Summary
Her presenterer vi en protokoll for bruk av et høykapasitetssystem som muliggjør overvåking og kvantifisering av nevromodulerende effekter av fokusert ultralyd på menneskeinduserte pluripotente stamcellenevroner (HiPSC).
Abstract
De nevromodulerende effektene av fokusert ultralyd (FUS) har blitt demonstrert i dyremodeller, og FUS har blitt brukt med hell til å behandle bevegelse og psykiatriske lidelser hos mennesker. Til tross for suksessen til FUS, er mekanismen som ligger til grunn for dens effekter på nevroner fortsatt dårlig forstått, noe som gjør behandlingsoptimalisering ved å justere FUS-parametere vanskelig. For å løse dette kunnskapsgapet studerte vi menneskelige nevroner in vitro ved bruk av nevroner dyrket fra menneskeskapte pluripotente stamceller (HiPSCs). Bruk av HiPSCs muliggjør studier av menneskespesifikk nevronatferd i både fysiologiske og patologiske tilstander. Denne rapporten presenterer en protokoll for bruk av et system med høy gjennomstrømning som muliggjør overvåking og kvantifisering av de nevromodulerende effektene av FUS på HiPSC-nevroner. Ved å variere FUS-parametrene og manipulere HiPSC-nevronene gjennom farmasøytiske og genetiske modifikasjoner, kan forskere evaluere nevrale responser og belyse de nevromodulerende effektene av FUS på HiPSC-nevroner. Denne forskningen kan ha betydelige implikasjoner for utviklingen av sikre og effektive FUS-baserte terapier for en rekke nevrologiske og psykiatriske lidelser.
Introduction
Fokusert ultralyd (FUS) er en lovende nevromodulasjonsmodalitet som muliggjør ikke-invasiv stimulering på centimeternivå dybder med sub-millimeter oppløsning 1,2,3. Til tross for disse styrkene er den kliniske effekten av FUS begrenset, delvis på grunn av mangel på kunnskap om virkningsmekanismen. Uten et solid teoretisk fundament står forskere og klinikere overfor vanskeligheter med å skreddersy terapien for å møte de spesifikke behovene til individuelle pasienter under varierende forhold. En fremtredende teori foreslått av Yoo et al.4 antyder at mekanosensitive ionkanaler er ansvarlige for nevronaktivering. Denne teorien klarer imidlertid ikke å forklare FUS-aktivering i menneskelige hjerneneuroner, som mangler disse kanalene5. Denne tvetydigheten begrenser bruken av FUS i klinikken, da det utelukker justering av FUS-parametere for å optimalisere behandlingsresultatene.
Tidligere relaterte studier har benyttet en rekke tilnærminger for å undersøke de fysiologiske mekanismene som ligger til grunn for FUS og for å bestemme de optimale stimuleringsparametrene. Et avgjørende skritt i denne prosessen innebærer overvåking av nevronresponser som tilbakemelding, som kan oppnås gjennom metoder som involverer ionportovervåking, for eksempel kalsiumionavbildning4, optisk avbildning1 og ex vivo elektrofysiologisk opptak (f.eks. elektromyografi6 eller hudnerveelektrofysiologi7). Imidlertid bruker de fleste av disse studiene ikke-menneskelige nevroner eller in vivo-tilnærminger, noe som kan introdusere ytterligere avvik på grunn av suboptimale kontroller. I motsetning til dette gir bruk av elektroder for å måle nevronsignaler i in vitro menneskeinduserte pluripotente stamcellenevroner (HiPSC) mer følsomme målinger og større kontroll over det eksperimentelle miljøet. I dette arbeidet har et in vitro-system blitt utviklet ved hjelp av mikroelektrodearrays (MEAs) for å måle de elektriske responsene til HiPSC-nevroner etter FUS-stimulering, som vist i figur 1. Dette systemet gir forskere i samfunnet mulighet til å overvåke nevronresponser når de varierer ultralydparametrene (f.eks. Frekvens, burstlengde, intensitet). I tillegg muliggjør dette systemet et høyt nivå av kontroll over nevronens følsomhet for fysiske stimuli (f.eks. temperatur, trykk og kavitasjon)8,9, da nevronenes ionkanalfunksjonalitet kan manipuleres genetisk og farmasøytisk (f.eks. ved bruk av gadolinium for å hemme ionekanaler)10,11,12. Denne molekylære nivåkontrollen kan bidra til å belyse mekanismene bak de nevromodulerende effektene av FUS.
Protocol
1. Forberedelse av materialer
- Aspirer kulturmediet, og bruk det til å fylle en enkelt brønn i en 24-brønns nevronkulturplate med innebygd MEA (figur 2A). Kultur og indusere nevronene etter den publiserte protokollen av Taga et al.13.
- Steriliser parafilmgrensesnittet, gummibåndet og FUS-kjeglen med gummimembranen med 70% etanol i 10 minutter, og plasser dem i avtrekkshetten for senere montering.
- Degas 300 ml avionisert vann og 50 ml koblingsgel. Sentrifuger vannet og gelen ved 160 x g i 5 minutter for å unngå kavitasjon i koblingsmediet.
MERK: Den opprinnelige kilden til HiPSCene er fra GM01582- og CIPS-cellelinjer. I gjennomsnitt kan en tetthet på 5 x 104 motorneuroner og 2,5 x 104 astrocytter per brønn oppnås14.
2. Tilkobling og oppsett av eksterne enheter
- Fest FUS-kjeglen til svingeren ved hjelp av skruer, og forsegl kjeglen med en fleksibel gummimembran i en ventilert steril hette. Fyll kjeglen med avgasset og avionisert (DG-DI) vann fra trinn 1.3, og sørg for fravær av bobler i kjeglen for å unngå kavitasjon.
- Bruk en tilpasset gjengestang for å feste den 3D-printede holderen til en ramme (figur 2B). Plasser rammen slik at hodet til FUS-svingeren er over brønnen som skal stimuleres.
- Bruk et gummibånd for å feste parafilm over brønnen på 24-brønns MEA-platen som inneholder mediet og HiPSCene.
- Forbered FUS-systemet ved å koble ultralydtransduserens back-end driverelektronikk, i dette tilfellet transduserens utgangseffekt (TPO; Figur 3A), til et 100-240 V strømuttak (figur 3B, tilkobling 6) og koble det tilsvarende nettverket til TPO og FUS-svingeren (henholdsvis figur 3B, tilkobling 1 og tilkobling 2). Det matchende nettverket sikrer effektiv elektrisk kobling mellom transduseren og TPO.
- Koble MEA-systemet til et strømuttak (100–240 V) (figur 3B, tilkobling 5). Koble MEA-systemsynkroniseringsporten til TPO (figur 3B, tilkobling 3). Denne tilkoblingen vil synkronisere MEA-systemets datainnsamling med FUS-stimuleringen.
- Plasser MEA-platen med 24 brønner i MEA-systemet, og fjern lokket for å muliggjøre direkte kontakt mellom svingeren og brønnen. Plasser svingeren 5-10 mm over brønnplaten for å gi plass til den avgassede koblingsgelen, som beskrevet i trinn 3.2 (figur 3A og figur 2B).
3. Stimulering og neuronal signaloppkjøp
- Angi FUS-parametrene på TPO-kontrollpanelet (tabell 1).
- Påfør koblingsgelen på toppen av parafilmen, og senk FUS-transduseren ned i koblingsgelen, og sørg for kontakt med gelen med minimale luftbobler (figur 2A).
- Start MEA-systemopptaket ved å klikke på Start-knappen på brukergrensesnittet.
- Start FUS sonikering ved å trykke nederst til høyre på TPO (figur 3A, etikett 7), og vent minst 5 minutter mellom hver runde av sonikering for å tillate nevronene å gå tilbake til en baseline tilstand.
- Bruk utløserpulsen generert av FUS-systemet til å justere FUS-stimuleringssekvensen til MEA-opptaket (figur 3B, tilkobling 3).
4. Databehandling og analyse
- Overfør dataene fra MEA-systemet til datamaskinen ved hjelp av en USB-tilkobling (figur 3B, tilkobling 4). Start dette ved å klikke på panelet Oppsett av eksperimenter . Velg deretter datatypen man ønsker å registrere. I dette tilfellet anbefales rå pigger. Til slutt, navngi filen, og velg ønsket sted i diskstasjonen for å fullføre overføringen.
MERK: Følgende trinn kan utføres ved å kjøre det frigitte Python-skriptet i https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod. - Les inn dataene fra hver av de 16 elektrodene.
- Bruk et Butterworth-båndpassfilter med en båndbredde på 5 Hz til 3 kHz med en Butterworth-rekkefølge på 8.
MERK: For å optimalisere disse verdiene er det avgjørende å ta hensyn til avfyringshastigheten til de spesifikke cellene og antall celler som er involvert. Ved å multiplisere disse 2 verdiene, kan man estimere den totale avfyringshastigheten til cellepopulasjonen i forsøket. - Påfør et Gauss-filter med σ = 3 for å jevne ut signalet.
MERK: Parameteren kan optimaliseres basert på de anbefalte verdiene fra MEA-systemet, da overdreven glatting kan føre til dataforvrengning etter innsamling, og for lite utjevning vil introdusere uønsket støy. - Sett en terskel for å oppdage potensielle topper som 5 ganger standardavviket til det Gauss-glattede signalet.
- Beregn avfyringshastigheten ved å dele antall pigger registrert i et 50 ms vindu over alle 16 kanalene med lengden på vinduet (dvs. 50 ms). Flytt vinduet langs signalet til neste bilde, og gjenta beregningen av avfyringshastigheten (tilleggsfigur 1).
- Analyser signalet ved å lese FUS-sonikeringstiden fra de overførte dataene basert på endringen i avfyringshastigheten forbundet med FUS.
5. Rengjøring og gjenbruk av MEA-plater med flere brønner
- Når forsøkene er fullført, bruk en pipette for å fjerne mediet forsiktig fra brønnene i flerbrønnsplaten, og pass på å unngå elektrodeoverflaten.
- Tilsett 2 ml DG-DI vann per brønn. Aspirer og gjenta en gang.
- For å fjerne celler og rusk, tilsett en blanding av 1 g enzymatisk vaskemiddel Terg-A-Zyme med 10 ml sterilt DG-DI-vann (0,3 ml per brønn) til platen. La det ruge over natten ved romtemperatur (RT).
- Neste dag fjernes oppløsningen fra brønnene og skylles med 1 ml sterilt DG-DI-vann.
- Inkuber flerbrønnsplaten i 5-7 min, og aspirer. Gjenta dette trinnet 5 ganger.
- Tilsett 0,5 ml sterilt DG-DI vann per brønn. Registrer grunnlinjen til den rengjorte flerbrønnsplaten for å validere at MEA-platen er ren. En rengjort plate skal vise Gaussiske støymønstre med lave intensitetsverdier.
- Oppbevar den rengjorte flerbrønnsplaten ved 4 °C til den er klar til bruk igjen. Endre vannet MEAene lagres i minst en gang per måned.
Representative Results
Oppsummert presenterer vi en protokoll som muliggjør in vitro FUS nevromodulasjonsovervåking ved bruk av nevroner dyrket fra HiPSCs. Den overordnede systemplattformen for å stimulere HiPSC-induserte nevroner og registrere de tilsvarende elektriske responsene for analyse er skissert i figur 1. Denne studien fokuserer på FUS-stimulering av nevroner og registrering av elektriske responser i et MEA-system, som vist i figur 2. De perifere komponentene i FUS- og MEA-systemene og deres forbindelser er illustrert i figur 3.
Karakteriseringen av brennpunktet utføres før nevroneksperimentene for å sikre at bunnen av brønnen er fullt dekket av FUS-fokuspunktet. Visualiseringen av brennpunktet på termokrome ark, som vist i figur 4, bør utføres for å evaluere FUS-systemet. Etter brennpunktkarakterisering skal etterbehandlingstrinnene, inkludert filtrering, terskel og beregning av avfyringshastigheten, utføres, og disse er oppsummert i figur 5 og figur 6. Disse trinnene er avgjørende for å hente nyttige signaler ved å filtrere støy fra miljøet og dermed få innsikt i nevronaktivitetsendringene forårsaket av FUS. Rasterplottene i figur 6A-B viser de oppdagede piggene i hver kanal. Siden hele bunnen av brønnen er innenfor fokuspunktet til FUS-svingeren, forventes det at FUS skal endre avfyringshastigheten over alle elektrodene. Denne endringen i avfyringshastighet er visualisert i avfyringshastighetsplottet vist i figur 6C, som viser at de valgte stimuleringsparametrene resulterte i en økning i nevronfyringshastigheten. Spesielt var avfyringshastigheten før FUS (dvs. baseline) 140 Hz ± 116,7 Hz, mens avfyringshastigheten etter FUS var 786 Hz ± 419,4 Hz med kontinuerlig bølge FUS. I tillegg viser figur 6C hvordan endring av FUS-parametrene (f.eks. Ved bruk av pulserende bølge FUS i stedet for kontinuerlig bølge) kan endre størrelsen på endringen i avfyringshastigheten, samt endre tiden før nevronene går tilbake til grunnlinjetilstanden. Lavintensitetsfokusert ultralyd (LIFU) forårsaker ikke signifikant oppvarming av kulturer, spesielt sammenlignet med høyintensitetsfokusert ultralyd, som har til hensikt å oppnå termisk lesjon. Mangelen på klinisk påvirkende temperaturendring støttes av teoretiske beregninger og simuleringer (tilleggsfigur 2). Selv i ekstreme tilfeller av de eksperimentelle FUS-parametrene oppført i tabell 1, kunne bare en minimal temperaturøkning observeres på ca. 0,04 °C.
Bruken av et avfyringshastighetsplott muliggjør kvantifisering av de nevromodulerende effektene av FUS og kan brukes til å skille mellom eksitatoriske og hemmende responser. En betydelig fordel med MEA-platen med flere brønner er at den kan gjenbrukes flere ganger for å studere varierende nevrontilstander og stimuleringsparametere på en gjennomstrømningsmåte.
Figur 1: Oversikt over in vitro-plattformen for fokusert ultralyd (FUS) nevromodulering av nevroner i en brønn og måling av deres nevronaktivitet ved hjelp av en mikroelektrodematrise. Hver elektrode (røde, grønne og blå linjer) registrerer fra en populasjon av nevroner i en enkelt brønn. En prosesseringsrørledning er implementert for å konvertere de rå nevrale elektriske opptakene til deteksjon av nevronfyringsmønstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: FUS-nevromodulering med multibrønns mikroelektrodearray (MEA). (A) Skjematisk fremstilling av oppsettet for FUS nevromodulering med en multi-brønn MEA. De akustiske bølgene som genereres av FU-transduseren forplanter seg gjennom en FUS-kjegle fylt med avgasset vann og kobles sammen ved hjelp av ultralydgel. Parafilmen festes til brønnen ved hjelp av et gummibånd for å forhindre forurensning. MEA-platen sender elektriske opptak fra nevronene til MEA-systemet. (B) Et fotografi av FUS-svingeren på flerbrønnsplaten som finnes i MEA-systemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsett av in vitro-plattformen . (A) Forsiden av in vitro-plattformoppsettet . Svingereffekten (TPO; venstre) brukes til å programmere FUS-parametrene. MEA-systemet (til høyre) registrerer elektrisk aktivitet fra nevronene i brønnplaten, som nevromoduleres av FUS-transduseren. (B) Baksiden av in vitro-plattformoppsettet med tilkoblinger fra det tilsvarende nettverket (1) til TPO og (2) til transduseren. (3) Tilkoblingen fra MEA-systemet til TPO synkroniserer datainnsamlingen. (4) Tilkoblingen fra MEA-systemet til datamaskinen for dataoverføring. (5) Strømtilkoblingen til MEA-systemet. (6) Strømtilkoblingen til FUS-systemet. (7) Sonikeringsknappen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Karakterisering av FUS-transduseren. (A) Et trykkkart over brennpunktet ved hjelp av FUS-parametrene beskrevet i tabell 1 målt med AMPLITUDE-systemet15. (B) Pre- og post-sonication av et termokromisk ark plassert i bunnen av en brønn ved hjelp av eksperimentelt oppsett vist i figur 3. Det termokromiske arket endrer farge som respons på temperaturendringer, noe som gir en visuell validering av vellykket stimulering på stedet for nevronene. Den maksimale romlige topppulsens gjennomsnittlige intensitet (ISPPA) på 30 W / cm2 og kontinuerlig sonikering på 3 minutter ble justert for å endre den lokale temperaturen drastisk for bedre visualisering av et slikt fokuspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Prosessrørledning. Trinn 1: Rå elektriske opptak fanges fra N = 16 kanaler. De fremtidige trinnene viser prosessen ved hjelp av kanal 16 (markert i rødt). Trinn 2: For hver kanal brukes et Butterworth-båndpassfilter (5 Hz til 3 kHz båndpass), etterfulgt av et Gauss-filter (σ = 3). En terskel er satt som fem ganger standardavviket til signalet innen et 2 s vindu sentrert ved starten av sonikeringen. Trinn 3: Signaler over eller under terskelen karakteriseres som pigger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Raster- og avfyringshastighetsplott. (A) Rasterplott av de oppdagede piggene ved hver kanal som en funksjon av sonikeringstiden. Tidspunktet for FUS-stimulering er kommentert ved hjelp av en rød linje. (B) Rasterplott av nevroner under forskjellige FUS-innstillinger med kontinuerlig FUS for sammenligning. (C) Avfyringshastigheten ble beregnet ved hjelp av et skyvevindu på 50 ms. Gjennomsnittlig avfyringshastighet før og etter FUS nevromodulasjoner var henholdsvis 140 Hz og 786 Hz. Med pulserende FUS var gjennomsnittlig avfyringshastighet 230 Hz og 540 Hz. En kortere aktivering og mindre hastighetsendring ble observert å være indusert av dette settet med varierende FUS-stimulering. Prosessen for beregning av avfyringshastigheten er beskrevet i tilleggsfigur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parameter | Verdi |
| Maks effekt/ch. | 1.200 W |
| Pfaktisk | 0,749 W/kanal. |
| JegSPPA | 10,79 W/cm2 |
| ISPTA | 0,05 W/cm2 |
| Burst lengde | 0,100 ms |
| Frekvens | 250,00 kHz |
| Fokus | 39.800 mm |
| Periode | 20.000 ms |
| Tidtaker | 60.000 s |
Tabell 1: Fokuserte ultralydparametere (FUS) satt på TPO for studien presentert i figur 4.
Tilleggsfigur 1: Prosessering fra rasterplottet til avfyringshastigheten. Trinn 1: Tell toppene blant alle kanalene for å få tellenummeret i et gitt skyvevindu. Merk: Her ble et større skyvevindu (satt til 0,1 s) valgt for bedre illustrasjon. Trinn 2: Konverter piggene per vinduslengde til pigger per sekund (f.eks. her, multipliser tellingene med 10 for å konvertere til hertz [Hz], og del deretter med 1,000 for å få verdien i kilohertz [kHz]). Trinn 3: Avfyringshastighetskurven oppnådd som et resultat. En verktøykasse med åpen kildekode, sammen med samplede data, er tilgjengelig på GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: K-bølge simulering resultat temperaturprofil av LIFU16. Basert på det akustiske intensitetskartet vist i figur 4, antyder K-bølgesimuleringsresultatet en maksimal temperaturøkning på 0,04 °C innenfor midtområdet av fokalsonen (radius: 2 mm) ved bruk av det ekstreme tilfellet av de eksperimentelle FUS-parametrene oppført i tabell 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver en ny metode som kan brukes til å registrere nevronaktivitet i HiPSCs under FUS-nevromodulering. Denne protokollen er generaliserbar til forskjellige FUS-transdusere og MEA-systemer. For å replikere resultatene observert med den beskrevne protokollen, bør forskeren sørge for at transduserens fokuspunkt er større enn området på bunnen av MEA-brønnen. Videre, hvis forskjellige nevroncellelinjer brukes, må filterparametrene være innstilt på den forventede frekvensresponsen for cellene i brønnen. Hvis representative resultater ikke kan oppnås, bør man vurdere å endre de nevnte parametrene (f.eks. burst lengde, intensitet, driftssyklus, etc.).
Selv om dette arbeidet viste en økning i avfyringshastigheten etter FUS-stimulering, må flere data samles inn for å demonstrere repeterbarheten av dette funnet før noen konklusjoner trekkes. Denne protokollen arver begrensningene til MEA-systemer, som vanligvis har svakheter som stammer fra signalregistreringen med direkte mikroelektrodestrøm. Selv om direkte kontakt med nevronet gir bedre følsomhet, kan det endre cellen og påvirke målenøyaktigheten. Videre, på grunn av den lille størrelsen på brønnene, inkluderer systemet vårt ikke perifert vev, som også kan spille en rolle i nevromodulering17. Dette kan begrense anvendeligheten av konklusjoner trukket fra dette oppsettet til in vivo-miljøer . For å studere mer komplekse nettverksresponser, må et MEA-system med høyere kanaltetthet utformes for å forbedre følsomheten18. Flere fremtidige retninger for dette foreslåtte systemet er identifisert, inkludert bruk av en 3D-portal for å holde transduseren og sikre nøyaktig plassering19. Ytterligere forbedringer kan gjøres angående etterbehandlingsalgoritmen, inkludert bruk av en spiking sorteringsalgoritme20 for å klassifisere individuelle nevroner. Denne prosessen vil være gunstig for å disentangling responsene til multi-enhet nevroner i fremtidige studier på mekanismene til FUS. Viktigst av alt er det viktig å innlemme ytterligere stimuleringsmodaliteter, for eksempel kjemiske, elektriske og optiske stimuli, for å belyse de underliggende mekanismene. Disse metodene kan endre nevronegenskaper og atferd, for eksempel ved å hemme spesifikke ionkanaler15 eller modifisere membranegenskapene21. Ved å modulere hovedfaktorene innenfor den hypotetiske signalveien, kan forskere identifisere bidragene fra hver faktor i kontrollerte miljøer og til slutt kaste lys over de komplekse interaksjonene som spilles.
Elektrisk stimulering22 er en av de mest etablerte teknikkene for nevromodulering, med en lang historie med vellykkede applikasjoner i kliniske og forskningsinnstillinger. I motsetning til dette er FUS og optogenetikk23 relativt nye modaliteter som har fått oppmerksomhet de siste årene. De største fordelene ved FUS er dens ikke-invasivitet og evne til å stimulere nevroner på dybder som kan være vanskelig å nå med andre teknikker, inkludert elektrisk stimulering og optogenetikk. Imidlertid, som optogenetikk24, har FUS noen begrensninger knyttet til modellering av bølgeutbredelsen og tilhørende nevronresponser. Å fange kompleksiteten til vevets heterogene akustiske egenskaper in vivo kan være utfordrende, noe som fører til usikkerhet i trykkfeltet og følgelig i nevronresponsene. Denne vanskeligheten med nøyaktig modellering av disse egenskapene gir en utfordring når man optimaliserer teknikken for spesifikke virkelige applikasjoner. Den iboende kompleksiteten understreker viktigheten av in vitro-systemer som den i denne studien, da de muliggjør direkte studier av responser under kontrollerte akustiske intensitetsforhold.
Avslutningsvis gir dette systemet en høy gjennomstrømning, in vitro-plattform for å studere nevromodulerende effekter av FUS på humane nevroner. Med dette systemet kan virkningsmekanismene til FUS utforskes ved å måle de elektriske responsene fra menneskelige nevroner når de utsettes for varierende nivåer og typer stimulering i et kontrollert miljø. Derfor tilbyr den et verdifullt tilleggsverktøy til menneske- og dyremodellene som vanligvis brukes i feltet.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt. Amir Manbachi underviser og konsulterer for BK Medical (GE Healthcare) og Neurosonics Medical og er oppfinner på en rekke patentsøkte FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsfinansiering fra NIH og er medeier i Accelerating Combination Therapies (inkludert egenkapital eller opsjoner). Ashvattha Therapeutics Inc. har lisensiert en av hennes patenter, og hun er aksjonær for Peabody Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Amir Manbachi og Nitish Thakor anerkjenner finansieringsstøtte fra Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Award Contract: N660012024075. I tillegg anerkjenner Amir Manbachi finansieringsstøtte fra Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR) Clinical Research Scholars Program (KL2), administrert av National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor anerkjenner finansieringsstøtte fra National Institutes of Health (NIH): R01 HL139158-01A1 og R01 HL071568-15.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
| MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
| Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
| CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
| Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
| HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
| Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
| Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
| Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
| Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
| Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
| Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
| Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
| Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
| Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
| Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
| Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
| Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
| Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
| Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
| Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
| Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |
References
- Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment. Frontiers in Physics. 8, 150 (2020).
- Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits. , SPIE PRESS. Bellingham. Washington, USA. (2022).
- Manbachi, A. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible. , Available from: https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83 (2021).
- Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification. Nature Communications. 13 (1), 493 (2022).
- Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. The form and function of PIEZO2. Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).
- Kim, H., et al. Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals. Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).
- Hoffman, B. U., et al. Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119 (2022).
- Tyler, W. J.
- Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron. eNeuro. 8 (2), (2021).
- Chalfie, M.
- Launay, P., et al. TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization. Cell. 109 (3), 397-407 (2002).
- Cain, S. M., Snutch, T. P. Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing. Channels. 4 (6), 475-482 (2010).
- Taga, A., et al. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Manuel, T. J., et al. Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX. Scientific Reports. 10 (1), 15347 (2020).
- Treeby, B. E., Cox, B. T. k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields. J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314 (2010).
- Akhtar, K., et al. Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease. Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).
- Smirnova, L., et al. Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish. Frontiers in Science. 1, 1017235 (2023).
- Saccher, M., et al. Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA. Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2 (2022).
- Yger, P., et al. A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo. eLife. 7, e34518 (2018).
- Babakhanian, M., et al. Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins. Scientific Reports. 8, 17250 (2018).
- Liang, R., et al. Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude). 2022 Design of Medical Devices Conference. , Minneapolis, MN, USA. (2022).
- Ko, H., Yoon, S. -P. Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review. Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).
- White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design. Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).
