Ottimizzazione della procedura di allevamento delle vespe prive di germi
Summary
Gli embrioni di vespa Nasonia sono stati sezionati dalle pupe Lucillia sericata dopo parassitazione per 12-24 ore e lavati con alcool e soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per ottenere embrioni privi di germi. Dopo aver allevato gli embrioni privi di germi e aver fornito loro il terreno di allevamento di Nasonia per crescere e svilupparsi in vitro, sono stati ottenuti adulti di Nasonia privi di germi.
Abstract
La tecnologia di allevamento asettico è un metodo di coltura di insetti in condizioni sterili o quasi sterili, che può eliminare efficacemente l’influenza di microrganismi esterni sul microbiota degli insetti e quindi promuovere il rapido sviluppo della ricerca sul microbiota degli insetti. Nasonia (genere vespa) è un insetto vespa parassita che ha molti vantaggi, come una breve durata della vita, un’elevata variazione genetica, un funzionamento facile, ecc., Ed è ampiamente usato come sistema modello di insetti. A differenza del trattamento antibiotico, che può solo ridurre il numero di microrganismi negli animali, le tecniche di allevamento asettico possono controllare sia la composizione che la quantità di microrganismi negli animali, facilitando ulteriormente lo studio delle interazioni ospite-microbo. Tuttavia, le versioni precedenti del terreno di allevamento Nasonia (NRM) presentano alcuni difetti e problemi, come un processo di preparazione complesso e dispendioso in termini di tempo, una facile contaminazione da batteri o funghi e un breve tempo di conservazione. Pertanto, questo studio risolve questi problemi ottimizzando gli strumenti utilizzati nel processo di preparazione NRM, le condizioni di stoccaggio e i rapporti dei componenti. Il mezzo ottimizzato potrebbe consentire la conservazione a -20 °C per almeno 3 mesi ed eliminare la possibilità di contaminazione da NRM durante l’alimentazione di vespe sterili. Ciò migliora ulteriormente il tasso di sopravvivenza e il livello di salute della nasonia asettica , che è importante per l’utilizzo della nasonia come modello per la ricerca microbica.
Introduction
Gli animali privi di germi sono animali che non hanno microrganismi viventi e parassiti rilevabili1. Gli embrioni privi di germi possono essere ottenuti sezionando la madre in condizioni asettiche e successivamente allevati in sistemi di barriera2. Tali animali possono essere utilizzati per studiare gli effetti dei microrganismi sugli animali, come sul microbiota intestinale, sul sistema immunitario e sul metabolismo1. Con alcuni mezzi tecnici, molti insetti e persino mammiferi possono essere resi sterili 3,4. Gli animali privi di germi hanno un ruolo unico e sono stati ampiamente utilizzati in vari aspetti della ricerca microbiologica5. Ad esempio, l’uso di vespe Nasonia prive di germi ha rivelato che i microrganismi possono aiutare gli ospiti ad adattarsi a nuovi ambienti sotto stress ambientale esogeno a lungo termine 6,7.
I parassitoidi di Nasonia sono piccole vespe parassite che iniettano le loro uova nelle pupe delle mosche4. Ci sono quattro specie conosciute di Nasonia, tra cui Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti e Nasonia oneida 8. N. vitripennis può essere trovato in tutto il mondo, mentre le altre tre specie hanno areali limitati in Nord America4. Le vespe parassitoidi della Nasonia sono considerate insetti modello ideali a causa delle loro caratteristiche, come la facile coltivazione, il breve ciclo di riproduzione, il genoma sequenziato e la diapausa a lungo termine 8,9. Possono essere utilizzati per studiare vari aspetti dell’evoluzione degli insetti, della genetica, dello sviluppo, del comportamento e della simbiosi10. Inoltre, le vespe parassitoidi Nasonia possono anche aiutare a controllare le mosche nocive in agricoltura e malattia11. Il successo della creazione di un sistema di insetti sterili comporta due fasi principali: (1) sterilizzazione degli embrioni e (2) fornitura di cibo sterile alle larve in vitro. Al fine di ottenere cibo sterile, Brucker e Bordenstein 12 hanno sviluppato il terreno di allevamento Nasonia (NRMv1) nel 2012 utilizzando sostanze chimiche come antibiotici, candeggina e siero fetale bovino per uccidere i batteri12. Tuttavia, il metodo di sterilizzazione chimica ha portato a bassi tassi di sopravvivenza ed eclosion di N. vitripennis13. Poi, nel 2016, Shropshire et al. hanno sviluppato NRMv2 utilizzando un metodo di sterilizzazione con filtro invece di un metodo di sterilizzazione chimica per eliminare i pericoli di antibiotici e altre sostanze e hanno ottimizzato il processo di allevamento13. Sfortunatamente, questo metodo presenta ancora alcuni svantaggi, come le sfide associate alla preparazione e all’utilizzo del mezzo, nonché i rischi di annegamento, sottoalimentazione o disidratazione per gli embrioni, le larve e le pupe chiuse14. Wang e Brucker14 hanno recentemente migliorato i protocolli Nasonia rearing media versione 3 (NRMv3) e GFRv2 (germ-free rearing version 2). Questi miglioramenti hanno ridotto i costi e il consumo dei supporti. Tuttavia, NRMv3 ha un tempo di conservazione molto breve ed è altamente suscettibile alla contaminazione.
Basandosi su NRMv3, il metodo di conservazione dello strumento di preparazione NRM e il rapporto dei nutrienti sono stati ottimizzati in questo studio. Questo perfezionamento metodologico facilita l’utilizzo di N. vitripennis come modello per gli studi sul microbioma. Rispetto all’NRMv3 sviluppato da Wang et al.14, lo strumento migliorato per spremere la spremitura della scarpa di Sarcophaga bullata, una delle materie prime NRM, migliora notevolmente l’efficienza produttiva del fluido tissutale della pupa S. bullata rispetto alla siringa da 60 ml con un foro inferiore utilizzata da Wang et al.14. Abbiamo aggiustato il rapporto nutritivo del NRM, che ha portato ad un certo aumento del tasso di sopravvivenza delle vespe Nasonia prive di germi senza influire sul loro tempo di sviluppo. Inoltre, l’NRM è stato confezionato in provette da centrifuga di piccola capacità (1,5 ml) e congelato in un frigorifero a -20 °C per prolungare il tempo di conservazione. Vale la pena notare che mentre abbiamo usato la mosca domestica Lucilia sericata come ospite e fonte per la preparazione NRM, questo protocollo può probabilmente essere adattato per altri ospiti Nasonia disponibili in laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con l’applicazione di tecnologie di rilevamento ad alto rendimento come la genomica e la metabolomica, i ricercatori hanno gradualmente capito che esiste un’enorme diversità genetica e complessità metabolica nel microbiota intestinale16. Questi batteri simbionti sono strettamente correlati a vari stati fisiologici o patologici, come il metabolismo nutrizionale dell’ospite, i tumori, l’immunità e l’invecchiamento attraverso complesse interazioni con l’ospite17. Tuttavia, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation of China (32270538), dal National Key R&D Program of China (2022YFF0710603), dalla Natural Science Foundation di Pechino (6222046) e dal finanziamento strategico CAS tramite lo schema di finanziamento CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) assegnato a G.H.W. Contributi dell’autore: tutti gli autori hanno sviluppato la portata e il focus della revisione e hanno contribuito alla stesura del manoscritto.
Materials
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
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