無菌スズメバチの飼育手順の最適化

Summary

12-24時間寄生した後、スズメバチ胚をルシリア・セリカータ蛹から解剖し、アルコールと10%次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄して無菌胚を得た。無菌胚を飼育し、in vitroで成長・発育するためのナソニア飼育培地を供給した後、無菌ナソニア成虫を得た。

Abstract

無菌飼育技術は、無菌またはほぼ無菌の条件下で昆虫を培養する方法であり、昆虫微生物叢に対する外部微生物の影響を効果的に排除し、昆虫微生物叢研究の急速な発展を促進することができます。 ナソニア (スズメバチ属)は、寿命が短い、遺伝的変異が高い、操作が簡単など、多くの利点を持つ寄生バチ昆虫であり、昆虫モデルシステムとして広く使用されています。動物の微生物の数を減らすことしかできない抗生物質処理とは異なり、無菌飼育技術は動物の微生物の組成と量の両方を制御することができ、宿主と微生物の相互作用の研究をさらに容易にします。ただし、以前のバージョンの ナソニア 飼育培地(NRM)には、複雑で時間のかかる調製プロセス、細菌や真菌による汚染の容易さ、保管時間の短縮など、いくつかの欠陥や問題があります。そこで本研究では、NRM調製工程で使用するツール、保管条件、成分比を最適化することで、これらの課題を解決した。最適化された培地は、-20°Cで少なくとも3ヶ月間保存することができ、無菌スズメバチの給餌中にNRM汚染の可能性を排除することができます。これにより、無菌性ナソニアの生存率と健康レベルがさらに向上し 、 微生物研究のモデルとして ナソニア を使用する上で重要です。

Introduction

無菌動物とは、検出可能な生きた微生物や寄生虫を持たない動物です¹。無菌胚は、無菌条件下で母親を解剖し、続いてバリアシステム²で飼育することによって得ることができる。このような動物は、腸内細菌叢、免疫系、代謝など、動物に対する微生物の影響を研究するために使用できます¹。特定の技術的手段により、多くの昆虫や哺乳類でさえも無菌にすることができます^3,4。無菌動物は独自の役割を持ち、微生物学研究のさまざまな側面で広く使用されています⁵。たとえば、無菌のナソニアバチの使用は、微生物が長期的な外因性環境ストレスの下で宿主が新しい環境に適応するのを助けることができることを明らかにしました^6,7。

ナソニア寄生生物は、ハエの蛹に卵を注入する小さな寄生バチです⁴。ナソニアには、ナソニア・ビトリペンニス、ナソニア・ロンギコルニス、ナソニア・ジローティ、ナソニア・オナイダ⁸の4種が知られています。N. vitripennisは世界中で見られますが、他の3種は北米では範囲が限られています⁴。 ナソニア寄生バチは、栽培が容易で、繁殖周期が短く、ゲノム配列が配列決定され、休眠が長期であるなどの特徴から、理想的なモデル昆虫と見なされています^8,9。それらは、昆虫の進化、遺伝学、発生、行動、および共生のさまざまな側面を研究するために使用できます¹⁰。さらに、ナソニア寄生バチは、農業や病気における有害なハエを制御するのにも役立ちます¹¹。無菌昆虫系の確立を成功させるには、(1)胚の滅菌と(2)in vitroでの幼虫への無菌餌の提供という2つの主要なステップが含まれます。無菌食品を得るために、ブルッカーとボーデンシュタイン¹²は、抗生物質、漂白剤、ウシ胎児血清などの化学物質を使用して細菌¹²を殺すことにより、2012年にナソニア飼育培地(NRMv1)を開発しました。しかし、化学滅菌法は、N. vitripennis¹³の生存率と溶出率が低くなりました。その後、2016年にShropshire et al.は、抗生物質やその他の物質の危険性を排除するために、化学滅菌法の代わりにフィルター滅菌法を使用してNRMv2を開発し、育種プロセスを最適化しました¹³。残念ながら、この方法には、培地の調製と使用に関連する課題や、胚、幼虫、閉鎖蛹の溺死、摂食不足、脱水のリスクなど、依然としていくつかの欠点があります¹⁴。WangとBrucker¹⁴は最近、Nasonia飼育培地バージョン3(NRMv3)と無菌飼育バージョン2(GFRv2)プロトコルを改善しました。これらの改善により、コストとメディア消費量が削減されました。ただし、NRMv3は保管時間が非常に短く、汚染の影響を非常に受けやすいです。

NRMv3に基づいて、この研究ではNRM調製ツールの保存方法と栄養素比が最適化されました。この方法論の改良により、微生物叢研究のモデルとしてN.ビトリペンニスを使用することが容易になります。Wangらが開発したNRMv3と比較して14、NRM原料の1つであるサルコファガブラタ蛹を圧搾するための改良ツールは、Wangらが使用した底穴のある60mLシリンジと比較して、S. bullata蛹組織液の生産効率を大幅に向上させます¹⁴。NRMの栄養比を調整したところ、無菌ナソニアバチの発育時間に影響を与えることなく、生存率が一定の増加につながりました。さらに、NRMを小容量遠沈管(1.5mL)に詰め、-20°Cの冷蔵庫で凍結して保存時間を延長しました。NRM調製の宿主および供給源としてイエバエのLucilia sericataを使用したが、このプロトコルは実験室で利用可能な他のNasonia宿主に適応できる可能性が高いことは注目に値する。

Protocol

1.無菌 ナソニア 飼育培地の調製 市販の L. sericata 蛹( 材料表を参照)を、トレイや紙など、すべての蛹を収容できる表面に置きます。未発達の幼虫、暗い古い蛹、空の蛹の殻、おがくず、またはその他の不純物を捨てます。茶色がかった赤色の若い蛹だけを飼い、ビーカー(約3,000〜4,000匹の蛹)に移します。注:多くの実験を行った後…

Representative Results

NRMの調製効率は、調製ツールの改善により大幅に改善されました。さらに、給餌プロセスにおけるNRM汚染の問題は、戦略と保存方法を最適化することによって排除されました。同時に、調整されたNRMは、 L. sericata を宿主とする無菌ハチの成長と発達により適した栄養比を示しました。幼虫から蛹までの無菌バチの生存率は、GFRv2を用いてNRMv3で飼育した無菌バチと比較して有意に改善?…

Discussion

ゲノミクスやメタボロミクスなどのハイスループット検出技術の適用により、研究者は腸内細菌叢に大きな遺伝的多様性と代謝の複雑さがあることに徐々に気づきました¹⁶。これらの共生細菌は、宿主¹⁷との複雑な相互作用を通じて、宿主の栄養代謝、腫瘍、免疫、老化などの様々な生理学的または病理学的状態に密接に関連している。しかし、宿主におけ…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56