Summary
Her præsenterer vi en protokol til brug af et high-throughput system, der muliggør overvågning og kvantificering af de neuromodulerende virkninger af fokuseret ultralyd på menneskeinducerede pluripotente stamcelle (HiPSC) neuroner.
Abstract
De neuromodulerende virkninger af fokuseret ultralyd (FUS) er blevet påvist i dyremodeller, og FUS er blevet anvendt med succes til behandling af bevægelse og psykiatriske lidelser hos mennesker. På trods af succesen med FUS forbliver mekanismen, der ligger til grund for dens virkninger på neuroner, dårligt forstået, hvilket gør behandlingsoptimering ved at indstille FUS-parametre vanskelig. For at afhjælpe dette hul i viden studerede vi humane neuroner in vitro ved hjælp af neuroner dyrket fra menneskeskabte pluripotente stamceller (HiPSC'er). Brug af HiPSC'er giver mulighed for undersøgelse af menneskespecifik neuronal adfærd i både fysiologiske og patologiske tilstande. Denne rapport præsenterer en protokol til brug af et high-throughput system, der muliggør overvågning og kvantificering af de neuromodulerende virkninger af FUS på HiPSC-neuroner. Ved at variere FUS-parametrene og manipulere HiPSC-neuronerne gennem farmaceutiske og genetiske modifikationer kan forskere evaluere de neurale reaktioner og belyse de neuromodulerende virkninger af FUS på HiPSC-neuroner. Denne forskning kan have betydelige konsekvenser for udviklingen af sikre og effektive FUS-baserede terapier til en række neurologiske og psykiatriske lidelser.
Introduction
Fokuseret ultralyd (FUS) er en lovende neuromodulationsmodalitet, der muliggør ikke-invasiv stimulering på centimeterniveau dybder med submillimeteropløsning 1,2,3. På trods af disse styrker er den kliniske virkning af FUS begrænset, delvis på grund af manglende viden om dens virkningsmekanisme. Uden et solidt teoretisk fundament står forskere og klinikere over for vanskeligheder med at skræddersy terapien til at imødekomme de specifikke behov hos individuelle patienter under forskellige forhold. En fremtrædende teori foreslået af Yoo et al.4 antyder, at mekanofølsomme ionkanaler er ansvarlige for neuronaktivering. Denne teori forklarer imidlertid ikke FUS-aktivering i menneskelige hjerneneuroner, som mangler disse kanaler5. Denne tvetydighed begrænser udnyttelsen af FUS i klinikken, da det udelukker indstilling af FUS-parametre for at optimere behandlingsresultater.
Tidligere relaterede undersøgelser har anvendt en række tilgange til at undersøge de fysiologiske mekanismer, der understøtter FUS og til at bestemme de optimale stimuleringsparametre. Et afgørende trin i denne proces involverer overvågning af neuronale reaktioner som feedback, hvilket kan opnås gennem metoder, der involverer ion-gate-overvågning, såsom calciumionbilleddannelse4, optisk billeddannelse1 og ex vivo elektrofysiologisk optagelse (f.eks. elektromyografi6 eller hud-nerve elektrofysiologi7). Imidlertid bruger de fleste af disse undersøgelser ikke-menneskelige neuroner eller in vivo-tilgange, som kan introducere yderligere varians på grund af suboptimale kontroller. I modsætning hertil giver brug af elektroder til måling af neuronale signaler i in vitro menneskeinducerede pluripotente stamcelleneuroner (HiPSC) mere følsomme målinger og større kontrol over det eksperimentelle miljø. I dette arbejde er der udviklet et in vitro-system ved hjælp af mikroelektrodearrays (MEA'er) til måling af de elektriske reaktioner af HiPSC-neuroner efter FUS-stimulering, som vist i figur 1. Dette system giver forskere i samfundet mulighed for at overvåge neuronale reaktioner, når de varierer ultralydsparametrene (f.eks. Frekvens, burstlængde, intensitet). Derudover muliggør dette system et højt niveau af kontrol af neuronal følsomhed over for fysiske stimuli (f.eks. temperatur, tryk og kavitation)8,9, da neuronernes ionkanalfunktionalitet kan manipuleres genetisk og farmaceutisk (f.eks. ved hjælp af gadolinium til at hæmme ionkanaler)10,11,12. Denne kontrol på molekylært niveau kan bidrage til at belyse mekanismerne bag de neuromodulerende virkninger af FUS.
Protocol
1. Forberedelse af materialer
- Opsug kulturmediet, og brug det til at fylde en enkelt brønd i en 24-brønds neuronkulturplade med indlejret MEA (figur 2A). Kultur og inducer neuronerne efter den offentliggjorte protokol af Taga et al.13.
- Steriliser parafilmgrænsefladen, elastikken og FUS-keglen med gummimembranen ved hjælp af 70% ethanol i 10 minutter, og læg dem i damphætten til senere montering.
- Afgas 300 ml deioniseret vand og 50 ml koblingsgel. Centrifuger vand og gel ved 160 x g i 5 minutter for at undgå at fremkalde kavitation i koblingsmediet.
BEMÆRK: Den oprindelige kilde til HiPSC'erne er fra GM01582- og CIPS-cellelinjer. I gennemsnit kan en tæthed på 5 x 104 motorneuroner og 2,5 x 104 astrocytter pr. Brønd opnås14.
2. Tilslutning og opsætning af eksterne enheder
- Fastgør FUS-keglen til transduceren med skruer, og forsegl keglen med en fleksibel gummimembran i en ventileret steril hætte. Fyld keglen med det afgassede og deioniserede (DG-DI) vand fra trin 1.3, og sørg for, at der ikke er bobler i keglen for at undgå kavitation.
- Brug en tilpasset gevindstang til at fastgøre den 3D-printede holder til en ramme (figur 2B). Placer rammen således, at hovedet på FUS-transduceren er over det hul, der vil blive stimuleret.
- Brug en elastik til at fastgøre parafilm over brønden på MEA-pladen med 24 brønde, der indeholder mediet og HiPSC'erne.
- Forbered FUS-systemet ved at forbinde ultralydstransducerens back-end-driverelektronik, i dette tilfælde transducerens udgangseffekt (TPO; Figur 3A) til en 100-240 V stikkontakt (figur 3B, tilslutning 6) og tilslutning af det matchende netværk til TPO og FUS-transduceren (henholdsvis figur 3B, forbindelse 1 og forbindelse 2). Det matchende netværk sikrer effektiv elektrisk kobling mellem transduceren og TPO'en.
- Tilslut MEA-systemet til en stikkontakt (100-240 V) (figur 3B, tilslutning 5). Tilslut MEA-systemets synkroniseringsport til TPO'en (figur 3B, forbindelse 3). Denne forbindelse synkroniserer MEA-systemets dataindsamling med FUS-stimuleringen.
- Anbring MEA-pladen med 24 huller i MEA-systemet, og fjern låget for at muliggøre direkte kontakt mellem transduceren og brønden. Transduceren anbringes 5-10 mm over brøndpladen for at give plads til den afgassede koblingsgel som beskrevet i trin 3.2 (figur 3A og figur 2B).
3. Stimulering og neuronal signaloptagelse
- Indstil FUS-parametrene på TPO-kontrolpanelet (tabel 1).
- Påfør koblingsgelen oven på parafilmen, og sænk FUS-transduceren ned i koblingsgelen, idet du sikrer kontakt med gelen med minimale luftbobler (figur 2A).
- Start MEA-systemoptagelsen ved at klikke på Start-knappen på brugergrænsefladen.
- Start FUS sonikering ved at trykke på nederste højre knap på TPO (figur 3A, etiket 7), og vent mindst 5 minutter mellem hver runde af sonikering for at tillade neuronerne at vende tilbage til en baseline tilstand.
- Brug triggerpulsen, der genereres af FUS-systemet, til at justere FUS-stimuleringssekvensen til MEA-optagelsen (figur 3B, forbindelse 3).
4. Databehandling og -analyse
- Overfør dataene fra MEA-systemet til computeren ved hjælp af en USB-forbindelse (figur 3B, forbindelse 4). Start dette ved at klikke på panelet Eksperimentopsætning . Vælg derefter den datatype, man ønsker at optage. I dette tilfælde anbefales rå pigge. Til sidst skal du navngive filen og vælge den ønskede placering på diskdrevet for at fuldføre overførslen.
BEMÆRK: Følgende trin kan udføres ved at køre det udgivne Python-script i https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod. - Læs dataene fra hver af de 16 elektroder.
- Anvend et Butterworth-båndpasfilter med en båndbredde på 5 Hz til 3 kHz med en Butterworth-ordre på 8.
BEMÆRK: For at optimere disse værdier er det afgørende at tage højde for affyringshastigheden for de specifikke celler og antallet af involverede celler. Ved at gange disse 2 værdier kan man estimere den samlede affyringshastighed for cellepopulationen i eksperimentet. - Anvend et gaussisk filter med σ = 3 for at udjævne signalet.
BEMÆRK: Parameteren kan optimeres baseret på de anbefalede værdier fra MEA-systemet, da overdreven udjævning kan resultere i dataforvrængning efter hentning, og for lidt udjævning vil introducere uønsket støj. - Indstil en tærskel for at registrere de potentielle spidser som 5 gange standardafvigelsen for det gaussisk-udjævnede signal.
- Beregn affyringshastigheden ved at dividere antallet af pigge, der er registreret i et 50 ms-vindue på tværs af alle 16 kanaler, med vinduets længde (dvs. 50 ms). Flyt vinduet langs signalet til næste billede, og gentag beregningen af affyringshastigheden (supplerende figur 1).
- Analyser signalet ved at læse FUS sonikeringstiden fra de overførte data baseret på ændringen i fyringshastigheden forbundet med FUS.
5. Rengøring og genbrug af MEA-plader med flere brønde
- Når eksperimenterne er afsluttet, skal du bruge en pipette til forsigtigt at fjerne mediet fra hullerne i multibrøndpladen, idet du sørger for at undgå elektrodeoverfladen.
- Tilsæt 2 ml DG-DI-vand pr. brønd. Aspirer og gentag en gang.
- For at løsne celler og snavs tilsættes en blanding af 1 g enzymatisk vaskemiddel Terg-A-Zyme med 10 ml sterilt DG-DI-vand (0,3 ml pr. Brønd) til pladen. Lad det inkubere natten over ved stuetemperatur (RT).
- Den følgende dag fjernes opløsningen fra brøndene og skylles med 1 ml sterilt DG-DI-vand.
- Inkuber multibrøndpladen i 5-7 min, og aspirer. Gentag dette trin 5 gange.
- Tilsæt 0,5 ml sterilt DG-DI-vand pr. Brønd. Registrer grundlinjen for den rensede flerbrøndsplade for at validere, at MEA-pladen er ren. En renset plade skal udvise gaussiske støjmønstre med lave intensitetsværdier.
- Den rensede plade med flere brønde opbevares ved 4 °C, indtil den er klar til brug igen. Skift det vand, MEA'erne opbevares i, mindst en gang om måneden.
Representative Results
Sammenfattende præsenterer vi en protokol, der muliggør in vitro FUS neuromodulationsovervågning ved hjælp af neuroner dyrket fra HiPSC'er. Den overordnede systemplatform til stimulering af HiPSC-inducerede neuroner og registrering af de tilsvarende elektriske reaktioner til analyse er skitseret i figur 1. Denne undersøgelse fokuserer på FUS-stimulering af neuroner og registrering af de elektriske reaktioner i et MEA-system, som vist i figur 2. De perifere komponenter i FUS- og MEA-systemerne og deres forbindelser er illustreret i figur 3.
Karakteriseringen af fokuspunktet udføres forud for neuronforsøgene for at sikre, at bunden af brønden er fuldt dækket af FUS-fokuspunktet. Visualiseringen af brændpunktet på termokromiske plader, som vist i figur 4, skal udføres for at evaluere FUS-systemet. Efter karakterisering af brændpunktet skal efterbehandlingstrinnene, herunder filtrering, tærskelværdi og beregning af affyringshastigheden, udføres, og disse er opsummeret i figur 5 og figur 6. Disse trin er afgørende for at hente nyttige signaler ved at filtrere støj fra miljøet og dermed få indsigt i neuronale aktivitetsændringer forårsaget af FUS. Rasterplottene i figur 6A-B viser de registrerede spidser i hver kanal. Da hele bunden af brønden er inden for FUS transducerens brændpunkt, forventes det, at FUS ændrer affyringshastigheden på tværs af alle elektroderne. Denne ændring i affyringshastigheden visualiseres i affyringshastighedsplottet vist i figur 6C, hvilket viser, at de valgte stimuleringsparametre resulterede i en stigning i neuronal fyringshastighed. Specifikt var affyringshastigheden før FUS (dvs. baseline) 140 Hz ± 116,7 Hz, mens affyringshastigheden efter FUS var 786 Hz ± 419,4 Hz med kontinuerlig bølge FUS. Derudover viser figur 6C, hvordan ændring af FUS-parametrene (f.eks. Brug af pulserende bølge FUS i stedet for kontinuerlig bølge) kan ændre størrelsen af ændringen i affyringshastigheden samt ændre mængden af tid, før neuronerne vender tilbage til deres baseline-tilstand. Lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) forårsager ikke signifikant opvarmning af kulturer, især sammenlignet med højintensitetsfokuseret ultralyd, som har til hensigt at opnå termisk læsion. Manglen på klinisk virkningsfulde temperaturændringer understøttes af teoretiske beregninger og simuleringer (supplerende figur 2). Selv i ekstreme tilfælde af de eksperimentelle FUS-parametre, der er anført i tabel 1, kunne der kun observeres en minimal temperaturstigning på ca. 0,04 °C.
Brugen af et affyringshastighedsplot muliggør kvantificering af de neuromodulerende virkninger af FUS og kan bruges til at skelne mellem excitatoriske og hæmmende reaktioner. En væsentlig fordel ved MEA-pladen med flere brønde er, at den kan genbruges flere gange til at studere forskellige neuronale tilstande og stimuleringsparametre på en høj gennemstrømningsmåde.
Figur 1: Oversigt over in vitro-platformen til fokuseret ultralyd (FUS) neuromodulation af neuroner i en brønd og måling af deres neuronale aktivitet ved hjælp af et mikroelektrodearray. Hver elektrode (røde, grønne og blå linjer) registrerer fra en population af neuroner inden for en enkelt brønd. En behandlingsrørledning implementeres for at konvertere de rå neuronale elektriske optagelser til påvisning af neuronale fyringsmønstre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: FUS-neuromodulation med et multi-well mikroelektrodearray (MEA). (A) Skematisk opsætning af FUS-neuromodulation med et MEA med flere brønde. De akustiske bølger, der genereres af FUS-transduceren, formerer sig gennem en FUS-kegle fyldt med afgasset vand og kobles ved hjælp af ultralydgel. Parafilmen fastgøres til brønden ved hjælp af et gummibånd for at forhindre forurening. MEA-pladen sender elektriske optagelser fra neuronerne til MEA-systemet. B) Et fotografi af FUS-transduceren på multibrøndpladen i MEA-systemet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsætning af in vitro-platform . (A) Forsiden af in vitro-platformopsætningen . Transducerens udgangseffekt (TPO; venstre) bruges til at programmere FUS-parametrene. MEA-systemet (højre) registrerer elektrisk aktivitet fra neuronerne i brøndpladen, som neuromoduleres af FUS-transduceren. (B) Bagsiden af in vitro-platformopsætningen med forbindelser fra det matchende netværk (1) til TPO'en og (2) til transduceren. (3) Forbindelsen fra MEA-systemet til TPO synkroniserer dataindsamlingen. (4) Forbindelsen fra MEA-systemet til computeren med henblik på dataoverførsel. (5) Strømforbindelsen til MEA-systemet. (6) Strømforbindelsen til FUS-systemet. (7) Sonikeringsknappen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Karakterisering af FUS-transduceren. A) Et trykkort over brændpunktet ved hjælp af FUS-parametrene beskrevet i tabel 1 målt ved hjælp af AMPLITUDE-systemet15. B) Pre- og post-sonikering af et termokromisk ark placeret i bunden af en brønd ved hjælp af den eksperimentelle opsætning vist i figur 3. Det termokromiske ark ændrer farve som reaktion på temperaturændringer, hvilket giver en visuel validering af vellykket stimulering på neuronernes placering. Den maksimale rumlige maksimale pulsgennemsnitsintensitet (ISPPA) på 30 W / cm2 og kontinuerlig sonikering på 3 minutter blev justeret for at ændre den lokale temperatur drastisk for bedre visualisering af et sådant fokuspunkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Behandling af rørledning. Trin 1: Rå elektriske optagelser optages fra N = 16 kanaler. De fremtidige trin viser processen ved hjælp af kanal 16 (skitseret med rødt). Trin 2: For hver kanal anvendes et Butterworth-båndpasfilter (5 Hz til 3 kHz båndpas) efterfulgt af et Gaussisk filter (σ = 3). En tærskel er indstillet som fem gange signalets standardafvigelse inden for et 2 s vindue centreret ved starten af sonikeringen. Trin 3: Signaler over eller under tærsklen karakteriseres som pigge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Raster- og fyringshastighedsplot. (A) Raster plot af de detekterede pigge på hver kanal som funktion af sonikeringstiden. Tidspunktet for FUS-stimulering kommenteres ved hjælp af en rød linje. (B) Rasterplot af neuroner under forskellige FUS-indstillinger med kontinuerlig FUS til sammenligning. (C) Affyringshastigheden blev beregnet ved hjælp af et 50 ms skydevindue. De gennemsnitlige affyringshastigheder før og efter FUS-neuromodulationer var henholdsvis 140 Hz og 786 Hz. Med pulserende FUS var de gennemsnitlige affyringshastigheder 230 Hz og 540 Hz. En kortere aktivering og mindre hastighedsændring blev observeret at blive induceret af dette sæt varierende FUS-stimulering. Processen til beregning af affyringsprocenten er beskrevet i supplerende figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter | Værdi |
| Maks. effekt/kanal. | 1.200 W |
| Pfaktisk | 0,749 W/kanal. |
| ISPPA | 10,79 W/cm2 |
| JegSPTA | 0,05 W/cm2 |
| Burst længde | 0,100 ms |
| Frekvens | 250,00 kHz |
| Fokus | 39.800 mm |
| Periode | 20.000 ms |
| Timer | 60.000 sek. |
Tabel 1: Fokuserede ultralydsparametre (FUS) indstillet på TPO for undersøgelsen præsenteret i figur 4.
Supplerende figur 1: Forarbejdning fra rasterplottet til fyringshastigheden. Trin 1: Tæl piggene blandt alle kanalerne for at få tællenummeret inden for et givet glidende vindue. Bemærk: Her blev der valgt et større skydevindue (indstillet til 0,1 s) for bedre illustration. Trin 2: Konverter piggene pr. vindueslængde til pigge pr. sekund (multiplicer f.eks. her tællingerne med 10 for at konvertere til hertz [Hz], og divider derefter med 1.000 for at opnå værdien i kilohertz [kHz]). Trin 3: Affyringshastighedskurven erhvervet som følge heraf. Et værktøjssæt med åben kildekode er sammen med samplede data tilgængeligt på GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: K-bølgesimuleringsresultat temperaturprofil for LIFU16. Baseret på det akustiske intensitetskort vist i figur 4 antyder K-bølgesimuleringsresultatet en maksimal temperaturstigning på 0,04 °C inden for brændzonens midterområde (radius: 2 mm) ved hjælp af det ekstreme tilfælde af de eksperimentelle FUS-parametre, der er anført i tabel 1. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Dette manuskript beskriver en ny metode, der kan bruges til at registrere neuronal aktivitet i HiPSC'er under FUS-neuromodulation. Denne protokol kan generaliseres til forskellige FUS-transducere og MEA-systemer. For at replikere de resultater, der observeres med den beskrevne protokol, skal forskeren sikre, at transducerens fokuspunkt er større end arealet af bunden af MEA-brønden. Hvis der anvendes forskellige neuronale cellelinjer, skal filterparametrene desuden indstilles til det forventede frekvensrespons for cellerne i brønden. Hvis der ikke kan opnås repræsentative resultater, bør man overveje at ændre ovennævnte parametre (f.eks. sprænglængde, intensitet, driftscyklus osv.).
Selvom dette arbejde viste en stigning i affyringshastigheden efter FUS-stimulering, skal der indsamles flere data for at demonstrere repeterbarheden af dette fund, før der drages nogen konklusioner. Denne protokol arver begrænsningerne ved MEA-systemer, som typisk har svagheder, der stammer fra den direkte mikroelektrodestrømsignaloptagelse. Selvom direkte kontakt med neuronen giver bedre følsomhed, kan det ændre cellen og påvirke målenøjagtigheden. På grund af brøndenes lille størrelse inkluderer vores system desuden ikke perifert væv, som også kan spille en rolle i neuromodulation17. Dette kan begrænse anvendeligheden af konklusioner fra denne opsætning på in vivo-miljøer . For at studere mere komplekse netværksresponser skal et MEA-system med højere kanaltæthed designes til at forbedre dets følsomhed18. Flere fremtidige retninger for dette foreslåede system er blevet identificeret, herunder brug af en 3D-portal til at holde transduceren og sikre nøjagtig placering19. Yderligere forbedringer kunne foretages med hensyn til efterbehandlingsalgoritmen, herunder anvendelse af en spiking sorteringsalgoritme20 til at klassificere individuelle neuroner. Denne proces ville være gavnlig for at adskille reaktionerne fra multi-unit neuroner i fremtidige undersøgelser af mekanismerne i FUS. Vigtigst er det vigtigt at indarbejde yderligere stimuleringsmetoder, såsom kemiske, elektriske og optiske stimuli, for at belyse de underliggende mekanismer. Disse metoder kan ændre neuronale egenskaber og adfærd, såsom ved at hæmme specifikke ionkanaler15 eller ændre membranegenskaberne21. Ved at modulere de vigtigste faktorer inden for den hypotetiske signalvej kan forskere identificere bidragene fra hver faktor i kontrollerede miljøer og i sidste ende kaste lys over de komplekse interaktioner, der er på spil.
Elektrisk stimulering22 er en af de mest etablerede teknikker til neuromodulation med en lang historie med vellykkede anvendelser i kliniske og forskningsmæssige omgivelser. I modsætning hertil er FUS og optogenetik23 relativt nye modaliteter, der har fået opmærksomhed i de senere år. De største fordele ved FUS er dets ikke-invasivitet og evne til at stimulere neuroner på dybder, der kan være vanskelige at nå med andre teknikker, herunder elektrisk stimulering og optogenetik. Men ligesom optogenetik24 har FUS nogle begrænsninger relateret til modellering af bølgeudbredelsen og tilhørende neuronale reaktioner. At fange kompleksiteten af vævets heterogene akustiske egenskaber in vivo kan være udfordrende, hvilket fører til usikkerheder i trykfeltet og følgelig i neuronresponserne. Denne vanskelighed ved nøjagtigt at modellere disse egenskaber udgør en udfordring, når teknikken optimeres til specifikke applikationer i den virkelige verden. De iboende kompleksiteter understreger vigtigheden af in vitro-systemer som det i denne undersøgelse, da de muliggør direkte undersøgelse af responser under kontrollerede akustiske intensitetsforhold.
Afslutningsvis giver dette system en høj gennemstrømning, in vitro platform til undersøgelse af de neuromodulerende virkninger af FUS på humane neuroner. Med dette system kan virkningsmekanismerne for FUS udforskes ved at måle de elektriske reaktioner fra menneskelige neuroner, når de udsættes for forskellige niveauer og typer stimulering i et kontrolleret miljø. Derfor tilbyder det et værdifuldt supplerende værktøj til de menneske- og dyremodeller, der almindeligvis anvendes i marken.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt. Amir Manbachi underviser og rådgiver for BK Medical (GE Healthcare) og Neurosonics Medical og er opfinder på en række patentanmeldte FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsfinansiering fra NIH og er medejer af accelererende kombinationsterapier (herunder egenkapital eller optioner). Ashvattha Therapeutics Inc. har licenseret et af hendes patenter, og hun er aktionær for Peabody Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Amir Manbachi og Nitish Thakor anerkender finansieringsstøtte fra Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Award Contract: N660012024075. Derudover anerkender Amir Manbachi finansieringsstøtte fra Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR)'s Clinical Research Scholars Program (KL2), administreret af National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor anerkender finansieringsstøtte fra National Institutes of Health (NIH): R01 HL139158-01A1 og R01 HL071568-15.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
| MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
| Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
| CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
| Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
| HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
| Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
| Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
| Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
| Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
| Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
| Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
| Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
| Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
| Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
| Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
| Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
| Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
| Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
| Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
| Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
| Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |
References
- Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment. Frontiers in Physics. 8, 150 (2020).
- Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits. , SPIE PRESS. Bellingham. Washington, USA. (2022).
- Manbachi, A. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible. , Available from: https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83 (2021).
- Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification. Nature Communications. 13 (1), 493 (2022).
- Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. The form and function of PIEZO2. Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).
- Kim, H., et al. Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals. Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).
- Hoffman, B. U., et al. Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119 (2022).
- Tyler, W. J.
- Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron. eNeuro. 8 (2), (2021).
- Chalfie, M.
- Launay, P., et al. TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization. Cell. 109 (3), 397-407 (2002).
- Cain, S. M., Snutch, T. P. Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing. Channels. 4 (6), 475-482 (2010).
- Taga, A., et al. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Manuel, T. J., et al. Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX. Scientific Reports. 10 (1), 15347 (2020).
- Treeby, B. E., Cox, B. T. k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields. J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314 (2010).
- Akhtar, K., et al. Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease. Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).
- Smirnova, L., et al. Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish. Frontiers in Science. 1, 1017235 (2023).
- Saccher, M., et al. Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA. Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2 (2022).
- Yger, P., et al. A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo. eLife. 7, e34518 (2018).
- Babakhanian, M., et al. Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins. Scientific Reports. 8, 17250 (2018).
- Liang, R., et al. Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude). 2022 Design of Medical Devices Conference. , Minneapolis, MN, USA. (2022).
- Ko, H., Yoon, S. -P. Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review. Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).
- White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design. Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).
