무균 말벌의 사육 절차 최적화
Summary
나소니아 말벌 배아를 12-24시간 동안 기생시킨 후 Lucillia sericata 번데기에서 해부하고 알코올과 10% 차아염소산나트륨 용액으로 세척하여 무균 배아를 얻었습니다. 무균 배아를 사육하고 시험관 내에서 성장 및 발달할 수 있도록 Nasonia 사육 배지를 공급한 후 무균 Nasonia 성인을 얻었습니다.
Abstract
무균 사육 기술은 무균 또는 거의 무균 상태에서 곤충을 배양하는 방법으로 곤충 미생물군에 대한 외부 미생물의 영향을 효과적으로 제거하여 곤충 미생물군 연구의 급속한 발전을 촉진할 수 있습니다. 나소니아(말벌속)는 기생 말벌 곤충으로 수명이 짧고 유전적 변이가 높으며 조작이 용이한 등 많은 장점을 가지고 있으며 곤충 모델 시스템으로 널리 사용됩니다. 동물의 미생물 수만 줄일 수 있는 항생제 처리와 달리 무균 사육 기술은 동물의 미생물 구성과 양을 모두 제어할 수 있어 숙주-미생물 상호 작용 연구를 더욱 용이하게 합니다. 그러나 이전 버전의 나소니아 사육 배지(NRM)는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 준비 과정, 박테리아 또는 곰팡이에 의한 쉬운 오염, 짧은 보관 시간 등 몇 가지 결함과 문제가 있습니다. 따라서 본 연구에서는 NRM 준비 과정에서 사용되는 도구, 보관 조건 및 구성 요소 비율을 최적화하여 이러한 문제를 해결합니다. 최적화된 배지는 -20°C에서 최소 3개월 동안 보관할 수 있으며 무균 말벌에게 먹이를 주는 동안 NRM 오염 가능성을 제거할 수 있습니다. 이것은 Nasonia를 미생물 연구의 모델로 사용하는 데 중요한 무균 Nasonia의 생존율과 건강 수준을 더욱 향상시킵니다.
Introduction
무균 동물은 검출 가능한 살아있는 미생물과 기생충이 없는 동물이다1. 무균 배아는 무균 상태에서 모체를 해부하여 얻을 수 있으며, 이후 장벽 시스템에서 키울 수 있다2. 이러한 동물은 장내 미생물군, 면역체계 및 신진대사와 같은 동물에 대한 미생물의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있다1. 특정 기술적 수단을 사용하면 많은 곤충과 심지어 포유류까지도 불임이 될 수 있습니다 3,4. 무균 동물은 독특한 역할을 하며 미생물학 연구의 다양한 측면에서 널리 사용되어 왔다5. 예를 들어, 무균 나소니아 말벌을 사용하면 미생물이 숙주가 장기간의 외인성 환경 스트레스 하에서 새로운 환경에 적응하는 데 도움이 될 수 있음이 밝혀졌습니다 6,7.
나소니아 기생충은 파리의 번데기에 알을 주입하는 작은 기생 말벌입니다4. 나소니아에는 나소니아 비트리페니스(Nasonia vitripennis), 나소니아 롱기코르니스(Nasonia longicornis), 나소니아 기라울티(Nasonia giraulti), 나소니아 오네이다 8(Nasonia oneida8) 등 4종이 알려져 있다. N. vitripennis는 전 세계적으로 볼 수 있지만 다른 세 종은 북미에서 제한된 범위를 가지고 있습니다4. 나소니아 기생 말벌은 쉬운 재배, 짧은 번식 주기, 서열 게놈 및 장기 휴면 8,9와 같은 특성 때문에 이상적인 모델 곤충으로 간주됩니다. 곤충의 진화, 유전학, 발달, 행동, 공생의 다양한 측면을 연구하는 데 사용할 수 있다10. 또한, 나소니아 기생 말벌은 농업과 질병에서 해로운 파리를 방제하는 데 도움이 될 수 있다11. 무균 곤충 시스템의 성공적인 확립에는 (1) 배아의 살균과 (2) 시험관 내에서 유충에게 무균 식품을 제공하는 두 가지 주요 단계가 포함됩니다. 멸균 식품을 얻기 위해 Brucker와 Bordenstein 12는 2012년에 항생제, 표백제, 소 태아 혈청과 같은 화학 물질을 사용하여 박테리아12를 죽임으로써 Nasonia 사육 배지(NRMv12)를 개발했습니다. 그러나 화학적 멸균 방법은 N. vitripennis13의 낮은 생존율과 퇴실률을 초래했다. 그 후 2016년 Shropshire et al. 항생제 및 기타 물질의 유해성을 제거하기 위해 화학적 살균법 대신 필터 살균법을 사용하여 NRMv2를 개발하고 육종 과정을 최적화했다13. 불행하게도, 이 방법은 여전히 몇 가지 단점을 가지고 있는데, 예를 들어 배지 준비 및 사용과 관련된 어려움, 배아, 유충 및 폐쇄 번데기에 대한 익사, 영양 부족 또는 탈수의 위험도 있다14. Wang과 Brucker14는 최근 Nasonia 양육 미디어 버전 3 (NRMv3)과 무균 사육 버전 2 (GFRv2) 프로토콜을 개선했습니다. 이러한 개선으로 비용과 미디어 소비가 감소했습니다. 그러나 NRMv3는 보관 시간이 매우 짧고 오염에 매우 취약합니다.
NRMv3를 기반으로 NRM 준비 도구 보관 방법과 영양소 비율이 이 연구에서 최적화되었습니다. 이러한 방법론적 개선은 N. vitripennis를 마이크로바이옴 연구의 모델로 사용하는 것을 용이하게 합니다. Wang et al.14에 의해 개발된 NRMv3와 비교하여 NRM 원료 중 하나인 Sarcophaga bullata pupa를 압착하기 위한 개선된 도구는 Wang et al.14에서 사용한 바닥 구멍이 있는 60mL 주사기에 비해 S. bullata 번데기 조직액의 생산 효율을 크게 향상시킵니다. NRM의 영양소 비율을 조정하여 발달 시간에 영향을 미치지 않으면서 무균 나소니아 말벌의 생존율을 어느 정도 증가시켰습니다. 또한, NRM을 소용량 원심분리관(1.5 mL)에 포장하고 -20°C 냉장고에서 냉동시켜 보관 시간을 연장하였다. NRM 준비를 위한 숙주 및 소스로 집파리 Lucilia sericata를 사용했지만 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 다른 Nasonia 숙주에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전체학(genomics) 및 대사체학(metabolomics)과 같은 고처리량 검출 기술을 적용하면서 연구자들은 장내 미생물군에 엄청난 유전적 다양성과 대사 복잡성이 존재한다는 사실을 점차 깨닫게 되었다16. 이러한 공생 박테리아는 숙주와의 복잡한 상호작용을 통해 숙주의 영양 대사, 종양, 면역 및 노화와 같은 다양한 생리학적 또는 병리학적 상태와 밀접하게 관련된다(17</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
자금 지원: 이 작업은 중국 국립 과학 재단(32270538), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2022YFF0710603), 베이징 자연 과학 재단(6222046) 및 CAS-CSIRO 자금 지원 계획(152111KYSB20210011)을 통한 CAS 전략적 자금 지원으로 GHW에 수여되었습니다. 저자 기여: 모든 저자는 검토의 범위와 초점을 개발하고 원고 작성에 기여했습니다.
Materials
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
