Optimaliseren van de opfokprocedure van kiemvrije wespen

Summary

Nasonia-wespenembryo’s werden na parasitering gedurende 12-24 uur ontleed uit Lucillia sericata-poppen en gewassen met alcohol en 10% natriumhypochlorietoplossing om kiemvrije embryo’s te verkrijgen. Na het grootbrengen van de kiemvrije embryo’s en het leveren van Nasonia-opfokmedium om in vitro te groeien en zich te ontwikkelen, werden kiemvrije Nasonia-volwassenen verkregen.

Abstract

Aseptische kweektechnologie is een methode om insecten te kweken onder steriele of bijna steriele omstandigheden, die de invloed van externe micro-organismen op insectenmicrobiota effectief kan elimineren en zo de snelle ontwikkeling van onderzoek naar insectenmicrobiota kan bevorderen. Nasonia (wespengeslacht) is een sluipwespinsect dat veel voordelen heeft, zoals een korte levensduur, hoge genetische variatie, eenvoudige bediening, enz., En wordt veel gebruikt als een insectenmodelsysteem. In tegenstelling tot antibioticabehandeling, die alleen het aantal micro-organismen bij dieren kan verminderen, kunnen aseptische opfoktechnieken zowel de samenstelling als de hoeveelheid micro-organismen bij dieren regelen, waardoor de studie van gastheer-microbe-interacties verder wordt vergemakkelijkt. Eerdere versies van Nasonia-opfokmedium (NRM) hebben echter enkele defecten en problemen, zoals een complex en tijdrovend bereidingsproces, eenvoudige besmetting door bacteriën of schimmels en een korte opslagtijd. Daarom lost deze studie deze problemen op door de tools te optimaliseren die worden gebruikt in het NRM-voorbereidingsproces, opslagomstandigheden en componentverhoudingen. Het geoptimaliseerde medium kan opslag bij -20 °C gedurende ten minste 3 maanden mogelijk maken en de mogelijkheid van NRM-besmetting tijdens het voeren van steriele wespen elimineren. Dit verbetert verder de overlevingskans en het gezondheidsniveau van aseptische Nasonia, wat belangrijk is voor het gebruik van Nasonia als model voor microbieel onderzoek.

Introduction

Kiemvrije dieren zijn dieren die geen detecteerbare levende micro-organismen en parasieten hebben¹. Kiemvrije embryo’s kunnen worden verkregen door de moeder onder aseptische omstandigheden te ontleden en vervolgens in barrièresystemen^op te voeden 2. Dergelijke dieren kunnen worden gebruikt om de effecten van micro-organismen op dieren te bestuderen, zoals op de darmmicrobiota, het immuunsysteem en het metabolisme¹. Met bepaalde technische middelen kunnen veel insecten en zelfs zoogdieren steriel worden gemaakt ^3,4. Kiemvrije dieren hebben een unieke rol en zijn op grote schaal gebruikt in verschillende aspecten van microbiologisch onderzoek⁵. Het gebruik van kiemvrije Nasonia-wespen heeft bijvoorbeeld aangetoond dat micro-organismen gastheren kunnen helpen zich aan te passen aan nieuwe omgevingen onder langdurige exogene omgevingsstress ^6,7.

Nasonia parasitoïden zijn kleine sluipwespen die hun eitjes injecteren in de poppen van vliegen⁴. Er zijn vier soorten Nasonia bekend, waaronder Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti en Nasonia oneida⁸. N. vitripennis is wereldwijd te vinden, terwijl de andere drie soorten een beperkt bereik hebben in Noord-Amerika⁴. Nasonia sluipwespen worden beschouwd als ideale modelinsecten vanwege hun kenmerken, zoals gemakkelijke teelt, korte voortplantingscyclus, gesequenced genoom en lange termijn diapause ^8,9. Ze kunnen worden gebruikt om verschillende aspecten van insectenevolutie, genetica, ontwikkeling, gedrag en symbiose te bestuderen¹⁰. Bovendien kunnen Nasonia-sluipwespen ook helpen bij het bestrijden van schadelijke vliegen in de landbouw en ziekten¹¹. Het succesvol opzetten van een steriel insectensysteem omvat twee belangrijke stappen: (1) sterilisatie van de embryo’s en (2) levering van steriel voedsel aan de larven in vitro. Om steriel voedsel te verkrijgen, ontwikkelden Brucker en Bordenstein 12 in 2012 Nasonia-opfokmedium (NRMv1) door chemicaliën zoals antibiotica, bleekmiddel en foetaal runderserum te gebruiken om bacteriën^{te doden 12}. De chemische sterilisatiemethode resulteerde echter in lage overlevings- en eclosiepercentages van N. vitripennis¹³. Vervolgens ontwikkelden Shropshire et al. in 2016 NRMv2 door een filtersterilisatiemethode te gebruiken in plaats van een chemische sterilisatiemethode om de gevaren van antibiotica en andere stoffen te elimineren en het fokproces te optimaliseren¹³. Helaas heeft deze methode nog steeds enkele nadelen, zoals de uitdagingen die gepaard gaan met het bereiden en gebruiken van het medium, evenals de risico’s van verdrinking, ondervoeding of uitdroging voor de embryo’s, larven en gesloten poppen¹⁴. Wang en Brucker¹⁴ hebben onlangs de Nasonia rearing media versie 3 (NRMv3) en de kiemvrije opfok versie 2 (GFRv2) protocollen verbeterd. Deze verbeteringen verminderden de kosten en het mediaverbruik. De NRMv3 heeft echter een zeer korte bewaartijd en is zeer gevoelig voor verontreiniging.

Voortbouwend op NRMv3 werden de opslagmethode van het NRM-voorbereidingsgereedschap en de nutriëntenverhouding in deze studie geoptimaliseerd. Deze methodologische verfijning vergemakkelijkt het gebruik van N. vitripennis als model voor microbioomstudies. Vergeleken met de NRMv3 ontwikkeld door Wang et al.14, verbetert het verbeterde hulpmiddel voor het knijpen van Sarcophaga bullata popa, een van de NRM-grondstoffen, de productie-efficiëntie van S. bullata-popweefselvloeistof aanzienlijk in vergelijking met de 60 ml spuit met een bodemgat die door Wang et ^al.14 wordt gebruikt. We pasten de voedingsstoffenverhouding van NRM aan, wat leidde tot een zekere toename van de overlevingskans van kiemvrije Nasonia-wespen zonder hun ontwikkelingstijd te beïnvloeden. Bovendien werd de NRM verpakt in centrifugebuizen met een kleine capaciteit (1,5 ml) en ingevroren in een koelkast van -20 °C om de opslagtijd te verlengen. Het is vermeldenswaard dat terwijl we de huisvlieg Lucilia sericata gebruikten als gastheer en bron voor NRM-voorbereiding, dit protocol waarschijnlijk kan worden aangepast voor andere Nasonia-gastheren die beschikbaar zijn in het laboratorium.

Protocol

1. Bereiding van kiemvrij Nasonia-opfokmedium  Plaats de in de handel verkrijgbare L. sericata-poppen (zie materiaaltabel) op een oppervlak dat geschikt is voor alle poppen, zoals een dienblad of een vel papier. Gooi onderontwikkelde larven, donkere oude poppen, lege popschelpen, zaagsel of andere onzuiverheden weg. Houd alleen jonge poppen die bruinrood van kleur zijn en breng ze over naar een bekerglas (ongeveer 3.000-4.000 poppen).OPME…

Representative Results

De voorbereidingsefficiëntie van NRM werd sterk verbeterd door het verbeteren van de voorbereidingstools. Bovendien werd het probleem van NRM-vervuiling in het voedingsproces geëlimineerd door de strategie en conserveringsmethode te optimaliseren. Tegelijkertijd had de aangepaste NRM een meer geschikte voedingsverhouding voor de groei en ontwikkeling van kiemvrije wespen met L. sericata als gastheren. De overlevingskans van kiemvrije wespen van larven tot poppen was significant verbeterd in vergelijking met ki…

Discussion

Met de toepassing van high-throughput detectietechnologieën zoals genomica en metabolomica, hebben onderzoekers zich geleidelijk gerealiseerd dat er een enorme genetische diversiteit en metabole complexiteit is in de darmmicrobiota¹⁶. Deze symbiotische bacteriën zijn nauw verwant aan verschillende fysiologische of pathologische toestanden, zoals het voedingsmetabolisme van de gastheer, tumoren, immuniteit en veroudering door complexe interacties met de gastheer¹⁷. Het ond…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56