Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام نظام عالي الإنتاجية يتيح مراقبة وقياس التأثيرات العصبية للموجات فوق الصوتية المركزة على الخلايا العصبية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (HiPSC).
Abstract
تم إثبات التأثيرات العصبية للموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) في النماذج الحيوانية ، وتم استخدام FUS بنجاح لعلاج اضطرابات الحركة والنفسية لدى البشر. ومع ذلك ، على الرغم من نجاح FUS ، فإن الآلية الكامنة وراء آثاره على الخلايا العصبية لا تزال غير مفهومة بشكل جيد ، مما يجعل تحسين العلاج عن طريق ضبط معلمات FUS أمرا صعبا. لمعالجة هذه الفجوة في المعرفة ، درسنا الخلايا العصبية البشرية في المختبر باستخدام الخلايا العصبية المستزرعة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (HiPSCs). يسمح استخدام HiPSCs بدراسة السلوكيات العصبية الخاصة بالإنسان في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية. يقدم هذا التقرير بروتوكولا لاستخدام نظام عالي الإنتاجية يتيح مراقبة وقياس التأثيرات العصبية ل FUS على الخلايا العصبية HiPSC. من خلال تغيير معلمات FUS والتلاعب بالخلايا العصبية HiPSC من خلال التعديلات الصيدلانية والجينية ، يمكن للباحثين تقييم الاستجابات العصبية وتوضيح التأثيرات العصبية ل FUS على الخلايا العصبية HiPSC. يمكن أن يكون لهذا البحث آثار كبيرة على تطوير علاجات آمنة وفعالة قائمة على FUS لمجموعة من الاضطرابات العصبية والنفسية.
Introduction
الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) هي طريقة تعديل عصبي واعدة تتيح التحفيز غير الباضع على أعماق السنتيمتر بدقة أقل منالمليمتر 1،2،3. على الرغم من نقاط القوة هذه ، فإن التأثير السريري ل FUS محدود ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص المعرفة فيما يتعلق بآلية عمله. بدون أساس نظري متين ، يواجه الباحثون والأطباء صعوبات في تصميم العلاج لتلبية الاحتياجات المحددة للمرضى الفرديين في ظل ظروف مختلفة. تشير نظرية بارزة اقترحها Yoo et al.4 إلى أن القنوات الأيونية الحساسة ميكانيكيا هي المسؤولة عن تنشيط الخلايا العصبية. ومع ذلك ، فشلت هذه النظرية في تفسير تنشيط FUS في الخلايا العصبية في الدماغ البشري ، والتي تفتقر إلى هذه القنوات5. يحد هذا الغموض من استخدام FUS في العيادة ، لأنه يحول دون ضبط معلمات FUS لتحسين نتائج العلاج.
استخدمت الدراسات السابقة ذات الصلة مجموعة من الأساليب للتحقيق في الآليات الفسيولوجية التي تقوم عليها FUS وتحديد معلمات التحفيز المثلى. تتضمن الخطوة الحاسمة في هذه العملية مراقبة الاستجابات العصبية كتغذية مرتدة ، والتي يمكن تحقيقها من خلال الطرق التي تتضمن مراقبة البوابة الأيونية ، مثل التصوير بأيون الكالسيوم4 ، والتصوير البصري1 ، والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، تخطيط كهربية العضل6 أو الفيزيولوجيا الكهربية للأعصابالجلدية 7). ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات تستخدم الخلايا العصبية غير البشرية أو الأساليب في الجسم الحي ، والتي يمكن أن تقدم اختلافات إضافية بسبب الضوابط دون المستوى الأمثل. في المقابل ، فإن استخدام الأقطاب الكهربائية لقياس الإشارات العصبية في الخلايا العصبية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في المختبر (HiPSC) يوفر قياسات أكثر حساسية وتحكما أكبر في البيئة التجريبية. في هذا العمل ، تم تطوير نظام في المختبر باستخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEAs) لقياس الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية HiPSC بعد تحفيز FUS ، كما هو موضح في الشكل 1. يمكن هذا النظام الباحثين في المجتمع من مراقبة الاستجابات العصبية عند تغيير معلمات الموجات فوق الصوتية (على سبيل المثال ، التردد ، طول الانفجار ، الشدة). بالإضافة إلى ذلك ، يتيح هذا النظام مستوى عال من التحكم في الحساسية العصبية للمنبهات الفيزيائية (مثل درجة الحرارة والضغط والتجويف)8,9 ، حيث يمكن التلاعب بوظيفة القناة الأيونية للخلايا العصبية وراثيا وصيدلانيا (على سبيل المثال ، استخدام الجادولينيوم لتثبيط القنوات الأيونية)10،11،12. قد يساعد هذا التحكم على المستوى الجزيئي في توضيح الآليات الكامنة وراء التأثيرات العصبية ل FUS.
Protocol
1. تحضير المواد
- استنشاق وسط الاستزراع ، واستخدامه لملء بئر واحد في لوحة زراعة الخلايا العصبية المكونة من 24 بئرا مع MEA المدمج (الشكل 2A). استزراع وحث الخلايا العصبية باتباع البروتوكول المنشور من قبل Taga et al.13.
- تعقيم واجهة parafilm ، والشريط المطاطي ، ومخروط FUS مع الغشاء المطاطي باستخدام 70 ٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، ووضعها في غطاء الدخان لتجميعها لاحقا.
- ديغا 300 مل من الماء منزوع الأيونات و 50 مل من جل التوصيل. قم بطرد الماء والهلام عند 160 × جم لمدة 5 دقائق لتجنب إحداث التجويف داخل وسط التوصيل.
ملاحظة: المصدر الأصلي ل HiPSCs من خطوط خلايا GM01582 و CIPS. في المتوسط ، يمكن تحقيق كثافة 5 × 104 الخلايا العصبية الحركية و 2.5 × 104 الخلايا النجمية لكل بئر14.
2. اتصال وإعداد الأجهزة الطرفية
- قم بتثبيت مخروط FUS بمحول الطاقة باستخدام البراغي ، وأغلق المخروط بغشاء مطاطي مرن في غطاء معقم جيد التهوية. املأ المخروط بالماء المنزوع الغازات ونزع الأيونات (DG-DI) من الخطوة 1.3 ، وتأكد من عدم وجود فقاعات في المخروط لتجنب التجويف.
- استخدم قضيبا ملوبطا مخصصا لتثبيت الحامل المطبوع ثلاثي الأبعاد بإطار (الشكل 2 ب). ضع الإطار بحيث يكون رأس محول الطاقة FUS فوق البئر الذي سيتم تحفيزه.
- استخدم شريطا مطاطيا لتثبيت البارافيلم فوق البئر على لوحة MEA المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على الوسط و HiPSCs.
- قم بإعداد نظام FUS عن طريق توصيل إلكترونيات السائق الخلفية لمحول الموجات فوق الصوتية ، وفي هذه الحالة ، خرج طاقة محول الطاقة (TPO ؛ الشكل 3A) ، إلى منفذ طاقة 100-240 فولت (الشكل 3B ، الاتصال 6) وتوصيل الشبكة المطابقة ب TPO ومحول FUS (الشكل 3B ، الاتصال 1 والاتصال 2 ، على التوالي). تضمن شبكة المطابقة اقتران كهربائي فعال بين محول الطاقة و TPO.
- قم بتوصيل نظام MEA بمأخذ طاقة (100-240 فولت) (الشكل 3B ، الاتصال 5). قم بتوصيل منفذ مزامنة نظام MEA ب TPO (الشكل 3B ، الاتصال 3). وسيعمل هذا الاتصال على مزامنة الحصول على البيانات من قبل نظام الشرق الأوسط وأفريقيا مع تحفيز FUS.
- ضع لوحة MEA المكونة من 24 بئرا في نظام MEA ، وقم بإزالة الغطاء لتمكين الاتصال المباشر بين محول الطاقة والبئر. ضع محول الطاقة 5-10 مم فوق لوحة البئر لإفساح المجال لجل التوصيل المنزوع الغازات ، كما هو موضح في الخطوة 3.2 (الشكل 3 أ والشكل 2 ب).
3. التحفيز واكتساب الإشارات العصبية
- اضبط معلمات FUS على لوحة تحكم TPO (الجدول 1).
- ضع جل التوصيل أعلى البارافيلم ، واخفض محول FUS في جل التوصيل ، مما يضمن ملامسة الجل بأقل قدر من فقاعات الهواء (الشكل 2 أ).
- ابدأ تسجيل نظام MEA بالنقر فوق الزر "ابدأ" على واجهة المستخدم.
- ابدأ صوتنة FUS بالضغط على الزر الأيمن السفلي على TPO (الشكل 3A ، التسمية 7) ، وانتظر 5 دقائق على الأقل بين كل جولة من صوتنة للسماح للخلايا العصبية بالعودة إلى حالة خط الأساس.
- استخدم نبضة الزناد الناتجة عن نظام FUS لمواءمة تسلسل تحفيز FUS مع تسجيل MEA (الشكل 3B ، الاتصال 3).
4. معالجة البيانات وتحليلها
- نقل البيانات من نظام MEA إلى الكمبيوتر باستخدام اتصال USB (الشكل 3B ، الاتصال 4). ابدأ هذا بالنقر فوق لوحة إعداد التجربة . بعد ذلك ، اختر نوع البيانات الذي يرغب المرء في تسجيله. في هذه الحالة ، يوصى باستخدام المسامير الخام. أخيرا ، قم بتسمية الملف ، وحدد الموقع المطلوب داخل محرك الأقراص لإكمال النقل.
ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية عن طريق تشغيل البرنامج النصي Python الذي تم إصداره في https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod. - اقرأ البيانات من كل من الأقطاب الكهربائية ال 16.
- قم بتطبيق مرشح تمرير النطاق الترددي Butterworth بعرض نطاق ترددي من 5 هرتز إلى 3 كيلو هرتز مع طلب Butterworth من 8.
ملاحظة: لتحسين هذه القيم ، من الأهمية بمكان مراعاة معدل إطلاق الخلايا المحددة وعدد الخلايا المعنية. بضرب هذه القيم 2 ، يمكن للمرء تقدير معدل إطلاق النار الإجمالي لسكان الخلايا في التجربة. - قم بتطبيق مرشح Gaussian مع σ = 3 لتنعيم الإشارة.
ملاحظة: يمكن تحسين المعلمة بناء على القيم الموصى بها من نظام MEA ، حيث قد يؤدي التنعيم المفرط إلى تشويه البيانات بعد الاستحواذ ، وقد يؤدي القليل جدا من التنعيم إلى حدوث ضوضاء غير مرغوب فيها. - قم بتعيين عتبة لاكتشاف الارتفاعات المحتملة على أنها 5 أضعاف الانحراف المعياري للإشارة الملساء الغاوسية.
- احسب معدل إطلاق النار بقسمة عدد المسامير المسجلة في نافذة 50 مللي ثانية عبر جميع القنوات ال 16 على طول النافذة (أي 50 مللي ثانية). قم بتحويل النافذة على طول الإشارة إلى الإطار التالي ، وكرر حساب معدل إطلاق النار (الشكل التكميلي 1).
- تحليل الإشارة عن طريق قراءة وقت صوتنة FUS من البيانات المنقولة بناء على التغيير في معدل إطلاق النار المرتبط ب FUS.
5. تنظيف وإعادة استخدام لوحة MEA متعددة الآبار
- بمجرد اكتمال التجارب ، استخدم ماصة لإزالة الوسط بعناية من الآبار الموجودة في اللوحة متعددة الآبار ، مع الحرص على تجنب سطح القطب.
- أضف 2 مل من ماء DG-DI لكل بئر. نضح وكرر مرة واحدة.
- لإزاحة أي خلايا وحطام ، أضف مزيجا من 1 غرام من المنظف الأنزيمي Terg-A-Zyme مع 10 مل من ماء DG-DI المعقم (0.3 مل لكل بئر) إلى اللوحة. اتركه لاحتضانه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT).
- في اليوم التالي ، قم بإزالة المحلول من الآبار وشطفه ب 1 مل من ماء DG-DI المعقم.
- احتضان لوحة متعددة الآبار لمدة 5-7 دقائق ، ونضح. كرر هذه الخطوة 5 مرات.
- أضف 0.5 مل من ماء DG-DI المعقم لكل بئر. سجل خط الأساس للوحة متعددة الآبار التي تم تنظيفها للتحقق من نظافة لوحة MEA. يجب أن تظهر اللوحة النظيفة أنماط ضوضاء غاوسية بقيم كثافة منخفضة.
- قم بتخزين اللوحة متعددة الآبار التي تم تنظيفها على حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام مرة أخرى. قم بتغيير المياه التي يتم تخزين MEAs فيها مرة واحدة على الأقل شهريا.
Representative Results
باختصار ، نقدم بروتوكولا يتيح مراقبة التعديل العصبي FUS في المختبر باستخدام الخلايا العصبية المستزرعة من HiPSCs. تم توضيح منصة النظام الشاملة لتحفيز الخلايا العصبية التي يسببها HiPSC وتسجيل الاستجابات الكهربائية المقابلة للتحليل في الشكل 1. تركز هذه الدراسة على تحفيز FUS للخلايا العصبية وتسجيل الاستجابات الكهربائية في نظام MEA ، كما هو موضح في الشكل 2. يوضح الشكل 3 المكونات الطرفية لأنظمة FUS و MEA ووصلاتها.
يتم إجراء توصيف النقطة البؤرية قبل التجارب العصبية لضمان تغطية قاع البئر بالكامل بواسطة نقطة الاتصال FUS. يجب إجراء تصور للنقطة البؤرية على الألواح الحرارية ، كما هو موضح في الشكل 4 ، لتقييم نظام FUS. بعد توصيف النقطة البؤرية ، يجب تنفيذ خطوات ما بعد المعالجة ، بما في ذلك التصفية ، والعتبة ، وحساب معدل إطلاق النار ، ويتم تلخيصها في الشكل 5 والشكل 6. هذه الخطوات ضرورية لاسترداد الإشارات المفيدة عن طريق تصفية الضوضاء من البيئة ، وبالتالي ، لاكتساب نظرة ثاقبة لتغيرات النشاط العصبي التي تسببها FUS. تظهر المخططات النقطية في الشكل 6A-B الارتفاعات المكتشفة في كل قناة. نظرا لأن قاع البئر بأكمله يقع داخل النقطة البؤرية لمحول الطاقة FUS ، فمن المتوقع أن يغير FUS معدل إطلاق النار عبر جميع الأقطاب الكهربائية. يظهر هذا التغيير في معدل إطلاق النار في مخطط معدل إطلاق النار الموضح في الشكل 6C ، والذي يوضح أن معلمات التحفيز المختارة أدت إلى زيادة في معدل إطلاق الخلايا العصبية. وعلى وجه التحديد، كان معدل إطلاق ما قبل FUS (أي خط الأساس) 140 هرتز ± 116.7 هرتز، في حين كان معدل إطلاق ما بعد FUS 786 هرتز ± 419.4 هرتز مع FUS الموجة المستمرة. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح الشكل 6C كيف يمكن أن يؤدي تغيير معلمات FUS (على سبيل المثال ، استخدام FUS للموجة النبضية بدلا من الموجة المستمرة) إلى تغيير حجم التغيير في معدل الإطلاق ، وكذلك تغيير مقدار الوقت قبل عودة الخلايا العصبية إلى حالتها الأساسية. لا تسبب الموجات فوق الصوتية المركزة منخفضة الكثافة (LIFU) احترارا كبيرا للثقافات ، خاصة عند مقارنتها بالموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة ، والتي تهدف إلى تحقيق آفة حرارية. يتم دعم عدم وجود تغير في درجة الحرارة مؤثرة سريريا من خلال الحسابات النظرية والمحاكاة (الشكل التكميلي 2). حتى في الحالات القصوى من معلمات FUS التجريبية المدرجة في الجدول 1 ، يمكن ملاحظة زيادة طفيفة فقط في درجة الحرارة تبلغ حوالي 0.04 درجة مئوية.
يتيح استخدام مخطط معدل إطلاق النار تحديد التأثيرات العصبية ل FUS ويمكن استخدامه للتمييز بين الاستجابات المثيرة والمثبطة. من المزايا المهمة للوحة MEA متعددة الآبار أنه يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لدراسة الحالات العصبية المختلفة ومعلمات التحفيز بطريقة عالية الإنتاجية.
الشكل 1: نظرة عامة على المنصة في المختبر للتعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) للخلايا العصبية في البئر وقياس نشاطها العصبي باستخدام مجموعة أقطاب كهربائية دقيقة. يسجل كل قطب كهربائي (خطوط حمراء وخضراء وزرقاء) من مجموعة من الخلايا العصبية داخل بئر واحدة. يتم تنفيذ خط أنابيب معالجة لتحويل التسجيلات الكهربائية العصبية الخام إلى الكشف عن أنماط إطلاق الخلايا العصبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعديل العصبي FUS باستخدام مصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة متعددة الآبار (MEA). (أ) رسم تخطيطي لإعداد التعديل العصبي FUS باستخدام MEA متعدد الآبار. تنتشر الموجات الصوتية الناتجة عن محول الطاقة FUS من خلال مخروط FUS مملوء بالماء المفرغ وتقترن باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية. يتم تثبيت البارافيلم في البئر باستخدام شريط مطاطي لمنع التلوث. ترسل لوحة MEA تسجيلات كهربائية من الخلايا العصبية إلى نظام MEA. (ب) صورة فوتوغرافية لمحول الطاقة FUS على اللوحة متعددة الآبار الموجودة في نظام الاتفاقات البيئية المتعددة الآبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعداد النظام الأساسي في المختبر . (أ) الجزء الأمامي من إعداد المنصة في المختبر . يتم استخدام خرج طاقة محول الطاقة (TPO ؛ يسار) لبرمجة معلمات FUS. يسجل نظام MEA (على اليمين) النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية في صفيحة البئر ، والتي يتم تعديلها عصبيا بواسطة محول الطاقة FUS. (B) الجزء الخلفي من إعداد المنصة في المختبر مع وصلات من الشبكة المطابقة (1) إلى TPO و (2) إلى محول الطاقة. (3) يؤدي الاتصال من نظام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف إلى TPO إلى مزامنة الحصول على البيانات. (4) الاتصال من نظام MEA إلى الكمبيوتر لنقل البيانات. (5) توصيل الطاقة بنظام MEA. (6) توصيل الطاقة بنظام FUS. (7) زر صوتنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيف محول الطاقة FUS. (أ) خريطة ضغط للنقطة البؤرية باستخدام بارامترات FUS المفصلة في الجدول 1 مقاسة بنظام السعة15. (ب) قبل وبعد صوتنة ورقة حرارية موضوعة في قاع البئر باستخدام الإعداد التجريبي الموضح في الشكل 3. يتغير لون الصفيحة الحرارية استجابة للتغيرات في درجات الحرارة ، مما يوفر التحقق البصري من التحفيز الناجح في موقع الخلايا العصبية. تم تعديل متوسط شدة النبض الأقصى للذروة المكانية (ISPPA) البالغ 30 واط / سم2 والصوتنة المستمرة لمدة 3 دقائق لتغيير درجة الحرارة المحلية بشكل جذري من أجل تصور أفضل لمثل هذه النقطة المحورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: خط أنابيب المعالجة. الخطوة 1: يتم التقاط التسجيلات الكهربائية الخام من N = 16 قناة. تظهر الخطوات المستقبلية العملية باستخدام القناة 16 (الموضحة باللون الأحمر). الخطوة 2: لكل قناة ، يتم تطبيق مرشح تمرير النطاق Butterworth (5 هرتز إلى 3 كيلو هرتز) ، متبوعا بمرشح Gaussian (σ = 3). يتم تعيين عتبة على أنها خمسة أضعاف الانحراف المعياري للإشارة داخل نافذة 2 ثانية تتمركز في بداية الصوتنة. الخطوة 3: تتميز الإشارات أعلى أو أسفل العتبة بأنها طفرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مخططات البيانات النقطية ومعدل إطلاق النار. (أ) مخطط نقطي للمسامير المكتشفة في كل قناة كدالة لوقت الصوتنة. يتم شرح وقت تحفيز FUS باستخدام خط أحمر. (ب) مخطط نقطي للخلايا العصبية تحت إعدادات FUS مختلفة مع FUS المستمر للمقارنة. (ج) تم حساب معدل إطلاق النار باستخدام نافذة منزلقة 50 مللي ثانية. كان متوسط معدلات الإطلاق قبل وبعد التحويرات العصبية FUS 140 هرتز و 786 هرتز على التوالي. مع FUS النبضي ، كان متوسط معدلات إطلاق النار 230 هرتز و 540 هرتز. لوحظ تنشيط أقصر وتغير أقل في المعدل بسبب هذه المجموعة من تحفيز FUS المتفاوت. يتم تفصيل عملية حساب معدل إطلاق النار في الشكل التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البارامتر | قيمة |
| ماكس السلطة / الفصل. | 1.200 واط |
| فالفعلي | 0.749 واط / قناة. |
| أناSPPA | 10.79 واط / سم2 |
| أناSPTA | 0.05 واط / سم2 |
| طول الاندفاع | 0.100 مللي ثانية |
| تردد | 250.00 كيلوهرتز |
| ركز | 39.800 ملم |
| مرحلة زمنية | 20.000 مللي ثانية |
| الموقت | 60.000 ثانية |
الجدول 1: معلمات الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) المحددة على TPO للدراسة المعروضة في الشكل 4.
الشكل التكميلي 1: المعالجة من مخطط البيانات النقطية إلى معدل إطلاق النار. الخطوة 1: عد المسامير بين جميع القنوات للحصول على رقم العد داخل نافذة منزلقة معينة. ملاحظة: هنا ، تم اختيار نافذة منزلقة أكبر (مضبوطة على 0.1 ثانية) للحصول على توضيح أفضل. الخطوة 2: قم بتحويل المسامير لكل طول نافذة إلى مسامير في الثانية (على سبيل المثال ، هنا ، اضرب الأعداد في 10 للتحويل إلى هرتز [هرتز] ، ثم اقسم على 1,000 للحصول على القيمة بالكيلو هرتز [كيلو هرتز]). الخطوة 3: تم الحصول على منحنى معدل إطلاق النار نتيجة لذلك. تتوفر مجموعة أدوات مفتوحة المصدر ، جنبا إلى جنب مع عينات من البيانات ، على GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: ملف درجة حرارة نتيجة محاكاة الموجة K ل LIFU16. استنادا إلى خريطة الكثافة الصوتية الموضحة في الشكل 4 ، تشير نتيجة محاكاة الموجة K إلى زيادة قصوى في درجة الحرارة قدرها 0.04 درجة مئوية داخل المنطقة المركزية للمنطقة البؤرية (نصف القطر: 2 مم) باستخدام الحالة القصوى لمعلمات FUS التجريبية المدرجة في الجدول 1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
تصف هذه المخطوطة طريقة جديدة يمكن استخدامها لتسجيل النشاط العصبي في HiPSCs أثناء التعديل العصبي FUS. هذا البروتوكول قابل للتعميم على مختلف محولات الطاقة FUS وأنظمة MEA. لتكرار النتائج التي لوحظت مع البروتوكول الموصوف ، يجب على الباحث التأكد من أن النقطة البؤرية لمحول الطاقة أكبر من مساحة قاع بئر MEA. علاوة على ذلك ، إذا تم استخدام خطوط خلايا عصبية مختلفة ، فيجب ضبط معلمات المرشح على استجابة التردد المتوقعة للخلايا داخل البئر. إذا تعذر تحقيق نتائج تمثيلية ، ينبغي للمرء أن ينظر في تعديل المعلمات المذكورة أعلاه (على سبيل المثال ، طول الانفجار ، والشدة ، ودورة العمل ، وما إلى ذلك).
على الرغم من أن هذا العمل أظهر زيادة في معدل إطلاق النار بعد تحفيز FUS ، يجب جمع المزيد من البيانات لإثبات تكرار هذه النتيجة قبل استخلاص أي استنتاجات. يرث هذا البروتوكول قيود أنظمة MEA ، والتي عادة ما يكون لها نقاط ضعف ناجمة عن تسجيل إشارة تيار القطب الدقيق المباشر. على الرغم من أن الاتصال المباشر مع الخلايا العصبية يوفر حساسية أفضل ، إلا أنه قد يغير الخلية ويؤثر على دقة القياس. علاوة على ذلك ، نظرا لصغر حجم الآبار ، لا يشتمل نظامنا على الأنسجة المحيطية ، والتي قد تلعب أيضا دورا في التعديل العصبي17. قد يحد هذا من إمكانية تطبيق الاستنتاجات المستخلصة من هذا الإعداد على البيئات في الجسم الحي . لدراسة استجابات الشبكة الأكثر تعقيدا ، يجب تصميم نظام MEA عالي الكثافة لتحسين حساسيته18. تم تحديد العديد من الاتجاهات المستقبلية لهذا النظام المقترح ، بما في ذلك استخدام جسر 3D لعقد محول الطاقة وضمان وضع دقيق19. يمكن إجراء تحسينات إضافية فيما يتعلق بخوارزمية ما بعد المعالجة ، بما في ذلك استخدام خوارزمية فرز الارتفاع20 لتصنيف الخلايا العصبية الفردية. ستكون هذه العملية مفيدة لفك تشابك استجابات الخلايا العصبية متعددة الوحدات في الدراسات المستقبلية حول آليات FUS. الأهم من ذلك ، من الضروري دمج طرق إضافية للتحفيز ، مثل المحفزات الكيميائية والكهربائية والبصرية ، لتوضيح الآليات الأساسية. يمكن لهذه الطرق تغيير الخصائص والسلوكيات العصبية ، مثل تثبيط قنوات أيونية معينة15 أو تعديل خصائص الغشاء21. من خلال تعديل العوامل الرئيسية داخل مسار الإشارات المفترض ، يمكن للباحثين تحديد مساهمات كل عامل في البيئات الخاضعة للرقابة ، وفي النهاية ، إلقاء الضوء على التفاعلات المعقدة في اللعب.
يعد التحفيز الكهربائي22 أحد أكثر التقنيات رسوخا للتعديل العصبي ، مع تاريخ طويل من التطبيقات الناجحة في الإعدادات السريرية والبحثية. في المقابل ، FUS وعلم البصرياتالوراثي 23 هي طرائق جديدة نسبيا اكتسبت الاهتمام في السنوات الأخيرة. تتمثل المزايا الرئيسية ل FUS في عدم غزوها وقدرتها على تحفيز الخلايا العصبية في أعماق قد يصعب الوصول إليها باستخدام تقنيات أخرى ، بما في ذلك التحفيز الكهربائي وعلم البصريات الوراثي. ومع ذلك ، مثل علم البصرياتالوراثي 24 ، فإن FUS لديها بعض القيود المتعلقة بنمذجة انتشار الموجة والاستجابات العصبية المرتبطة بها. قد يكون التقاط تعقيد الخصائص الصوتية غير المتجانسة للأنسجة في الجسم الحي أمرا صعبا ، مما يؤدي إلى عدم اليقين في مجال الضغط ، وبالتالي في الاستجابات العصبية. تمثل هذه الصعوبة في نمذجة هذه الخصائص بدقة تحديا عند تحسين التقنية لتطبيقات محددة في العالم الحقيقي. تؤكد التعقيدات المتأصلة على أهمية الأنظمة في المختبر مثل تلك الموجودة في هذه الدراسة ، لأنها تمكن من الدراسة المباشرة للاستجابات في ظل ظروف الكثافة الصوتية الخاضعة للرقابة.
في الختام ، يوفر هذا النظام منصة عالية الإنتاجية في المختبر لدراسة التأثيرات العصبية المعدلة ل FUS على الخلايا العصبية البشرية. مع هذا النظام ، يمكن استكشاف آليات عمل FUS عن طريق قياس الاستجابات الكهربائية من الخلايا العصبية البشرية عند تعرضها لمستويات وأنواع مختلفة من التحفيز في بيئة خاضعة للرقابة. لذلك ، فإنه يوفر أداة تكميلية قيمة للنماذج البشرية والحيوانية الشائعة الاستخدام في هذا المجال.
Disclosures
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح. أمير منباشي يدرس ويقدم الاستشارات لشركة BK Medical (GE Healthcare) و Neurosonics Medical وهو مخترع في عدد من تقنيات FUS التي تنتظر الحصول على براءة اختراع. حصلت بيتي تايلر على تمويل بحثي من المعاهد الوطنية للصحة وهي مالك مشارك للعلاجات المركبة المتسارعة (بما في ذلك الأسهم أو الخيارات). قامت شركة Ashvattha Therapeutics Inc. بترخيص إحدى براءات الاختراع الخاصة بها وهي أحد المساهمين في شركة Peabody Pharmaceuticals.
Acknowledgments
أمير مانباشي ونيتيش ثاكور يعترفان بدعم التمويل من وكالة مشاريع البحوث الدفاعية المتقدمة ، DARPA ، عقد الترسية: N660012024075. بالإضافة إلى ذلك ، يقر أمير منباشي بدعم التمويل من برنامج علماء الأبحاث السريرية (KL2) التابع لمعهد جونز هوبكنز للبحوث السريرية والانتقالية (ICTR) ، والذي يديره المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية (NCATS) ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH). يقر Nitish Thakor بدعم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NIH): R01 HL139158-01A1 و R01 HL071568-15.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
| MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
| Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
| CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
| Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
| HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
| Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
| Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
| Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
| Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
| Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
| Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
| Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
| Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
| Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
| Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
| Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
| Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
| Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
| Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
| Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
| Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |
References
- Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment. Frontiers in Physics. 8, 150 (2020).
- Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits. , SPIE PRESS. Bellingham. Washington, USA. (2022).
- Manbachi, A. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible. , Available from: https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83 (2021).
- Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification. Nature Communications. 13 (1), 493 (2022).
- Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. The form and function of PIEZO2. Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).
- Kim, H., et al. Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals. Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).
- Hoffman, B. U., et al. Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119 (2022).
- Tyler, W. J.
- Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron. eNeuro. 8 (2), (2021).
- Chalfie, M.
- Launay, P., et al. TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization. Cell. 109 (3), 397-407 (2002).
- Cain, S. M., Snutch, T. P. Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing. Channels. 4 (6), 475-482 (2010).
- Taga, A., et al. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Manuel, T. J., et al. Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX. Scientific Reports. 10 (1), 15347 (2020).
- Treeby, B. E., Cox, B. T. k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields. J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314 (2010).
- Akhtar, K., et al. Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease. Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).
- Smirnova, L., et al. Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish. Frontiers in Science. 1, 1017235 (2023).
- Saccher, M., et al. Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA. Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2 (2022).
- Yger, P., et al. A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo. eLife. 7, e34518 (2018).
- Babakhanian, M., et al. Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins. Scientific Reports. 8, 17250 (2018).
- Liang, R., et al. Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude). 2022 Design of Medical Devices Conference. , Minneapolis, MN, USA. (2022).
- Ko, H., Yoon, S. -P. Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review. Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).
- White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design. Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).
