппарата), но и позволяет собирать данные в выходные дни с небольшой потребностью в дополнительном присутствии; Такая постоянная доступность поведенческой активности в выходные дни также увеличивает общее обогащение, доступное животным.
Протокол ОРТ-колонии-клетки обеспечивает преимущества в области данных, а также логистические преимущества. Доступно множество зависимых переменных, которые традиционно невозможны, включая темп, продолжительность или другие параметры сеансов, инициируемых самостоятельно, таких как те, которые исследуются здесь. Циркадные переменные часто измеряются с помощью беговых колес; Однако этот протокол позволяет рассматривать паттерны, а также параметры выбора в других видах поведения. ОРТ может быть даже использован для соединения клеток колонии и обеспечения визуального или обонятельного доступа к противоположному полу, что позволяет не только оценить мотивацию, но и циркадную модель стремления к партнеру. В этом исследовании было охарактеризовано несколько новых зависимых переменных, которые могут быть полезны в исследованиях инсульта, включая циркадные переменные и переменные, связанные с инициацией, которые могут помочь в изучении трансляционных вопросов, связанных с потерей мотивации и депрессией, которые могут возникнуть после инсультаили в контексте них. Хотя здесь это не рассматривается, другие важные переменные, связанные с инсультом, такие как качественный анализ кинематики досягаемости, также должны быть легко учтены с помощью этого протокола клетки колоний ОРТ с помощью камер, активируемых движением.
Наконец, значительным преимуществом этого протокола является его способность позволять животным оставаться в большой, богатой и социальной среде большую часть своей жизни. Прогресс в области благополучия животных важен в базовых лабораториях не только по этическим, но и по научным причинам. Животные, которые могут передвигаться и социализироваться, должны служить лучшими моделями для болезненных состояний, которые естественным образом не связаны с ограничениями или лишениями. Кроме того, самодостаточный характер поведенческих сессий в этом протоколе означает, что люди не должны присутствовать при сборе поведенческих данных. Присутствие людей в лаборатории может влиять на поведенческие данные, иногда по-разному в зависимости от человека, насколько хорошо он обучен и как он обращаетсяс животными. Такое неконтролируемое и переменное воздействие на данные может быть сведено к минимуму с помощью текущего протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов, которые можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была частично профинансирована Фондом Беатрис Х. Барретт для исследования нейрооперантных отношений в Университете Северного Техаса (UNT). Мы благодарны за вклад и помощь всем сотрудникам Лаборатории нейропластичности и восстановления, особенно Валери Рохас, Мэри Кейт Мур, Кэмерон Скаллон и Ханна Макги.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Consult with local makerspace | ||
| bolt | Boltdepot | 1346 | 6-32 or 8-32 by 0.5" |
| bolt | Boltdepot | 1348 | 6-32 or 8-32 by 0.75" |
| door hinge | XJS (Amazon) | 43398-16234 | 1" cabinet stainless steel door hinge set; Optional (if "perfect hinge" is not printed) |
| drill | Any electric drill works | ||
| extension spring | Nieko (Amazon) | 50456A | Choose and adjust spring based on ORT sized and desired tension |
| granulated sugar | |||
| lock nuts | Boltdepot | 2551 | 6-32 or 8-32 |
| measuring tape | |||
| microcontroller | Arduino | A000066 | Arduino Uno |
| microswitch | Sparkfun | KW4-Z5F | mini microswitch (SPDT-roller lever) |
| One Rat Turnstile (ORT) | Vulintus | Contact company to request quote if not self-assembling | |
| Operant Chambers as desired for behavioral assessment: For this experiment we used automated isometric pull chambers from Vulintus | Vulintus | No cat #: contact Vulintus | Contact Vulintus for quote |
| PLA filament | OVERTURE (Amazon) | UK-MATTEPLA17511 | |
| plexiglass | Lesnlok (Amazon) | B09P74K7BR | clear, 1/8" thickness, Cut to size |
| plexiglass cutter | |||
| python program | Python Software Foundation | software available on request | |
| RFID reader | Priority 1 Design | RFIDRW-E-USB | With antenna |
| RFID tag | Unified Information Devices | UC-1485-10 | |
| rod | Boltdepot | 23632 | cut to > 3.5" |
| Rotary tool | Used to bore hole in apparatus and colony caging for ORT; any hardware usable | ||
| sand paper | HSYMQ (Amazon) | TOMPOL-1118-1915-11 | |
| socket wrench set | Any socket wrench set works | ||
| soldering iron | |||
| super glue | 234790 | ||
| wire | Plusivo (Amazon) | EAN0721248989789 |
References
- Whishaw, I. Q., Kolb, B. The behavior of the laboratory rat: A handbook with tests. , Oxford university press. (2004).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Ottesen, J. L., Weber, A., Gürtler, H., Mikkelsen, L. F. New housing conditions: Improving the welfare of experimental animals. Alternatives to Laboratory Animals. 32 (Suppl 1B), 397-404 (2004).
- Arakawa, H. Ethological approach to social isolation effects in behavioral studies of laboratory rodents. Behavioural Brain Research. 341, 98-108 (2018).
- Simpson, J., Kelly, J. P. The impact of environmental enrichment in laboratory rats-behavioural and neurochemical aspects. Behavioural Brain Research. 222 (1), 246-264 (2011).
- Van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H.
- Hays, S. A., et al. The isometric pull task: A novel automated method for quantifying forelimb force generation in rats. Journal of Neuroscience Methods. 212 (2), 329-337 (2013).
- Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
- Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. Automated forelimb tasks for rodents: Current advantages and limitations, and future promise. Neurorehabilitation and Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).
- Sindhurakar, A., et al. An automated test of rat forelimb supination quantifies motor function loss and recovery after corticospinal injury. Neurorehabilitation and Neural Repair. 31 (2), 122-132 (2017).
- Gallistel, C., et al. Screening for learning and memory mutations: A new approach. Acta psychologica Sinica. 42 (1), 138 (2010).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Brenneis, C., et al. Automated tracking of motion and body weight for objective monitoring of rats in colony housing. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 18-31 (2017).
- Pereira, T. D., et al. Sleap: A deep learning system for multi-animal pose tracking. Nature Methods. 19 (4), 486-495 (2022).
- Lauer, J., et al. Multi-animal pose estimation, identification and tracking with deeplabcut. Nature Methods. 19 (4), 496-504 (2022).
- Butcher, G., et al. An apparatus for automatically training and collecting individualized behavioral data with socially housed rodents. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109387 (2022).
- Winter, Y., Schaefers, A. T. A sorting system with automated gates permits individual operant experiments with mice from a social home cage. Journal of Neuroscience Methods. 196 (2), 276-280 (2011).
- Rivalan, M., Munawar, H., Fuchs, A., Winter, Y. An automated, experimenter-free method for the standardised, operant cognitive testing of rats. PLOS One. 12 (1), e0169476 (2017).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
- Lang, C. E., Lohse, K. R., Birkenmeier, R. L. Dose and timing in neurorehabilitation: Prescribing motor therapy after stroke. Current Opinion in Neurology. 28 (6), 549 (2015).
- Inventing a supercage for rats. Butcher, G., Becker, A., Davidson, A., Baltazar, M., Armshaw, J., Cruz, S. Poster presentation at Association for Behavior Analysis International Conference, Chicago, IL, , (2019).
- Engineering an enriched environment operant chamber and its implications. Davidson, A., et al. Poster Presented at the Texas Association for Behavior Analysis Annual Conference, , Worth, TX. (2019).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Experimental Neurology. 201 (2), 324-334 (2006).
- Reppucci, C. J., Veenema, A. H. The social versus food preference test: A behavioral paradigm for studying competing motivated behaviors in rodents. MethodsX. 7, 101119 (2020).
- Borland, J. M., et al. A novel operant task to assess social reward and motivation in rodents. Journal of Neuroscience Methods. 287, 80-88 (2017).
- Tzschentke, T. M. Review on cpp: Measuring reward with the conditioned place preference (cpp) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227-462 (2007).
- Salamone, J. D., Correa, M. Neurobiology and pharmacology of activational and effort-related aspects of motivation: Rodent studies. Current Opinion in Behavioral Sciences. 22, 114-120 (2018).
- Shull, R. L. Bouts, changeovers, and units of operant behavior. European Journal of Behavior Analysis. 12 (1), 49-72 (2011).
- Gottlieb, E., et al. The bidirectional impact of sleep and circadian rhythm dysfunction in human ischaemic stroke: A systematic review. Sleep Medicine Reviews. 45, 54-69 (2019).
- Lo, E. H., et al.
- Meng, H., Liu, T., Borjigin, J., Wang, M. M. Ischemic stroke destabilizes circadian rhythms. Journal of Circadian Rhythms. 6 (1), 1-13 (2008).
- Stern, R. A., Bachman, D. L.
- Rapolienė, J., Endzelytė, E., Jasevičienė, I., Savickas, R. Stroke patients motivation influence on the effectiveness of occupational therapy. Rehabilitation Research and Practice. 2018, (2018).
- Robinson, R. G., Jorge, R. E.
- Faraji, J., et al. Sex-specific stress and biobehavioral responses to human experimenters in rats. Frontiers in Neuroscience. 16, 965500 (2022).
