Otimizando o procedimento de criação de vespas livres de germes

Summary

Embriões de vespas Nasonia foram dissecados de pupas de Lucillia sericata após parasitização por 12-24 h e lavados com álcool e solução de hipoclorito de sódio a 10% para obtenção de embriões livres de germes. Após a criação dos embriões livres de germes e fornecimento de meio de criação de Nasonia para crescimento e desenvolvimento in vitro, adultos de Nasonia livres de germes foram obtidos.

Abstract

A tecnologia de criação asséptica é um método de cultivo de insetos em condições estéreis ou quase estéreis, que pode efetivamente eliminar a influência de microrganismos externos na microbiota de insetos e, assim, promover o rápido desenvolvimento da pesquisa da microbiota de insetos. Nasonia (gênero vespa) é um inseto vespa parasita que tem muitas vantagens, como uma vida curta, alta variação genética, fácil operação, etc., e é amplamente utilizado como um sistema modelo de insetos. Ao contrário do tratamento com antibióticos, que só pode reduzir o número de microrganismos em animais, as técnicas de criação asséptica podem controlar tanto a composição quanto a quantidade de microrganismos em animais, facilitando ainda mais o estudo das interações hospedeiro-micróbio. No entanto, as versões anteriores do meio de criação Nasonia (NRM) têm alguns defeitos e problemas, como um processo de preparação complexo e demorado, fácil contaminação por bactérias ou fungos e curto tempo de armazenamento. Portanto, este estudo resolve esses problemas otimizando as ferramentas usadas no processo de preparação da NRM, as condições de armazenamento e as proporções de componentes. O meio otimizado pode permitir o armazenamento a -20 °C por pelo menos 3 meses e eliminar a possibilidade de contaminação por NRM durante a alimentação de vespas estéreis. Isso melhora ainda mais a taxa de sobrevivência e o nível de saúde da nasonia asséptica, que é importante para o uso de Nasonia como um modelo para a pesquisa microbiana.

Introduction

Animais livres de germes são animais que não apresentam microrganismos vivos e parasitas detectáveis¹. Embriões livres de germes podem ser obtidos dissecando a mãe em condições assépticas e posteriormente criados em sistemas de barreira². Esses animais podem ser utilizados para estudar os efeitos de microrganismos em animais, como na microbiota intestinal, no sistema imunológico e no metabolismo¹. Com certos meios técnicos, muitos insetos e até mamíferos podem se tornar estéreis ^3,4. Animais livres de germes têm um papel único e têm sido amplamente utilizados em vários aspectos da pesquisa em microbiologia⁵. Por exemplo, o uso de vespas Nasonia livres de germes revelou que microrganismos podem ajudar os hospedeiros a se adaptarem a novos ambientes sob estresse ambiental exógeno de longo prazo ^6,7.

Nasonia parasitoides são pequenas vespas parasitas que injetam seus ovos nas pupas de moscas⁴. Existem quatro espécies conhecidas de Nasonia, incluindo Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti e Nasonia oneida⁸. N. vitripennis pode ser encontrada em todo o mundo, enquanto as outras três espécies têm distribuição limitada na América do^Norte4. As vespas parasitoides Nasonia são consideradas insetos modelo ideal devido às suas características, como fácil cultivo, ciclo reprodutivo curto, genoma sequenciado e diapausa de longa duração ^8,9. Eles podem ser usados para estudar vários aspectos da evolução de insetos, genética, desenvolvimento, comportamento e simbiose¹⁰. Além disso, vespas parasitoides Nasonia também podem ajudar a controlar moscas nocivas na agricultura e doenças¹¹. O estabelecimento bem-sucedido de um sistema de insetos estéreis envolve duas etapas principais: (1) esterilização dos embriões e (2) fornecimento de alimento estéril para as larvas in vitro. Para obter alimentos estéreis, Brucker e Bordenstein 12 desenvolveram, em 2012, o meio de criação de Nasonia (NRMv1), utilizando produtos químicos como antibióticos, água sanitária e soro fetal bovino para matar bactérias¹². Entretanto, o método de esterilização química resultou em baixas taxas de sobrevivência e eclosão de N. vitripennis¹³. Então, em 2016, Shropshire e col. desenvolveram a NRMv2 usando um método de esterilização por filtro em vez de um método de esterilização química para eliminar os perigos de antibióticos e outras substâncias, e otimizaram o processo de melhoramento¹³. Infelizmente, esse método ainda apresenta algumas desvantagens, como os desafios associados ao preparo e uso do meio, bem como os riscos de afogamento, subalimentação ou desidratação para os embriões, larvas e pupas fechadas¹⁴. Wang e Brucker¹⁴ recentemente melhoraram os protocolos de criação de Nasonia versão 3 (NRMv3) e de criação livre de germes versão 2 (GFRv2). Essas melhorias reduziram o custo e o consumo de mídia. No entanto, o NRMv3 tem um tempo de armazenamento muito curto e é altamente suscetível à contaminação.

Com base na NRMv3, o método de armazenamento da ferramenta de preparo NRM e a proporção de nutrientes foram otimizados neste estudo. Esse refinamento metodológico facilita o uso de N. vitripennis como modelo para estudos de microbioma. Em comparação com a NRMv3 desenvolvida por Wang et al.14, a ferramenta aprimorada para espremer a pupa de Sarcophaga bullata, uma das matérias-primas da NRM, aumenta consideravelmente a eficiência de produção do fluido tecidual de pupa de S. bullata em comparação com a seringa de 60 mL com orifício de fundo usada por Wang et ^al.14. Nós ajustamos a proporção de nutrientes da NRM, o que levou a um certo aumento na taxa de sobrevivência de vespas Nasonia livres de germes sem afetar seu tempo de desenvolvimento. Além disso, o MRN foi acondicionado em tubos de centrífuga de pequena capacidade (1,5 mL) e congelado em refrigerador de -20 °C para prolongar o tempo de armazenamento. Vale a pena notar que, embora tenhamos usado a mosca doméstica Lucilia sericata como hospedeiro e fonte para a preparação da NRM, este protocolo provavelmente pode ser adaptado para outros hospedeiros de Nasonia que estão disponíveis no laboratório.

Protocol

1. Preparação de meio de criação de Nasonia livre de germes  Coloque as pupas de L. sericata disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais) em uma superfície que possa acomodar todas as pupas, como uma bandeja ou uma folha de papel. Descarte quaisquer larvas subdesenvolvidas, pupas velhas escuras, conchas de pupas vazias, serragem ou outras impurezas. Mantenha apenas pupas jovens de cor vermelho-acastanhada e transfira-as para um …

Representative Results

A eficiência de preparação do NRM foi muito melhorada através da melhoria das ferramentas de preparação. Além disso, o problema da poluição por NRM no processo de alimentação foi eliminado otimizando a estratégia e o método de preservação. Ao mesmo tempo, o MRN ajustado apresentou uma razão nutricional mais adequada para o crescimento e desenvolvimento de vespas livres de germes com L. sericata como hospedeiros. A taxa de sobrevivência de vespas livres de germes de larvas para pupas foi signific…

Discussion

Com a aplicação de tecnologias de detecção de alto rendimento, como genômica e metabolômica, os pesquisadores gradualmente perceberam que há uma enorme diversidade genética e complexidade metabólica na microbiota intestinal¹⁶. Essas bactérias simbióticas estão intimamente relacionadas a vários estados fisiológicos ou patológicos, como metabolismo nutricional do hospedeiro, tumores, imunidade e envelhecimento por meio de interações complexas com o hospedeiro^17</su…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56