Summary
Este protocolo descreve a coleta e visualização de escamas elasmoides de zebrafish durante a regeneração in vivo . Além disso, é apresentado o cultivo ex vivo dessas cochonilhas por até 7 dias após a colheita.
Abstract
As doenças esqueléticas são frequentemente complexas em sua etiologia e afetam milhões de pessoas em todo o mundo. Devido ao envelhecimento da população, há necessidade de novas terapêuticas que possam aliviar a carga sobre os sistemas de saúde. Como essas doenças são complexas, é difícil e caro modelar com precisão a fisiopatologia óssea em laboratório. O desafio para a área é estabelecer uma plataforma biologicamente relevante e custo-efetiva para a modelagem de doenças ósseas que possa ser usada para testar potenciais compostos terapêuticos. Tal plataforma deve idealmente permitir a visualização dinâmica do comportamento celular de osteoblastos construtores de ossos e osteoclastos degradadores de osso que atuam em seu ambiente de matriz mineralizada. Os peixes-zebra são cada vez mais usados como modelos devido à disponibilidade de ferramentas genéticas, incluindo linhas de repórteres transgênicas, e ao fato de que alguns tecidos esqueléticos (incluindo as escamas) permanecem translúcidos até a idade adulta, permitindo opções de imagem dinâmica. Como as escamas do peixe-zebra têm osteoblastos e osteoclastos e são altamente abundantes, elas fornecem um recurso facilmente acessível e abundantemente disponível de unidades ósseas independentes. Além disso, uma vez removidas, as escamas de peixe-zebra adultas se regeneram completamente, oferecendo assim uma maneira de estudar o crescimento espaço-temporal do tecido mineralizado in vivo. Aqui, detalhamos protocolos de colheita e acompanhamento da regeneração das escamas. Por fim, um protocolo para cultivo estável de escamas ex vivo por uma semana e acompanhamento da resposta cicatricial após dano controlado à matriz mineralizada da escala ao longo do tempo também é apresentado.
Introduction
O osso é um tecido conjuntivo duro que forma a maior parte do esqueleto, possibilitando a locomoção e atuando como reserva mineral no organismo. Para manter o osso saudável, um equilíbrio requintado entre a formação e degradação óssea é essencial através da atividade acoplada de osteoblastos (que são anabolizantes) e osteoclastos (que reabsorvem osso). Esse equilíbrio é rompido pelo envelhecimento ou pelo desequilíbrio hormonal, muitas vezes levando a doenças de fragilidade óssea, como a osteoporose1. Embora as drogas existentes tenham sido aprovadas para combater doenças de fragilidade óssea, muitas têm efeitos colaterais; portanto, há necessidade de novas terapêuticas1. Assim, permanece a necessidade de fontes abundantes de tecido ósseo biologicamente relevante que possam ser usadas para testar potenciais compostos terapêuticos.
Tradicionalmente, modelos de roedores e sistemas de cultura celular têm sido utilizados para estudar a biologia óssea. No entanto, o peixe-zebra está se tornando cada vez mais outro modelo de escolha. Embora não seja um sistema de mamíferos, o peixe-zebra oferece certas vantagens para a pesquisa óssea sobre os roedores; Estes incluem sua fecundidade e a translucidez das larvas; Mesmo na idade adulta, alguns tecidos esqueléticos, incluindo as escamas e as nadadeiras, permanecem translúcidos, permitindo imagens in vivo de alta resolução e maior disponibilidade de mutantes esqueléticos 2,3. Tanto as nadadeiras quanto as escamas do peixe-zebra são capazes de regeneração completa após a remoção. A regeneração esquelética e o reparo de lesões em nadadeiras de peixe-zebra têm sido extensivamente estudados 4,5, enquanto as escamas de zebrafish são um modelo ósseo mais recente no campo, mas oferecem vantagens para a cultura ex vivo6.
As escamas são altamente abundantes, com pelo menos 300 escamas em cada peixe que servem como cobertura protetora para os peixes. Cada escama é uma pequena placa mineralizada constituída por osteoblastos formadores de osso e osteoclastos reabsorvedores de osso de uma matriz esquelética rica em colágeno7. O processo de ossificação de escamas de peixe-zebra e ossos humanos requer a diferenciação de células-tronco mesenquimais em osteoblastos para formar a matriz mineralizada. As escamas de peixe-zebra oferecem uma grande vantagem para a pesquisa esquelética com sua forte capacidade regenerativa que pode ser usada para estudar a regeneração e o reparo ósseo. No entanto, apesar da presença de osteoblastos e osteoclastos, as escamas de peixe-zebra carecem de osteócitos que são importantes para a remodelação óssea humana e mecanossensenação; A localização superficial das escamas significa que elas podem ser facilmente removidas com um par de pinças. Após a remoção da escala, ocorre uma cascata de eventos e inicia-se a regeneração da escala 8,9. Existem várias opções de coloração e imagem disponíveis para visualizar a atividade dos osteoblastos e osteoclastos e a mineralização das escamas, como mostra a Figura 1. Além disso, a disponibilidade de muitas linhagens transgênicas fluorescentes relevantes de peixe-zebra permite visualizar a dinâmica celular durante a regeneração 7,10,11. Este processo permite obter maior compreensão da formação óssea de novo, observando o padrão inicial de regeneração de escamas no flanco dos peixes para estudar a morfologia, atividade celular e perfis genéticos dessas escamas regeneradas. A biologia da formação e regeneração de escamas tem sido bem caracterizada. É importante ressaltar que as escamas podem mostrar uma boa capacidade preditiva para compostos terapeuticamente relevantes12 e o tratamento de peixes com glicocorticoides leva a uma escala que se regenera para mostrar fenótipos osteoporóticos13. O transcriptoma das escalas de regeneração mostra que genes ativados na regeneração em escala são enriquecidos para aqueles ligados a doenças esqueléticas humanas, demonstrando ainda mais sua relevância como sistemamodelo6,14.
Finalmente, essas escamas podem ser cultivadas ex vivo por até 7 dias. Comparada a culturas de linhagens celulares tipicamente compostas por um único tipo celular, a cultura em escala ex vivo oferece oportunidades de estudo ósseo in vitro em seu ambiente natural, contendo osteoblastos e osteoclastos com sua matriz extracelular natural 8,12,15,16.
A cultura em escala também nos permite realizar a triagem de drogas para novos alvos osteoanabólicos. A abundância de escamas nos peixes significa que se pode encher pelo menos dois pratos do prato de 96 poços de apenas um único peixe, permitindo a triagem de compostos em um formato de poço múltiplo onde cada poço contém uma escama junto com seu nicho natural de células. Além disso, como as escamas são finas, a absorção do fármaco é previsível12. Em resumo, as escamas elasmoides do peixe-zebra têm grande potencial na pesquisa esquelética e podem nos ajudar a obter mais informações sobre os eventos celulares durante a formação e reparo ósseo. Neste trabalho, descrevemos protocolos de colheita de escalas para acompanhamento da regeneração in vivo e cultivo das escalas ex vivo.
Protocol
A Unidade Científica de Animais da Universidade (ASU) é responsável pelos cuidados com o peixe-zebra sob a orientação das diretrizes de criação de peixes-zebra. Todos os procedimentos, incluindo colheita de escala, coloração de ossos vivos e imagens ao vivo, foram aprovados e realizados sob uma Licença de Projeto do Ministério do Interior do Reino Unido (PP4700996). Para este manuscrito, foram utilizados zebrafish transgênicos adultos jovens da linhagem sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]17. Os peixes incluíram machos e fêmeas de 4 meses de idade.
1. Regeneração em escala in vivo
- Antes de iniciar o experimento de regeneração em escala, transfira peixes-zebra de seus tanques principais para tanques individuais (ver Tabela de Materiais) e retorne a esses tanques individuais após a obtenção de imagens durante todo o experimento, como mostrado na Figura 2. Isso é para garantir que todas as escalas regeneradoras sejam aquelas colhidas para o experimento; O alojamento em grupo pode levar à perda esporádica de escamas devido a lesões causadas por outros peixes.
NOTA: Os peixes são colocados individualmente para evitar combates e subsequente perda de escamas entre os peixes. - Registrar as informações de cada peixe do experimento (ou seja, genótipo, idade e sexo) de acordo com o desenho do experimento. Use uma câmera (as câmeras do smartphone funcionam bem) para tirar uma imagem de cada peixe ao lado de uma régua para registrar o tamanho/comprimento do peixe e a condição de saúde.
- No dia do experimento, anestesiar o peixe-zebra usando 0,05% (v/v) de metano sulfonato de tricaína (MS222, ver Tabela de Materiais) por imersão e, em seguida, colocá-lo em uma placa de Petri com um tecido úmido para evitar o movimento do peixe durante a imagem ou a colheita.
- Coloque o peixe de lado (normalmente o flanco esquerdo é usado aqui para consistência). Realizar imagens de flanco usando um estereomicroscópio com aumento apropriado (normalmente, 2x, 4x e/ou 6,3x e 8x foram usados para o presente estudo para capturar tanto a área de regeneração geral quanto a área ampliada para observação detalhada).
NOTA: Os tempos de imagem do flanco dependem do propósito experimental e da escolha dos repórteres transgênicos. Por exemplo, para rastrear osteoblastos durante a regeneração de escamas, os tempos sugeridos são Dia 0 (ontogenético), 2 dias pós-colheita (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Para reduzir os efeitos da anestesia repetida, mantenha os tempos de imagem no menor número necessário para o experimento. - Colher escamas utilizando pinça fina e pinça sob estereomicroscópio. Transfira as escamas colhidas para tubos de coleta para posterior coloração das escamas.
NOTA: O número máximo de escalas que podem ser colhidas dependerá das aprovações éticas locais que estão em vigor. Normalmente, colhemos cerca de 20 a 30 escamas e as coletamos em tubos de coleta individuais para coloração posterior das escamas, como ALP, von Kossa14. - Coletar as escamas em um tubo de coleta de 1,5 mL ou 2 mL. Isso depende da técnica de coloração utilizada.
- Para a coloração de ALP e von Kossa, transferir as escamas para tubos de coleta contendo água deionizada, enquanto para coloração com TRAP ou imunohistoquímica, transferir as escamas para tubos de coleta contendo PFA (solução fixadora) a 4%.
- Opcional: Antes de transferir balanças para tubos, capture imagens de escalas colhidas individualmente, se necessário.
NOTA: Os períodos de colheita das escalas sugeridas são o dia 0 (ontogenética), o dia 10 e o dia 21 (escalas regeneradas).
2. Coloração óssea viva
NOTA: A coloração esquelética viva pode ser realizada quando os peixes experimentais não são transgênicos para repórteres fluorescentes ou quando carregam repórteres transgênicos de cor única. A coloração viva pode ser usada para complementar os transgênicos; por exemplo, pode-se usar um repórter de osteoblastos como sp7/osx em uma cor (por exemplo, GFP) e, em seguida, manchar o osso em vermelho com vermelho de alizarina (AR). AR e calceína verde podem ser usados para os mesmos peixes juntos; nesse cenário, o RA é usado para rotular o osso original ou ontogenético, ligando-se à matriz mineralizada do osso envelhecido, e a calceína liga-se aos íons cálcio que são abundantes no osso neoformado. Por exemplo, ao colorir uma escala ontogenética, o RA pode ser visualizado, mas o verde de calceína pode estar ausente ou mínimo, uma vez que as escalas ontogenéticas apresentam baixos níveis de formação óssea nova.
- Realizar coloração ao vivo de Alizarin Red (AR).
- Preparar um frasco de solução corante de 2x AR misturando solução de alizarina a 0,5% (p/v) (10 mL) com 10 mL de HEPES estoque 1 M (concentração final, 10 mM) (ver Tabela de Materiais).
- Remate até 1 L com 1x solução de Danieau (ver Tabela de Materiais). A solução deve ser mantida no escuro ou envolvida com papel alumínio.
- No dia do experimento, levar 500 mL de solução de RA 2x para a instalação de peixe-zebra e adicionar 500 mL de água do sistema (do aquário) para fazer 1x solução de RA funcional.
- Transfira os peixes de seus tanques para uma solução de coloração de RA de trabalho de 1x e deixe por 15-20 min. Lave o excesso de manchas nos peixes com 15 minutos de 'lavagem' na água do sistema.
- Realize a coloração verde Calcein ao vivo.
- Preparar um frasco de 2x Calcein Green solução corante adicionando 45 mg de Calcein pó em 900 mL de 1x solução de Danieau (ver Tabela de Materiais). Use um agitador magnético para permitir que o pó se dissolva completamente.
- Ajuste o pH para 8. Esta é a solução Calcein Green de estoque 2x. A solução pode ser armazenada no escuro/embrulhada com papel alumínio por até 1 mês.
- No dia do experimento, levar 500 mL de solução de 2x Calcein Green para a instalação de zebrafish e adicionar 500 mL de água do sistema para fazer 1x solução de Calcein Green de trabalho. Recomenda-se o uso de solução de coloração de Calcein recém-feita.
- Transfira os peixes de seus tanques para 1x solução de coloração Calcein Green e deixe por 1-2 h. Dependendo do tamanho do peixe, um tempo de coloração maior pode ser necessário.
- Lave o excesso de manchas nos peixes por 15 minutos 'lavando' na água do sistema.
NOTA: Imagem do peixe manchado de Calcein Green o mais rápido possível, pois esta mancha irá desaparecer em poucas horas.
3. Coloração de fosfatase alcalina (FA) em escamas pós-colheita
- Preparar a solução corante ALP misturando 100 mM Tris (pH 9,5 com HCl) com 100 mM NaCl e 50 mM MgCl2.
- Use a solução de estoque NBT/BCIP disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
- Transfira as balanças para tubos contendo água deionizada.
- Enxaguar as escamas em solução corante de ALP por 5 min.
- Enquanto isso, prepare uma solução corante de trabalho adicionando 200 μL da solução NBT/BCIP a 10 mL de tampão de coloração ALP. Isso precisa ser preparado na hora da coloração.
- Manchar as escamas com a solução corante ALP de trabalho por 15 min.
- Pare a reação enxaguando as escamas com água deionizada.
4. Coloração de von KOSSA em escamas pós-colheita
- Preparar solução de nitrato de prata a 5% (p/v).
- Preparar solução de tiossulfato de sódio a 5% (p/v).
- Transfira as escamas colhidas para tubos contendo água deionizada.
- Incubar as escamas na solução de nitrato de prata durante 40 minutos sob luz forte.
OBS: Use EPIs (equipamentos de proteção individual), pois o nitrato de prata deixa uma mancha de difícil remoção. - Lave as escamas duas vezes por 5 min com água deionizada.
NOTA: Os resíduos de nitrato de prata devem ser recolhidos e eliminados de acordo com as orientações locais. - Incubar as escamas em tiossulfato de sódio por 5 min.
- Lave as escamas duas vezes por 5 min com água deionizada.
5. Coloração colorimétrica TRAP
NOTA: Para o procedimento detalhado, consulte o trabalho publicado anteriormente18.
- Prepare as soluções corantes.
- Preparar 10 mg/ml de solução de fosfato de naftol AS-MX.
- Pesar 5 mg de fosfato de naftol AS-MX (ver Tabela de Materiais).
- No exaustor, preparar um tubo com 0,5 ml de N, N'-dimetilformamida e dissolver 5 mg de fosfato de Naftol AS-MX em 0,5 ml de N, N'-dimetilformamida para fazer uma solução-mãe de 10 mg/ml de fosfato de Naftol AS-MX (agitar suavemente).
- Preparar 1,6 mM de solução-mãe Fast Red Violet LB em tartarato de sódio 50 mM.
- Preparar 50 mL de acetato de sódio 0,1 M em pH 5 (adicionar 0,41015 g de acetato de sódio em 50 mL de água deionizada e ajustar o pH para 5 com ácido acético a 100%).
- Dissolver 0,575 g de L-tartarato de sódio dibásico di-hidratado (ver Tabela de Materiais) em 50 ml de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH = 5).
- Adicione 30 mg de sal LB violeta vermelho rápido.
- Preparar PBS-0,1Tx (dissolver 500 μL de Triton-X em 500 mL de PBS).
- Preparar PBS-0,1Tw (dissolver 500 μL de Tween-20 em 500 mL de PBS).
- Preparar 10 mg/ml de solução de fosfato de naftol AS-MX.
- Prepare uma solução TRAP em funcionamento.
- Misturar ambas as soluções-mãe no exaustor (0,5 ml de solução de fosfato de Naftol AS-MX 10 mg/ml e 50 ml de solução-mãe Fast Red Violet LB 1,6 mM em tartarato de sódio 50 mM).
NOTA: A solução de trabalho agora pode ser usada fora do exaustor. Pode ser armazenado na geladeira (embrulhado em papel alumínio) por até um mês. Conservar em recipientes separados de anticorpos ou outros reagentes sensíveis a fixadores. Manter longe da luz tanto quanto possível. - Opcional: preparar solução clareadora (em amostras pós-fixadas coradas com TRAP) em PBS e Tween-20 a 0,1% (PBS-0,1%Tw).
- Preparar uma mistura de concentração final de hidróxido de potássio a 0,5% (KOH) (a partir de solução-mãe a 10% (p/v)) e peróxido de hidrogénio a 3% (H2O2) (solução-mãe a 33%, armazenada no frigorífico).
- Misturar ambas as soluções-mãe no exaustor (0,5 ml de solução de fosfato de Naftol AS-MX 10 mg/ml e 50 ml de solução-mãe Fast Red Violet LB 1,6 mM em tartarato de sódio 50 mM).
- Realizar a fixação da amostra.
- Fixar escalas em PFA 4% em 1x PBS balançando ou girando por 40 min à temperatura ambiente (TR).
- Retire o PFA a 4% e lave com PBS-0.1Tx pelo menos 3 vezes durante 5 min cada lavagem.
- Passe diretamente para a coloração TRAP (a melhor abordagem) ou armazene em PBS-0.1 Tx durante a noite.
- Realizar coloração TRAP das escamas.
- Remover a solução PBS-0,1 Tx e adicionar a solução colorimétrica de trabalho TRAP (passo 5.2.1) para cobrir totalmente as amostras (ou seja, 1 ml num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml).
- Incubar por 1-2 h no TR, balançando no escuro.
- Retire a solução corante e lave pelo menos 3 vezes com PBS-0,1 Tw durante 5 min cada lavagem.
- Pós-fixar as amostras em PFA 4% por 30 min em RT, balançando suavemente no escuro.
- Retire a solução de PFA lavando 3 vezes com PBS-0,1 Tw durante 5 min em cada passo.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas (em soluções de armazenamento/montadas em lâminas de microscópio) a 4 °C no escuro indefinidamente.
6. Montagem de escamas coradas
- Prepare o meio de montagem adicionando 2,4 g de cristais de Mowiol 4-88 a 6 g de glicerol (ver Tabela de Materiais). Qualquer mídia de montagem preferida pode ser usada.
- Adicione 6 mL de água deionizada e deixe em um agitador magnético por uma hora.
- Adicionar 12 mL de Tris 0,2 M (pH 8,5) e incubar a aproximadamente 53°C até que os cristais de Mowiol se dissolvam completamente.
- Clarificar a solução centrifugando a 2000 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente.
- Transfira a solução para um contêiner de armazenamento. O meio de montagem pode ser mantido no congelador por cerca de 12 meses. A solução de Mowiol descongelada é estável por até 1 mês.
- Monte as escamas em uma lâmina de microscópio na montagem do meio, cubra-as com uma lamínula e visualize-as sob um microscópio.
7. Cultura ex vivo de balanças
NOTA: Esta etapa é adaptada de de Vrieze et al.12.
- Antes de colher as escamas em ambiente estéril, prepare o meio osteogênico e a placa de cultura.
- Meio de cultura osteogênico (OCM): Em um tubo centrífugo estéril, fazer 15 mL de OCM em meio de cultura celular padrão (glicose alta, sem glutamina, sem vermelho fenol) nas concentrações finais de 1% de soro bovino de bezerro, 1% (200 mM de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina em NaCl a 0,85%), solução de antibiótico/antimicótico a 1% (100x), CaCl2 4 mM, β-glicerofosfato 10 mM, piruvato de sódio 1 nM e anfotericina B a 1% (opcional) (ver Tabela de Materiais).
- Despeje o OCM em um reservatório de reagente estéril e, usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL a cada poço da placa de 96 poços.
- Sele a placa de 96 poços e guarde a placa. O OCM pode ser armazenado na geladeira por um curto período (durante a noite até 1 semana) e mantido a 28 °C antes do uso.
- Realizar colheita em escala e lavagem em PBS.
- Colher as escamas com pinças/pinças estéreis e depositá-las em uma placa de Petri contendo uma solução estéril de PBS.
- Execute a configuração da placa.
- Transfira cada escala da placa de Petri para cada poço na placa de 96 poços com 100 μL de OCM (aquecido a 28 °C) usando pinça estéril.
- Uma vez que todas as escamas são transferidas para a placa, traga a placa sob um estereomicroscópio. Usando uma ponta de pipeta fina e estéril para mover suavemente cada escala para o fundo do poço e mantê-las longe do lado dos poços para evitar a reflexão da luz durante a aquisição da imagem.
Observação : esta etapa é necessária somente se estiver executando imagens ao vivo. - Transfira cuidadosamente a placa para a incubadora ou para o Live Imaging System (LIS, ver Tabela de Materiais) (definido a 28 °C, 5% CO2), onde as escamas podem ser cultivadas por até 7 dias.
- Atualizar OCM (opcional).
- Aqueça o OCM que foi armazenado na geladeira a 28 °C.
- Transfira cuidadosamente a placa de 96 poços para um ambiente estéril. Usando uma pipeta multicanal, aspirar 50 μL de cada poço. Para isso, pressione as pontas contra as paredes e não as mergulhe até o fundo para evitar aspirar/mover/remover as escamas. Use novas dicas para diferentes condições.
- Despeje o OCM em um reservatório de reagente estéril e, usando a pipeta multicanal, adicione 60 μL de OCM a cada poço.
- Coloque a placa sob o estereomicroscópio e verifique se há escamas mal posicionadas (muito próximas das paredes, flutuando ou em posição vertical dentro da mídia). Reposicione-os com uma ponta de pipeta fina e estéril, se necessário.
- Coloque a placa de volta na incubadora/LIS.
NOTA: Não atualize o meio se o experimento envolver ritmo circadiano (RC), pois o choque sérico pode afetar o relógio biológico. Observe se estudar CR observa que as condições de luz também redefinir o relógio.
- Realizar coloração e aquisição de imagens em escala pós-cultura (opcional).
- Após 6 dias de cultura, fixá-los e direcioná-los para coloração apropriada como von Kossa e ALP mencionados acima.
- Alternativamente, se os peixes experimentais tiverem uma etiqueta fluorescente, coloque a placa em um sistema de imagem ao vivo.
NOTA: Se estiver usando um sistema de imagem ao vivo, certifique-se de que ele esteja definido para uma temperatura e nível de CO2 apropriados para o experimento. Tipicamente, neste estudo, foram utilizados 28 °C e 5% de CO2 . Selecione filtros e tempos de imagem apropriados (aqui, um intervalo de 2 ou 4 h, que é suficiente para acompanhar a migração de osteoblastos, foi usado) e objetivas de baixa magnificação (ou seja, 4x) para garantir imagens uniformes de todos os poços. Isso ocorre porque as escamas tendem a se mover dentro dos poços, particularmente durante as mudanças de meio.
Representative Results
Regeneração de escala
A regeneração de incrustações pode ser rastreada com um estereomicroscópio fluorescente padrão por meio de imagens do flanco do peixe-zebra. A Figura 3A mostra as mudanças na expressão de escamas sp7/osx durante a regeneração de escamas em um zebrafish de 4 meses de idade. Os momentos para imagens de flanco mostrados na Figura 3A são ontogenéticos (escamas originais, antes da colheita), dia 2, dia 4 e dia 10 pós-colheita. Normalmente usamos linhas transgênicas osx (também conhecidas como osterix ou sp7) (seja como GFP (Tg(Ola.sp7:NLS-eGFP)19 ou mCherry Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46)17 para rastrear mudanças no sistema esquelético à medida que rotula osteoblastos produtores de osso. A padronização precoce das escamas recém-formadas pode ser observada em 2 dias de regeneração. Esse padrão inicial de regeneração de incrustações é interrompido em alguns casos, especialmente em mutantes esqueléticos. Ao acompanhar o progresso da regeneração, pode-se analisar a capacidade e a taxa de regeneração. No dia da colheita da escala, imagens individuais das escamas colhidas podem ser realizadas após a obtenção de imagens no flanco usando o mesmo estereomicroscópio, como mostrado na Figura 3B. As escamas regeneradas têm expressão de osx muito maior em comparação com as escalas ontogenéticas do Dia 0, pois os osteoblastos são necessários para a formação do novo osso.
Cultura em escala ex vivo
Embora se possa estudar o processo de formação óssea de novo acompanhando o processo de regeneração no flanco dos peixes, também podemos usar este modelo para estudar o reparo e a cicatrização de lesões esqueléticas com cultura em escala ex vivo , fazendo uma lesão nas escamas com bisturi. Usando um sistema de imagem ao vivo, o reparo pode ser rastreado em tempo real. A Figura 4 mostra um resultado representativo de uma resposta de cicatrização da lesão em escala ontogenética em 3 dias em uma cultura onde os osteoblastos são marcados com osx: mCherry. O local da lesão mostrado pelas inserções no início da cultura mostra uma clara lacuna entre os osteoblastos e os circulos escamosos (Figura 4A). Pode-se monitorar a migração dos osteoblastos em direção ao local da lesão com imagens de lapso de tempo. Após 3 dias de cultura, a largura do gap é reduzida, e a expressão doosx pode ser vista entre o gap e os circulos de escala recém-formados (Figura 4B). Além disso, a morfologia, em termos da forma dos osteoblastos, é mais circular no início da cultura e após 3 dias, é mais alongada. Esta alteração na aparência dos osteoblastos é provavelmente devido a estar em cultura e não em seu ambiente natural (ligado ao peixe).
Figura 1: Exemplos de opções de imagem para escalas. Os osteoblastos podem ser visualizados com linhas repórteres transgênicas osx/sp7 (em GFP ou mCherry). A coloração ALP pode ser usada para mostrar a atividade osteoblástica. A coloração TRAP pode mostrar a atividade dos osteoclastos. O vermelho de alizarina (AR) e o verde de calceína são ambos corantes que podem ser usados em peixes vivos; O RA rotula a mineralização e a Calcein rotula o osso recém-formado. A extensão da mineralização também pode ser demonstrada com a coloração de von Kossa. Barras de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração esquemática de um experimento de regeneração em escala. Esquema genérico de um experimento de regeneração em escala mostrando que os peixes são separados em tanques individuais antes do experimento. Duração, sexo e saúde são registrados. O esquema também mostra a área sugerida no flanco dos peixes para a coleta de escamas e os pontos de imagem sugeridos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas da expressão de osterix (para visualização de osteoblastos) durante a regeneração de escamas tiradas de um peixe-zebra de 4 meses de idade. (A) As imagens de flanco capturadas no dia 0 (pré-colheita, escalas ontogenéticas), 2 dph (dias pós-colheita) dia 2, 4 dph e 10 dph para rastreamento de mudanças na expressão de osx . Barras de escala: 1 mm. (B) Imagens representativas de uma escala ontogenética e de uma escala a 10 dph retiradas dos mesmos peixes do painel (A). Observe os níveis aumentados de expressão de osx como mostrado em magenta no centro das escalas regeneradoras. Barras de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos da resposta de reparo de lesão esquelética em escala ontogenética capturada de um peixe-zebra de 4 meses de idade usando um sistema de imagem vivo. (A) Balanças ontogenéticas com lesão feita por bisturi no mesmo dia da colheita (tempo 0/dia0) da cultura. (B) A mesma escala é mostrada 3 dias após a lesão. Inset mostra a região da lesão. Barras de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
As escamas elasmoidais do peixe-zebra, como um novo modelo para a pesquisa esquelética, têm grande potencial para ajudar a nossa compreensão da manutenção, regeneração e reparação de lesões ósseas. A abundância de escamas em peixes permite a triagem de compostos de médio a alto rendimento, reduzindo o número de animais usados e limitando a variação intra-individual. Aqui, protocolos para regeneração em escala e cultura em escala ex vivo são apresentados para estudar regeneração e reparo.
Algumas etapas críticas precisam ser consideradas ao seguir esse protocolo. A remoção cuidadosa das escamas é essencial, especialmente quando se usa uma linha de repórter transgênica para limitar o distúrbio à população celular causado pela coleta. Se forem feitas comparações com escalas ontogenéticas, certifique-se de que a região não contenha espontaneamente escamas em regeneração (o que pode ocorrer naturalmente ao longo da vida útil dos peixes). Garantir que o ambiente e o equipamento sejam estéreis para cultura ex vivo para alcançar a sobrevivência celular ideal e infecção mínima em cultura.
Dependendo da questão específica de pesquisa, adaptações podem ser feitas ao protocolo, como a combinação de diferentes linhas de repórteres transgênicos para visualizar outros tipos celulares de perfis de expressão gênica durante a regeneração e reparo11,14.
A ampla gama de coloração que se pode realizar nas escalas significa que, para cada composto ou condição testada, pode-se olhar para seus efeitos no osso de diferentes ângulos; enquanto os repórteres sp7/osx podem mostrar números de osteoblastos, a coloração ALP pode visualizar a atividade osteoblástica, a coloração TRAP pode visualizar a atividade osteoclástica, a coloração verde de Calcein pode marcar osso recém-formado e a coloração vermelha de Alizarin ou von Kossa pode mostrar mineralização em escala. A atividade da luciferase para quantificar osteoblastos também pode ser utilizada12. Combinado com essas técnicas de coloração, pode-se aprender a contribuição relativa de osteoblastos e osteoclastos para um determinado efeito ósseo. As escamas carecem de osteócitos, que são prevalentes no osso de mamíferos e são os principais causadores da resposta mecanossensorial óssea; O reparo e a regeneração em escala nesse modelo são primariamente impulsionados pelos osteoblastos, com posterior remodelação pelos osteoclastos8,9. É fundamental ressaltar que a variação ocorre entre indivíduos e faixas etárias20. Para minimizar isso, a área de colheita da escala deve ser constante, pois diferentes locais podem dar origem a diferentes morfologias de escamas, e peixes dos mesmos grupos irmãos são usados para que a idade e o tamanho sejam consistentes. No entanto, como várias escamas podem ser colhidas por peixe, pode-se executar mais experimentos usando menos peixes, reduzindo a variabilidade intra-individual.
Em resumo, esses protocolos mostram técnicas experimentais que podem ser aplicadas em escalas ontogenéticas e regeneradoras. Em conclusão, as escalas elasmoidais apresentam grande potencial como modelo esquelético para auxiliar no entendimento da formação e reparo ósseo; e ajudará a reduzir o uso de animais para triagem de compostos osteoanabólicos de alto rendimento.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Mathew Green, da Unidade de Serviço Animal para a criação de peixes, e Katy Jepson, do Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB e QT foram financiados pela Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB e QT Intermediate Fellowship 22044), RR foi financiado por (NHMRC APP1158758). Esse trabalho também foi apoiado pela bolsa BBSRC (BB/T001984/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
| 12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
| 15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
| Alizarin red | Sigma | A5533 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
| Calcein powder | Sigma | C0875 | |
| Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
| Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Cover slips | VWR | 631-0146 | |
| Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
| Danieau | Sigma | ||
| DMEM | Life Technologies | 31053 | |
| Falcon tubes | Corning | 430828 | |
| Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
| Glycerol | Sigma | 81381 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
| IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
| Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
| L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
| Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
| Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| MQ water | X | ||
| N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
| NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
| NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
| Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
| Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
| Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
| Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
| Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
| Tris | Sigma | 252859 | |
| Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
| Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
| Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm |
References
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