Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme und Visualisierung von elasmoiden Schuppen von Zebrafischen während der in vivo Regeneration. Darüber hinaus wird die ex vivo Kultur dieser Schuppen für bis zu 7 Tage nach der Ernte vorgestellt.
Abstract
Skeletterkrankungen sind in ihrer Ätiologie oft komplex und betreffen Millionen von Menschen weltweit. Aufgrund der alternden Bevölkerung besteht ein Bedarf an neuen Therapeutika, die die Gesundheitssysteme entlasten könnten. Da diese Krankheiten komplex sind, ist es schwierig und teuer, die Pathophysiologie der Knochen im Labor genau zu modellieren. Die Herausforderung für das Feld besteht darin, eine kostengünstige, biologisch relevante Plattform für die Modellierung von Knochenerkrankungen zu etablieren, mit der potenzielle therapeutische Wirkstoffe getestet werden können. Eine solche Plattform sollte im Idealfall eine dynamische Visualisierung des Zellverhaltens von knochenaufbauenden Osteoblasten und knochenabbauenden Osteoklasten ermöglichen, die in ihrer mineralisierten Matrixumgebung agieren. Zebrafische werden zunehmend als Modelle verwendet, da genetische Werkzeuge, einschließlich transgener Reporterlinien, zur Verfügung stehen und einige Skelettgewebe (einschließlich der Schuppen) bis ins Erwachsenenalter durchscheinend bleiben, was dynamische Bildgebungsoptionen ermöglicht. Da Zebrafischschuppen sowohl Osteoblasten als auch Osteoklasten haben und sehr häufig vorhanden sind, bieten sie eine leicht zugängliche und reichlich verfügbare Ressource unabhängiger Knocheneinheiten. Darüber hinaus regenerieren sich die Schuppen der erwachsenen Zebrafische nach der Entfernung vollständig und bieten somit eine Möglichkeit, das raumzeitliche Wachstum von mineralisiertem Gewebe in vivo zu untersuchen.Hier beschreiben wir die Protokolle für die Ernte und die Verfolgung der Regeneration der Schuppen. Schließlich wird auch ein Protokoll für eine stabile Kultur von Schuppen ex vivo für eine Woche und nach der Heilungsreaktion nach kontrollierter Schädigung der mineralisierten Matrix der Schuppen im Laufe der Zeit vorgestellt.
Introduction
Knochen ist ein hartes Bindegewebe, das einen großen Teil des Skeletts bildet, die Fortbewegung ermöglicht und als Mineralstoffreserve im Körper fungiert. Um einen gesunden Knochen zu erhalten, ist ein hervorragendes Gleichgewicht zwischen Knochenauf- und -abbau durch die gekoppelte Aktivität von Osteoblasten (die anabol sind) und Osteoklasten (die Knochen resorbieren) unerlässlich. Dieses Gleichgewicht wird durch Alterung oder hormonelles Ungleichgewicht gestört, was häufig zu Knochenbrüchigkeitserkrankungen wie Osteoporose führt1. Obwohl bestehende Medikamente zur Behandlung von Knochenbrüchigkeitserkrankungen zugelassen sind, haben viele von ihnen Nebenwirkungen. Daher besteht ein Bedarf an neuen Therapeutika1. Daher besteht nach wie vor ein Bedarf an reichlich biologisch relevantem Knochengewebe, das zur Erprobung potenzieller therapeutischer Substanzen verwendet werden kann.
Traditionell werden Nagetiermodelle und Zellkultursysteme verwendet, um die Knochenbiologie zu untersuchen. Zebrafische werden jedoch immer mehr zu einem weiteren Modell der Wahl. Obwohl es sich nicht um ein Säugetiersystem handelt, bieten Zebrafische gegenüber Nagetieren bestimmte Vorteile für die Knochenforschung. Dazu gehören ihre Fruchtbarkeit und die Transluzenz der Larven; Selbst im Erwachsenenalter bleiben einige Skelettgewebe, einschließlich der Schuppen und der Flossen, durchscheinend, was eine hochauflösende In-vivo-Bildgebung und die erhöhte Verfügbarkeit von Skelettmutanten ermöglicht 2,3. Sowohl die Flossen als auch die Schuppen von Zebrafischen sind nach der Entnahme in der Lage, sich vollständig zu regenerieren. Die Skelettregeneration und die Reparatur von Verletzungen von Zebrafischflossen wurden ausführlich untersucht 4,5, während Zebrafischschuppen ein neueres Knochenmodell in diesem Bereich sind, aber Vorteile für die Ex-vivo-Kultur bieten6.
Schuppen sind sehr häufig, mit mindestens 300 Schuppen an jedem Fisch, die als Schutzhülle für die Fische dienen. Jede Schuppe ist eine kleine mineralisierte Platte, die aus knochenbildenden Osteoblasten und knochenresorbierenden Osteoklasten einer kollagenreichen Skelettmatrix besteht7. Der Ossifikationsprozess sowohl von Zebrafischschuppen als auch von menschlichen Knochen erfordert die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen zu Osteoblasten, um die mineralisierte Matrix zu bilden. Zebrafischschuppen bieten einen großen Vorteil für die Skelettforschung mit ihrer starken Regenerationsfähigkeit, mit der die Knochenregeneration und -reparatur untersucht werden kann. Trotz des Vorhandenseins von Osteoblasten und Osteoklasten fehlen den Zebrafischschuppen jedoch Osteozyten, die für den menschlichen Knochenumbau und die Mechanosensibilität wichtig sind. Durch die oberflächliche Lage der Schuppen lassen sie sich leicht mit einer Pinzette entfernen. Nach dem Entfernen der Skala kommt es zu einer Kaskade von Ereignissen, und die Regeneration der Skala beginnt 8,9. Es stehen verschiedene Färbe- und Bildgebungsoptionen zur Verfügung, um die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten und die Mineralisierung der Schuppen zu visualisieren, wie in Abbildung 1 dargestellt. Darüber hinaus bedeutet die Verfügbarkeit vieler relevanter fluoreszierender transgener Reporterlinien von Zebrafischen, dass die Zelldynamik während der Regeneration sichtbar gemachtwerden kann 7,10,11. Dieser Prozess ermöglicht es, ein besseres Verständnis der De-novo-Knochenbildung zu erlangen, indem man die frühen Muster der Schuppenregeneration an der Flanke des Fisches beobachtet, um die Morphologie, die zelluläre Aktivität und die genetischen Profile dieser regenerierten Schuppen zu untersuchen. Die Biologie der Kalkbildung und -regeneration ist gut charakterisiert. Wichtig ist, dass Schuppen eine gute Vorhersagefähigkeit für therapeutisch relevante Verbindungen12 aufweisen können und die Behandlung von Fischen mit Glukokortikoiden zu einer Schuppe führt, die sich regeneriert, um osteoporotische Phänotypen zu zeigen13. Das Transkriptom der regenerierenden Schuppen zeigt, dass Gene, die bei der Schuppenregeneration aktiviert werden, für Gene angereichert sind, die mit menschlichen Skeletterkrankungen in Verbindung gebracht werden, was ihre Relevanz als Modellsystem weiter unterstreicht 6,14.
Schließlich können diese Schuppen bis zu 7 Tage lang ex vivo kultiviert werden. Im Vergleich zu Zelllinienkulturen, die in der Regel aus einem einzigen Zelltyp bestehen, bietet die Ex-vivo-Kultur Möglichkeiten für In-vitro-Knochenstudien in ihrer natürlichen Umgebung, die sowohl Osteoblasten als auch Osteoklasten mit ihrer natürlichen extrazellulären Matrixenthält 8,12,15,16.
Die Skalenkultur ermöglicht es uns auch, Wirkstoff-Screenings für neuartige osteoanabole Ziele durchzuführen. Die Fülle an Schuppen auf dem Fisch bedeutet, dass man mindestens zwei Platten der 96-Well-Platte von nur einem einzigen Fisch füllen kann, was ein Compound-Screening in einem Multiwell-Format ermöglicht, bei dem jedes einzelne Well eine Schuppe zusammen mit seiner natürlichen Zellnische enthält. Da die Schuppen dünn sind, ist die Arzneimittelabsorption außerdem vorhersehbar12. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Elasmoide-Schuppen des Zebrafisches ein großes Potenzial in der Skelettforschung haben und uns helfen können, mehr Einblick in die zellulären Vorgänge während der Knochenbildung und -reparatur zu erhalten. Hier beschreiben wir Protokolle für die Ernte von Schuppen, um die Regeneration in vivo zu verfolgen und die Schuppen ex vivo zu kultivieren.
Protocol
Die Universitäre Tierwissenschaftliche Einheit (ASU) ist für die Zebrafischpflege unter Anleitung der Zebrafischhaltungsrichtlinien zuständig. Alle Verfahren, einschließlich der Entnahme von Kalkablagerungen, der Färbung lebender Knochen und der Lebendbildgebung, wurden genehmigt und im Rahmen einer Projektlizenz (PP4700996 des britischen Innenministeriums durchgeführt. Für dieses Manuskript wurden junge adulte transgene Zebrafische aus der sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]-Linie verwendet17. Unter den Fischen befanden sich sowohl Männchen als auch Weibchen im Alter von 4 Monaten.
1. In-vivo-Kalkregeneration
- Bevor Sie mit dem Experiment zur Regeneration von Schuppen beginnen, setzen Sie Zebrafische aus ihren Hauptaquarien in einzelne Becken um (siehe Materialtabelle) und kehren Sie nach der Bildgebung während des gesamten Experiments zu diesen einzelnen Becken zurück, wie in Abbildung 2 dargestellt. Damit soll sichergestellt werden, dass es sich bei allen regenerierenden Schuppen um diejenigen handelt, die für das Experiment geerntet wurden. Die Gruppenhaltung kann zu sporadischem Schuppenverlust durch Verletzungen durch andere Fische führen.
HINWEIS: Die Fische werden einzeln platziert, um Kämpfe und anschließende Schuppenverluste zwischen den Fischen zu vermeiden. - Zeichnen Sie Informationen für jeden Versuchsfisch (d. h. Genotyp, Alter und Geschlecht) gemäß dem Versuchsdesign auf. Verwenden Sie eine Kamera (Smartphone-Kameras funktionieren gut), um ein Bild von jedem Fisch neben einem Lineal aufzunehmen, um die Größe/Länge und den Gesundheitszustand der Fische aufzuzeichnen.
- Am Tag des Experiments wird der Zebrafisch mit 0,05 % (v/v) Tricain-Methansulfonat (MS222, siehe Materialtabelle) durch Eintauchen betäubt und dann mit einem feuchten Tuch auf eine Petrischale gelegt, um eine Bewegung des Fisches während der Bildgebung oder Ernte zu vermeiden.
- Lege den Fisch auf die Seite (normalerweise wird hier die linke Flanke verwendet, um die Konsistenz zu gewährleisten). Durchführung einer Flankenbildgebung mit einem Stereomikroskop mit geeigneter Vergrößerung (typischerweise wurden für die vorliegende Studie 2x, 4x und/oder 6,3x und 8x verwendet, um sowohl den gesamten regenerierenden Bereich als auch den vergrößerten Bereich für eine detaillierte Beobachtung zu erfassen).
ANMERKUNG: Die Zeitpunkte der Flankenbildgebung hängen vom Versuchszweck und der Wahl der transgenen Reporter ab. Um beispielsweise Osteoblasten während der Kalkregeneration zu verfolgen, werden folgende Zeitpunkte empfohlen: Tag 0 (ontogenetisch), 2 Tage nach der Ernte (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Um die Auswirkungen einer wiederholten Anästhesie zu reduzieren, beschränken Sie die Bildgebungszeitpunkte auf die wenigsten, die für das Experiment erforderlich sind. - Entnehmen Sie Schuppen mit einer feinen Pinzette und Pinzette unter dem Stereomikroskop. Geben Sie die geernteten Schuppen in Sammelröhrchen, um sie später zu färben.
HINWEIS: Die maximale Anzahl von Schuppen, die geerntet werden können, hängt von den örtlichen ethischen Genehmigungen ab. In der Regel ernten wir etwa 20 bis 30 Schuppen und sammeln sie in einzelnen Sammelröhrchen für die spätere Schuppenfärbung, wie z. B. ALP, von Kossa14. - Sammeln Sie die Waage entweder in einem 1,5-ml- oder 2-ml-Sammelröhrchen. Dies hängt von der verwendeten Färbetechnik ab.
- Sowohl für die ALP- als auch für die von-Kossa-Färbung werden die Schuppen in Sammelröhrchen mit deionisiertem Wasser überführt, während die Schuppen für die TRAP-Färbung oder Immunhistochemie in Sammelröhrchen mit 4 % PFA (Fixierlösung) überführt werden.
- Optional: Bevor Sie die Schuppen in die Röhrchen umfüllen, nehmen Sie bei Bedarf Bilder von einzelnen geernteten Schuppen auf.
HINWEIS: Empfohlene Zeitpunkte für die Skalenernte sind Tag 0 (ontogenetisch), Tag 10 und Tag 21 (regenerierte Schuppen).
2. Färbung von lebenden Knochen
HINWEIS: Die Färbung von lebenden Skeletten kann entweder durchgeführt werden, wenn Versuchsfische nicht transgen für fluoreszierende Reporter sind, oder wenn einfarbige transgene Reporter getragen werden. Die Lebendfärbung kann verwendet werden, um transgene Organismen zu ergänzen. Zum Beispiel könnte man einen Osteoblastenreporter wie SP7/OSX in einer Farbe (z. B. GFP) verwenden und dann den Knochen mit Alizarinrot (AR) rot färben. AR und Calceingrün können für denselben Fisch zusammen verwendet werden; In diesem Szenario wird AR verwendet, um ursprünglichen oder ontogenetischen Knochen zu markieren, indem es an die mineralisierte Matrix des gealterten Knochens bindet, und Calcein bindet an Kalziumionen, die im neu gebildeten Knochen reichlich vorhanden sind. Zum Beispiel kann bei der Färbung einer ontogenetischen Skala AR visualisiert werden, aber Calceingrün kann fehlen oder minimal sein, da ontogenetische Skalen nur ein geringes Maß an Knochenneubildung aufweisen.
- Führen Sie eine Live-Färbung von Alizarinrot (AR) durch.
- Bereiten Sie eine Flasche mit 2x AR-Färbelösung vor, indem Sie 0,5 % (w/v) Alizarin-Stammlösung (10 ml) mit 10 ml 1 M Stamm-HEPES (Endkonzentration, 10 mM) mischen (siehe Materialtabelle).
- Bis zu 1 l mit 1x Danieau-Lösung auffüllen (siehe Materialtabelle). Die Lösung muss dunkel aufbewahrt oder mit Folie eingewickelt werden.
- Bringen Sie am Tag des Experiments 500 ml 2x AR-Lösung in die Zebrafischanlage und fügen Sie 500 ml Systemwasser (aus dem Aquarium) hinzu, um 1x funktionierende AR-Lösung herzustellen.
- Fische aus ihren Aquarien in eine 1x funktionierende AR-Färbelösung geben und 15-20 Minuten einwirken lassen. Waschen Sie den überschüssigen Fleck auf dem Fisch mit 15 Minuten "Waschen" im Systemwasser ab.
- Führen Sie eine Live-Calcein-Grün-Färbung durch.
- Bereiten Sie eine Flasche mit 2x Calceingrün-Färbelösung vor, indem Sie 45 mg Calcein-Pulver in 900 ml 1x Danieau-Lösung geben (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie einen Magnetrührer, damit sich das Pulver vollständig auflösen kann.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein. Dies ist die 2x vorrätige Calcein Green Lösung. Die Lösung kann im Dunkeln/mit Folie eingewickelt bis zu 1 Monat gelagert werden.
- Bringen Sie am Tag des Experiments 500 ml 2x Calcein Green-Lösung in die Zebrafischanlage und fügen Sie 500 ml Systemwasser hinzu, um 1x funktionierende Calcein Green-Lösung herzustellen. Es wird empfohlen, eine frisch hergestellte Calcein-Färbelösung zu verwenden.
- Fische aus ihren Aquarien in 1x funktionierende Calceingrün-Färbelösung geben und 1-2 h einwirken lassen. Je nach Größe des Fisches kann eine längere Färbezeit erforderlich sein.
- Waschen Sie den überschüssigen Fleck auf dem Fisch ab, indem Sie ihn 15 Minuten lang im Systemwasser "waschen".
HINWEIS: Stellen Sie sich den mit Calcein Grün gefärbten Fisch so schnell wie möglich vor, da dieser Fleck in wenigen Stunden verblassen wird.
3. Alkalische Phosphatase (ALP)-Färbung auf Skalen nach der Ernte
- Bereiten Sie die ALP-Färbelösung vor, indem Sie 100 mM Tris (pH 9,5 mit HCl) mit 100 mM NaCl und 50 mM MgCl2 mischen.
- Verwenden Sie handelsübliche NBT/BCIP-Stammlösung (siehe Materialtabelle).
- Füllen Sie die Schuppen in Röhrchen mit deionisiertem Wasser.
- Spülen Sie die Schuppen 5 Minuten lang in ALP-Färbelösung.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine funktionierende Färbelösung vor, indem Sie 200 μl der NBT/BCIP-Lösung zu 10 ml ALP-Färbepuffer hinzufügen. Diese muss zum Zeitpunkt der Färbung frisch zubereitet werden.
- Färben Sie die Schuppen 15 Minuten lang mit der funktionierenden ALP-Färbelösung.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Waage mit deionisiertem Wasser abspülen.
4. Von-KOSSA-Färbung auf Schuppen nach der Ernte
- Bereiten Sie 5%ige (w/v) Silbernitratlösung vor.
- Bereiten Sie 5%ige (w/v) Natriumthiosulfatlösung vor.
- Die geernteten Schuppen in Röhrchen mit deionisiertem Wasser überführen.
- Die Schuppen in der Silbernitratlösung 40 min unter starkem Licht inkubieren.
HINWEIS: Tragen Sie PSA (persönliche Schutzausrüstung), da Silbernitrat einen Fleck hinterlässt, der schwer zu entfernen ist. - Waschen Sie die Waage zweimal 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser.
HINWEIS: Silbernitratabfälle müssen gemäß den örtlichen Richtlinien gesammelt und entsorgt werden. - Inkubieren Sie die Waage 5 Minuten lang in Natriumthiosulfat.
- Waschen Sie die Waage zweimal 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser.
5. Kolorimetrische TRAP-Färbung
HINWEIS: Für die detaillierte Vorgehensweise verweisen wir auf die zuvor veröffentlichte Arbeit18.
- Bereiten Sie die Färbelösungen vor.
- Bereiten Sie 10 mg/ml Naphthol AS-MX-Phosphatlösung vor.
- Wiegen Sie 5 mg Naphthol AS-MX-Phosphat (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie im Abzug ein Röhrchen mit 0,5 ml N,N'-Dimethylformamid vor und lösen Sie 5 mg Naphthol AS-MX-Phosphat in 0,5 ml N,N'-Dimethylformamid auf, um eine Stammlösung von 10 mg/ml Naphthol AS-MX-Phosphat herzustellen (vorsichtig schütteln).
- Bereiten Sie 1,6 mM Fast Red Violet LB Stammlösung in 50 mM Natriumtartrat vor.
- Bereiten Sie 50 ml 0,1 M Natriumacetat bei pH 5 vor (0,41015 g Natriumacetat in 50 ml deionisiertem Wasser zugeben und den pH-Wert mit 100%iger Essigsäure auf 5 einstellen).
- 0,575 g dibasisches Natrium-L-Tartrat-Dihydrat (siehe Materialtabelle) werden in 50 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH = 5) gelöst.
- Fügen Sie 30 mg schnelles rotviolettes LB-Salz hinzu.
- PBS-0.1Tx vorbereiten (500 μl Triton-X in 500 ml PBS auflösen).
- PBS-0.1Tw vorbereiten (500 μl Tween-20 in 500 ml PBS auflösen).
- Bereiten Sie 10 mg/ml Naphthol AS-MX-Phosphatlösung vor.
- Bereiten Sie eine funktionierende TRAP-Lösung vor.
- Mischen Sie beide Stammlösungen zusammen im Abzug (0,5 ml 10 mg/ml Naphthol AS-MX-Phosphatlösung und 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB-Stammlösung in 50 mM Natriumtartrat).
HINWEIS: Die Arbeitslösung kann jetzt außerhalb des Abzugs verwendet werden. Es kann im Kühlschrank (in Folie eingewickelt) bis zu einem Monat aufbewahrt werden. In separaten Behältern von Antikörpern oder anderen Reagenzien aufbewahren, die empfindlich auf Fixiermittel reagieren. Halten Sie sich so weit wie möglich von Licht fern. - Optional: Bereiten Sie die Bleichlösung (auf nachfixierten Proben, die TRAP-gefärbt wurden) in PBS und 0,1 % Tween-20 (PBS-0,1 % Tw) vor.
- Bereiten Sie eine endgültige Konzentrationsmischung aus 0,5 % Kaliumhydroxid (KOH) (aus 10 % Stammlösung (w/v)) und 3 % Wasserstoffperoxid (H2O2) (33 % Stammlösung, im Kühlschrank aufbewahrt) vor.
- Mischen Sie beide Stammlösungen zusammen im Abzug (0,5 ml 10 mg/ml Naphthol AS-MX-Phosphatlösung und 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB-Stammlösung in 50 mM Natriumtartrat).
- Führen Sie die Probenfixierung durch.
- Fixe Waagen in 4% PFA in 1x PBS Schaukeln oder Drehen für 40 min bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Sie die 4%ige PFA und waschen Sie sie mit PBS-0.1Tx mindestens 3 Mal für jeweils 5 Minuten.
- Gehen Sie direkt zur TRAP-Färbung über (der beste Ansatz) oder lagern Sie es über Nacht in PBS-0.1 Tx.
- Führen Sie eine TRAP-Färbung der Schuppen durch.
- Entfernen Sie die PBS-0.1 Tx-Lösung und fügen Sie die kolorimetrische TRAP-Arbeitslösung (Schritt 5.2.1) hinzu, um die Proben vollständig zu bedecken (d. h. 1 ml in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen).
- 1-2 h bei RT inkubieren, im Dunkeln schaukeln.
- Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie sie mindestens 3 Mal mit PBS-0.1 Tw für jeweils 5 Minuten.
- Die Proben werden 30 Minuten lang bei RT in 4 % PFA fixiert und dabei im Dunkeln vorsichtig geschaukelt.
- Entfernen Sie die PFA-Lösung, indem Sie sie 3 Mal mit PBS-0.1 Tw für jeden Schritt 5 Minuten lang waschen.
HINWEIS: Die Proben können bei 4 °C im Dunkeln unbegrenzt gelagert werden (in Aufbewahrungslösungen/auf Objektträger montiert).
6. Montage von gebeizten Waagen
- Bereiten Sie das Eindeckmedium vor, indem Sie 2,4 g Mowiol 4-88 Kristalle zu 6 g Glycerin geben (siehe Materialtabelle). Es können beliebige Eindeckmedien verwendet werden.
- Fügen Sie 6 ml deionisiertes Wasser hinzu und lassen Sie es eine Stunde lang auf einem Magnetrührer stehen.
- Fügen Sie 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) hinzu und inkubieren Sie bei ca. 53 ° C, bis sich die Mowiol-Kristalle vollständig aufgelöst haben.
- Die Lösung wird durch Zentrifugieren bei 2000 x g für 20 min bei Raumtemperatur geklärt.
- Überführen Sie die Lösung in einen Vorratsbehälter. Das Eindeckmedium kann ca. 12 Monate im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Die aufgetaute Mowiol-Lösung ist bis zu 1 Monat haltbar.
- Montieren Sie die Skalen auf einem Objektträger, um das Medium zu montieren, decken Sie sie mit einem Deckglas ab und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop.
7. Ex-vivo-Kultur von Schuppen
HINWEIS: Dieser Schritt wurde von de Vrieze et al.12 übernommen.
- Bevor Sie die Schuppen in einer sterilen Umgebung ernten, bereiten Sie das osteogene Medium und die Kulturplatte vor.
- Osteogenes Kulturmedium (OCM): In einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 ml OCM in Standard-Zellkulturmedium (hohe Glukose, kein Glutamin, kein Phenolrot) in den Endkonzentrationen von 1 % Rinderkälberserum, 1 % (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85 % NaCl), 1 % antibiotischer/antimykotischer Lösung (100x) Lösung, 4 mM CaCl2, 10 mM β-Glycerophosphat, 1 nM Natriumpyruvat und 1 % Amphotericin B (optional) herstellen (siehe Materialtabelle).
- Gießen Sie das OCM in ein steriles Reagenzreservoir und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
- Versiegeln Sie die 96-Well-Platte und bewahren Sie die Platte auf. OCM kann kurzzeitig (über Nacht bis 1 Woche) im Kühlschrank gelagert und vor Gebrauch bei 28 °C aufbewahrt werden.
- Führen Sie die Kalkernte und das PBS-Waschen durch.
- Entnehmen Sie die Schuppen mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit einer sterilen PBS-Lösung.
- Führen Sie die Einrichtung der Platte durch.
- Übertragen Sie jede Waage aus der Petrischale in jede Vertiefung auf der 96-Well-Platte mit 100 μl OCM (erwärmt auf 28 °C) mit einer sterilen Pinzette.
- Sobald alle Schuppen auf die Platte übertragen sind, legen Sie die Platte unter ein Stereomikroskop. Verwenden Sie eine feine, sterile Pipettenspitze, um jede Skala vorsichtig auf den Boden der Vertiefung zu bewegen und halten Sie sie von der Seite der Vertiefungen fern, um Lichtreflexionen während der Bildaufnahme zu vermeiden.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn eine Live-Bildgebung durchgeführt wird. - Übertragen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator oder das Live Imaging System (LIS, siehe Materialtabelle) (eingestellt auf 28 °C, 5 % CO2), wo die Waagen bis zu 7 Tage lang kultiviert werden können.
- OCM aktualisieren (optional).
- Das OCM, das im Kühlschrank aufbewahrt wurde, auf 28 °C erwärmen.
- Bringen Sie die 96-Well-Platte vorsichtig in eine sterile Umgebung. Mit einer Mehrkanalpipette 50 μl aus jeder Vertiefung absaugen. Drücken Sie dazu die Spitzen gegen die Wände und tauchen Sie sie nicht bis zum Boden ein, um ein Ansaugen/Verschieben/Entfernen der Schuppen zu vermeiden. Verwenden Sie neue Tipps für unterschiedliche Bedingungen.
- Gießen Sie das OCM in ein steriles Reagenzreservoir und geben Sie mit der Mehrkanalpipette 60 μl OCM in jede Vertiefung.
- Legen Sie die Platte unter das Stereomikroskop und prüfen Sie, ob die Skalen falsch platziert sind (zu nah an den Wänden, schwebend oder in vertikaler Position innerhalb des Mediums). Positionieren Sie sie bei Bedarf mit einer feinen, sterilen Pipettenspitze neu.
- Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator/LIS.
HINWEIS: Aktualisieren Sie das Medium nicht, wenn das Experiment den zirkadianen Rhythmus (CR) beinhaltet, da der Serumschock die biologische Uhr beeinflussen kann. Beachten Sie, dass beim CR-Studium auch die Uhr zurückgesetzt wird.
- Führen Sie eine Färbung und Bildgebung im Nachkulturmaßstab durch (optional).
- Fixieren Sie sie nach 6 Tagen Kultur und richten Sie sie auf eine geeignete Färbung wie von Kossa und ALP ein.
- Alternativ, wenn die Versuchsfische eine fluoreszierende Markierung haben, legen Sie die Platte in ein Lebendbildgebungssystem.
HINWEIS: Wenn Sie ein Live-Imaging-System verwenden, stellen Sie sicher, dass es auf eine für das Experiment geeignete Temperatur und einen CO2 - Wert eingestellt ist. Typischerweise wurden in dieser Studie 28 °C und 5 % CO2 verwendet. Wählen Sie geeignete Filter und Bildgebungszeitpunkte (hier wurde ein Intervall von 2 oder 4 Stunden verwendet, das ausreicht, um die Osteoblastenwanderung zu verfolgen) und Objektive mit geringer Vergrößerung (d. h. 4-fach), um eine gleichmäßige Abbildung der gesamten Vertiefungen zu gewährleisten. Dies liegt daran, dass die Schuppen dazu neigen, sich innerhalb der Vertiefungen zu bewegen, insbesondere bei Medienwechseln.
Representative Results
Regeneration von Waagen
Die Regeneration von Schuppen kann mit einem Standard-Fluoreszenz-Stereomikroskop verfolgt werden, indem die Flanke des Zebrafisches abgebildet wird. Abbildung 3A zeigt Veränderungen in der sp7/osx-Expression der Schuppen während der Schuppenregeneration in einem 4 Monate alten Zebrafisch. Die in Abbildung 3A gezeigten Zeitpunkte für die Flankenbildgebung sind ontogenetisch (Originalskalen, vor der Ernte), Tag 2, Tag 4 und Tag 10 nach der Ernte. In der Regel verwenden wir transgene osx-Linien (auch bekannt als osterix oder sp7) (entweder als GFP (Tg(Ola.sp7:NLS-eGFP)19 oder mCherry Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46)17 , um Veränderungen im Skelettsystem zu verfolgen, während es knochenbildende Osteoblasten markiert. Eine frühe Musterung der neu gebildeten Schuppen ist an 2 Tagen der Regeneration zu sehen. Dieses frühe Muster der Schuppenregeneration ist in einigen Fällen gestört, insbesondere bei Skelettmutanten. Durch die Verfolgung des Regenerationsfortschritts kann man die Kapazität und Geschwindigkeit der Regeneration analysieren. Am Tag der Schuppenernte kann nach der Flankenbildgebung mit demselben Stereomikroskop eine individuelle Bildgebung der geernteten Schuppen durchgeführt werden, wie in Abbildung 3B dargestellt. Regenerierte Schuppen haben eine viel höhere osx-Expression im Vergleich zu ontogenetischen Tag-0-Schuppen, da Osteoblasten für die Knochenneubildung benötigt werden.
Ex-vivo-Kultur
Obwohl man den De-novo-Knochenbildungsprozess untersuchen kann, indem man den Regenerationsprozess an der Flanke des Fisches verfolgt, können wir dieses Modell auch verwenden, um die Reparatur und Heilung von Skelettverletzungen mit Ex-vivo-Schuppenkultur zu untersuchen, indem wir mit einem Skalpell eine Verletzung auf den Schuppen vornehmen. Mit Hilfe eines Live-Imaging-Systems kann die Reparatur in Echtzeit verfolgt werden. Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Verletzungsheilungsreaktion auf ontonetischer Skala in 3 Tagen in einer Kultur, in der die Osteoblasten mit osx: mCherry markiert sind. Die Verletzungsstelle, die durch die Einschübe zu Beginn der Kultur dargestellt wird, zeigt eine deutliche Lücke zwischen Osteoblasten und Schuppenzirkuli (Abbildung 4A). Man kann die Wanderung von Osteoblasten in Richtung der Verletzungsstelle mit Zeitraffer-Bildgebung überwachen. Nach 3 Tagen in Kultur ist die Breite der Lücke verkleinert, und dieExpression der osx ist zwischen der Lücke und den neu gebildeten Schuppenzirkuli zu sehen (Abbildung 4B). Darüber hinaus ist die Morphologie in Bezug auf die Form der Osteoblasten zu Beginn der Kultur kreisförmiger und nach 3 Tagen länglicher. Diese Veränderung des Osteoblasten-Aussehens ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass sie sich in Kultur befinden und nicht in ihrer natürlichen Umgebung (die an den Fisch gebunden ist).
Abbildung 1: Beispiele für Bildgebungsoptionen für Waagen. Osteoblasten können mit osx/sp7 transgenen Reporterlinien (entweder in GFP oder mCherry) sichtbar gemacht werden. Die ALP-Färbung kann verwendet werden, um die Osteoblastenaktivität zu zeigen. Die TRAP-Färbung kann die Aktivität von Osteoklasten zeigen. Alizarinrot (AR) und Calceingrün sind beides Farbstoffe, die in lebenden Fischen verwendet werden können. AR markiert die Mineralisierung und Calcein markiert neu gebildeten Knochen. Das Ausmaß der Mineralisierung kann auch mit der von-Kossa-Färbung dargestellt werden. Maßstabsleisten: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Skalenregenerationsexperiments. Generisches Schema eines Schuppenregenerationsexperiments, das zeigt, dass Fische vor dem Experiment in einzelne Becken getrennt werden. Länge, Geschlecht und Gesundheit werden erfasst. Das Schema zeigt auch den vorgeschlagenen Bereich an der Flanke des Fisches, um Schuppen zu ernten, und vorgeschlagene Bildgebungszeitpunkte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Osterix-Expression (zur Visualisierung von Osteoblasten) während der Schuppenregeneration eines 4 Monate alten Zebrafisches. (A) Die Flankenbilder, die an Tag 0 (vor der Ernte, ontogenetische Skalen), 2 dph (Tage nach der Ernte), Tag 2, 4 dph und 10 dph aufgenommen wurden, um Veränderungen der osx-Expression zu verfolgen. Maßstabsbalken: 1 mm. (B) Repräsentative Bilder einer ontogenetischen Skala und einer Skala mit 10 dph, die von demselben Fisch wie in Feld (A) aufgenommen wurden. Beachten Sie die erhöhte OSX-Expression , wie sie in Magenta in der Mitte der regenerierenden Skalen angezeigt wird. Maßstabsleisten: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Reaktion auf die Reparatur von Skelettverletzungen auf einer ontogenetischen Skala, aufgenommen von einem 4 Monate alten Zebrafisch mit einem Live-Imaging-System. (A) Ontogenetische Skalen mit einer Verletzung, die am selben Tag wie die Ernte (Zeitpunkt 0/Tag0) der Kultur durch das Skalpell verursacht wurde. (B) Die gleiche Skala wird 3 Tage nach der Verletzung angezeigt. Der Einschub zeigt den Bereich der Verletzung. Maßstabsleisten: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die Elasmoide-Schuppen des Zebrafisches sind ein neuartiges Modell für die Skelettforschung und haben ein großes Potenzial, unser Verständnis von Knochenerhalt, Regeneration und Verletzungsreparatur zu verbessern. Die Häufigkeit von Schuppen auf Fischen ermöglicht ein Screening von Substanzen mit mittlerem bis hohem Durchsatz bei gleichzeitiger Reduzierung der Anzahl der verwendeten Tiere und Begrenzung der intraindividuellen Variation. Hier werden Protokolle für die Kalkregeneration und die Ex-vivo-Skalenkultur vorgestellt, um die Regeneration und Reparatur zu untersuchen.
Bei der Befolgung dieses Protokolls müssen einige kritische Schritte berücksichtigt werden. Eine sorgfältige Entfernung der Schuppen ist unerlässlich, insbesondere bei der Verwendung einer transgenen Reporterlinie, um die durch die Ernte verursachte Störung der Zellpopulation zu begrenzen. Wenn Vergleiche mit ontogenetischen Schuppen angestellt werden sollen, ist darauf zu achten, dass die Region keine sich spontan regenerierenden Schuppen enthält (was natürlich während der gesamten Lebensspanne des Fisches auftreten kann). Stellen Sie sicher, dass die Umgebung und die Ausrüstung für die Ex-vivo-Kultur steril sind, um ein optimales Zellüberleben und eine minimale Infektion in der Kultur zu erreichen.
Abhängig von der spezifischen Forschungsfrage können Anpassungen am Protokoll vorgenommen werden, wie z. B. die Kombination verschiedener transgener Reporterlinien, um andere Zelltypen von Genexpressionsprofilen während der Regeneration und Reparatur sichtbar zu machen11,14.
Die breite Palette der Färbungen, die man auf der Waage durchführen kann, bedeutet, dass man für jede getestete Verbindung oder jeden Zustand ihre Auswirkungen auf den Knochen aus verschiedenen Blickwinkeln betrachten kann. Während sp7/OSX-Reporter die Anzahl der Osteoblasten darstellen können, kann die ALP-Färbung die Osteoblastenaktivität visualisieren, die TRAP-Färbung die Osteoklastenaktivität visualisieren, die Calcein-Grün-Lebendfärbung kann neu bildenden Knochen markieren und die Alizarin-Rot- oder von-Kossa-Färbung kann eine Schuppenmineralisierung zeigen. Die Luciferase-Aktivität zur Quantifizierung von Osteoblasten kann ebenfalls verwendet werden12. In Kombination mit diesen Färbetechniken kann man den relativen Beitrag von Osteoblasten und Osteoklasten zu einem bestimmten Knocheneffekt lernen. Den Schuppen fehlen Osteozyten, die in Säugetierknochen weit verbreitet sind und die Haupttreiber der mechanosensorischen Reaktion des Knochens sind. Die Skalenreparatur und -regeneration wird in diesem Modell in erster Linie durch Osteoblasten mit anschließendem Umbau durch Osteoklasten vorangetrieben 8,9. Es ist wichtig zu beachten, dass es Unterschiede zwischen Individuen und Altersgruppengibt 20. Um dies zu minimieren, muss die Schuppenfangfläche konstant sein, da verschiedene Standorte zu unterschiedlichen Schuppenmorphologien führen können, und es werden Fische aus denselben Geschwistergruppen verwendet, damit Alter und Größe konsistent sind. Da jedoch mehrere Schuppen pro Fisch geerntet werden können, kann man mehr Experimente mit weniger Fischen durchführen, wodurch die intraindividuelle Variabilität reduziert wird.
Zusammenfassend zeigen diese Protokolle experimentelle Techniken, die auf ontogenetische und regenerierende Skalen angewendet werden können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass elasmoide Schuppen ein großes Potenzial als Skelettmodell haben, um das Verständnis der Knochenbildung und -reparatur zu unterstützen. und wird dazu beitragen, den Einsatz von Tieren für das Hochdurchsatz-Screening osteoanaboler Verbindungen zu reduzieren.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Mathew Green von der Animal Service Unit für die Fischzucht und bei Katy Jepson vom Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB und QT wurden von Versus Arthritis finanziert (CLH Senior Fellowship 21937, DB und QT Intermediate Fellowship 22044), RR wurde finanziert von (NHMRC APP1158758). Diese Arbeit wurde auch durch das BBSRC-Stipendium (BB/T001984/1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
| 12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
| 15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
| Alizarin red | Sigma | A5533 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
| Calcein powder | Sigma | C0875 | |
| Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
| Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Cover slips | VWR | 631-0146 | |
| Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
| Danieau | Sigma | ||
| DMEM | Life Technologies | 31053 | |
| Falcon tubes | Corning | 430828 | |
| Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
| Glycerol | Sigma | 81381 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
| IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
| Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
| L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
| Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
| Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| MQ water | X | ||
| N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
| NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
| NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
| Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
| Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
| Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
| Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
| Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
| Tris | Sigma | 252859 | |
| Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
| Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
| Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm |
References
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