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Biology

Zebrafish स्केल पुनर्जनन टोटो और पूर्व विवो संस्कृति तराजू में

Published: May 3, 2024 doi: 10.3791/65396
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, Biomedical Science Building, University of Bristol
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल विवो पुनर्जनन के दौरान जेब्राफिश के इलास्मोइड तराजू की कटाई और दृश्य का वर्णन करता है। इसके अलावा, फसल के बाद 7 दिनों तक इन तराजू की पूर्व विवो संस्कृति प्रस्तुत की जाती है।

Abstract

कंकाल रोग अक्सर उनके एटियलजि में जटिल होते हैं और दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं। उम्र बढ़ने की आबादी के कारण, नए उपचारों की आवश्यकता है जो स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों पर बोझ को कम कर सकें। चूंकि ये रोग जटिल हैं, इसलिए प्रयोगशाला सेटिंग में हड्डी के पैथोफिज़ियोलॉजी को सटीक रूप से मॉडल करना मुश्किल और महंगा है। क्षेत्र के लिए चुनौती हड्डी रोग मॉडलिंग के लिए एक लागत प्रभावी, जैविक रूप से प्रासंगिक मंच स्थापित करना है जिसका उपयोग संभावित चिकित्सीय यौगिकों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के एक मंच को आदर्श रूप से हड्डी-निर्माण ओस्टियोब्लास्ट के सेल व्यवहार के गतिशील दृश्य और उनके खनिज मैट्रिक्स वातावरण में अभिनय करने वाले हड्डी-अपमानजनक ऑस्टियोक्लास्ट की अनुमति देनी चाहिए। ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों सहित आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता के कारण ज़ेब्राफिश को मॉडल के रूप में तेजी से उपयोग किया जाता है, और तथ्य यह है कि कुछ कंकाल ऊतक (तराजू सहित) वयस्कता के लिए पारभासी रहते हैं, जिससे गतिशील इमेजिंग विकल्प मिलते हैं। चूंकि ज़ेब्राफिश तराजू में ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों होते हैं और अत्यधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं, इसलिए वे स्वतंत्र हड्डी इकाइयों का आसानी से सुलभ और प्रचुर मात्रा में उपलब्ध संसाधन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, एक बार हटा दिए जाने के बाद, वयस्क ज़ेब्राफिश तराजू पूरी तरह से पुनर्जीवित हो जाते हैं, इसलिए विवो में खनिज ऊतक के स्थानिक विकास का अध्ययन करने का एक तरीका प्रदान करते हैं।यहां, हम तराजू के पुनर्जनन की कटाई और ट्रैकिंग के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। अंत में, एक सप्ताह के लिए तराजू पूर्व vivo की स्थिर संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल और समय के साथ पैमाने के खनिज मैट्रिक्स को नियंत्रित क्षति के बाद चिकित्सा प्रतिक्रिया के बाद भी प्रस्तुत किया जाता है.

Introduction

हड्डी एक कठोर संयोजी ऊतक है जो कंकाल का एक प्रमुख हिस्सा बनाता है, जो हरकत को सक्षम करता है और शरीर में खनिज आरक्षित के रूप में कार्य करता है। स्वस्थ हड्डी को बनाए रखने के लिए, हड्डी के गठन और गिरावट के बीच एक उत्कृष्ट संतुलन ओस्टियोब्लास्ट्स (जो उपचय हैं) और ओस्टियोक्लास्ट (जो हड्डी को पुनर्जीवित करता है) की युग्मित गतिविधि के माध्यम से आवश्यक है। यह संतुलन उम्र बढ़ने या हार्मोनल असंतुलन से बाधित होता है, जो अक्सर ऑस्टियोपोरोसिसजैसे हड्डियों की नाजुकता रोगों का कारण बनता है। हालांकि मौजूदा दवाओं को हड्डी की नाजुकता रोगों को लक्षित करने के लिए अनुमोदित किया गया है, कई के दुष्प्रभाव हैं; इसलिए, नए चिकित्सा विज्ञान की आवश्यकता है1. इस प्रकार, जैविक रूप से प्रासंगिक हड्डी के ऊतकों के प्रचुर स्रोतों की आवश्यकता बनी हुई है जिनका उपयोग संभावित चिकित्सीय यौगिकों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

परंपरागत रूप से, हड्डी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए कृंतक मॉडल और सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग किया गया है। हालांकि, ज़ेब्राफिश तेजी से पसंद का एक और मॉडल बन रही है। जबकि एक स्तनधारी प्रणाली नहीं है, ज़ेब्राफिश कृन्तकों पर हड्डी अनुसंधान के लिए कुछ फायदे प्रदान करते हैं; इनमें उनकी उर्वरता और लार्वा की पारभासी शामिल है; वयस्कता में भी, तराजू और पंख सहित कुछ कंकाल ऊतक, पारभासी रहते हैं, विवो इमेजिंग में उच्च-रिज़ॉल्यूशन और कंकाल म्यूटेंट 2,3 की उपलब्धता में वृद्धि की अनुमति देते हैं। ज़ेब्राफिश के पंख और तराजू दोनों हटाने के बाद पूर्ण पुनर्जनन में सक्षम हैं। कंकाल पुनर्जनन और जेब्राफिश पंख की चोट की मरम्मत बड़े पैमाने पर 4,5 अध्ययन किया गया है, जबकि zebrafish तराजू क्षेत्र में एक नया हड्डी मॉडल हैं, लेकिन पूर्व विवो संस्कृति6 के लिए लाभ प्रदान करते हैं.

तराजू अत्यधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं, प्रत्येक मछली पर कम से कम 300 तराजू होते हैं जो मछली के लिए सुरक्षात्मक आवरण के रूप में काम करते हैं। प्रत्येक पैमाना एक छोटी खनिज प्लेट है जिसमें हड्डी बनाने वाले ओस्टियोब्लास्ट और कोलेजन युक्त कंकाल मैट्रिक्स7 के हड्डी-पुनर्जीवन ओस्टियोक्लास्ट शामिल हैं। जेब्राफिश तराजू और मानव हड्डियों दोनों की अस्थिभंग प्रक्रिया को खनिज मैट्रिक्स बनाने के लिए ओस्टियोब्लास्ट में मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव की आवश्यकता होती है। ज़ेब्राफिश तराजू अपनी मजबूत पुनर्योजी क्षमता के साथ कंकाल अनुसंधान के लिए एक बड़ा लाभ प्रदान करते हैं जिसका उपयोग हड्डी पुनर्जनन और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों की उपस्थिति के बावजूद, ज़ेब्राफिश तराजू में ऑस्टियोसाइट्स की कमी होती है जो मानव हड्डी रीमॉडेलिंग और मैकेनोसेंसेशन के लिए महत्वपूर्ण हैं; तराजू के सतही स्थान का मतलब है कि वे आसानी से संदंश की एक जोड़ी के साथ हटाया जा सकता है. पैमाने को हटाने पर, घटनाओं का एक झरना होता है, और पैमाने पर उत्थान 8,9 शुरू होता है. ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट्स की गतिविधि और तराजू के खनिजकरण की कल्पना करने के लिए विभिन्न धुंधला और इमेजिंग विकल्प उपलब्ध हैं, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, ज़ेब्राफिश के कई प्रासंगिक फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों की उपलब्धता का मतलब है कि कोई पुनर्जनन 7,10,11के दौरान सेल गतिशीलता की कल्पना कर सकता है। यह प्रक्रिया आकृति विज्ञान, सेलुलर गतिविधि और इन पुनर्जीवित तराजू के आनुवंशिक प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए मछली के किनारे पर पैमाने के उत्थान के शुरुआती पैटर्निंग को देखकर डी नोवो हड्डी के गठन की अधिक समझ हासिल करने की अनुमति देती है। पैमाने के गठन और उत्थान के जीव विज्ञान को अच्छी तरह से चित्रित किया गया है। महत्वपूर्ण बात, तराजू चिकित्सीय प्रासंगिक यौगिकों12 के लिए एक अच्छा भविष्य कहनेवाला क्षमता दिखा सकते हैं और glucocorticoids के साथ मछली के उपचार ऑस्टियोपोरोटिक phenotypes13 दिखाने के लिए regenerate करता है कि एक पैमाने की ओर जाता है. पुनर्जीवित तराजू के प्रतिलेख से पता चलता है कि पैमाने पर पुनर्जनन में सक्रिय जीन मानव कंकाल रोगों से जुड़े लोगों के लिए समृद्ध हैं, आगे एक मॉडल प्रणाली 6,14 के रूप में उनकी प्रासंगिकता का प्रदर्शन.

अंत में, इन पैमानों को 7 दिनों तक पूर्व विवो सुसंस्कृत किया जा सकता है। सेल लाइन संस्कृतियों की तुलना में जो आम तौर पर एक एकल सेल प्रकार से बने होते हैं, पूर्व विवो स्केल संस्कृति अपने प्राकृतिक वातावरण के भीतर इन विट्रो हड्डी अध्ययन के अवसरों में प्रदान करती है जिसमें ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों अपने प्राकृतिक बाह्य मैट्रिक्स 8,12,15,16 के साथ होते हैं।

स्केल संस्कृति हमें उपन्यास ऑस्टियोएनाबॉलिक लक्ष्यों के लिए दवा स्क्रीनिंग करने की भी अनुमति देती है। मछली पर तराजू की बहुतायत का मतलब है कि एक ही मछली से 96 अच्छी तरह से थाली के कम से कम दो प्लेटों को भर सकते हैं, एक multiwell प्रारूप में यौगिक स्क्रीनिंग के लिए अनुमति जहां हर एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के अपने प्राकृतिक आला के साथ एक पैमाने होते हैं. इसके अतिरिक्त, चूंकि तराजू पतले हैं, इसलिए दवा अवशोषणअनुमानित 12 है। सारांश में, ज़ेब्राफिश के इलास्मोइड तराजू में कंकाल अनुसंधान में काफी संभावनाएं हैं और हड्डी के गठन और मरम्मत के दौरान सेलुलर घटनाओं में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में हमारी सहायता कर सकते हैं। यहां, हम विवो में पुनर्जनन का पालन करने के लिए कटाई तराजू के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और तराजू पूर्व विवो की संस्कृति करते हैं।

Protocol

विश्वविद्यालय पशु वैज्ञानिक इकाई (एएसयू) जेब्राफिश पालन दिशानिर्देशों के मार्गदर्शन में जेब्राफिश देखभाल के लिए जिम्मेदार है। स्केल हार्वेस्टिंग, लाइव बोन स्टेनिंग और लाइव इमेजिंग सहित सभी प्रक्रियाओं को यूके होम ऑफिस प्रोजेक्ट लाइसेंस (PP4700996) के तहत अनुमोदित और निष्पादित किया गया था। इस पांडुलिपि के लिए, sp7 से युवा वयस्क ट्रांसजेनिक zebrafish [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] लाइन17 इस्तेमाल किया गया था. मछली में 4 महीने के नर और मादा दोनों शामिल थे।

1. विवो स्केल पुनर्जनन में

  1. पैमाने पुनर्जनन प्रयोग शुरू करने से पहले, व्यक्तिगत टैंकों ( सामग्री की तालिकादेखें) में अपने मुख्य टैंकों से zebrafish हस्तांतरण और चित्रा 2 में दिखाया गया है, के रूप में प्रयोग भर में इमेजिंग के बाद इन व्यक्तिगत टैंकों के लिए वापसी. यह सुनिश्चित करने के लिए है कि सभी पुनर्जीवित तराजू प्रयोग के लिए काटा जाता है; समूह आवास अन्य मछलियों के कारण होने वाली चोटों के कारण तराजू के छिटपुट नुकसान का कारण बन सकता है।
    नोट: मछली के बीच लड़ाई और बाद में पैमाने के नुकसान से बचने के लिए मछली को व्यक्तिगत रूप से रखा जाता है।
  2. प्रयोग डिजाइन के अनुसार प्रत्येक प्रयोग मछली (यानी, जीनोटाइप, उम्र और लिंग) के लिए रिकॉर्ड जानकारी। मछली के आकार / लंबाई और स्वास्थ्य की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए शासक के बगल में प्रत्येक मछली की एक छवि लेने के लिए एक कैमरा (स्मार्टफोन कैमरे ठीक काम करते हैं) का उपयोग करें।
  3. प्रयोग के दिन, विसर्जन द्वारा 0.05% (v/v) tricaine मीथेन सल्फोनेट (MS222, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर zebrafish anesthetize, तो इमेजिंग या कटाई के दौरान मछली के आंदोलन से बचने के लिए एक नम ऊतक के साथ एक पेट्री डिश पर जगह है.
  4. मछली को अपनी तरफ रखें (आमतौर पर स्थिरता के लिए यहां बाएं फ्लैंक का उपयोग किया जाता है)। उचित आवर्धन के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लैंक इमेजिंग करें (आमतौर पर, 2x, 4x, और/या 6.3x और 8x का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए समग्र पुनर्जीवित क्षेत्र और विस्तृत अवलोकन के लिए ज़ूम-इन क्षेत्र दोनों को पकड़ने के लिए किया गया था)।
    नोट: फ्लैंक इमेजिंग टाइमपॉइंट प्रयोगात्मक उद्देश्य और ट्रांसजेनिक पत्रकारों की पसंद पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, स्केल पुनर्जनन के दौरान ओस्टियोब्लास्ट को ट्रैक करने के लिए, सुझाए गए टाइमपॉइंट डे 0 (ऑन्टोजेनेटिक), 2 दिन पोस्ट-हार्वेस्ट (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph हैं। दोहराया संज्ञाहरण से प्रभाव को कम करने के लिए, प्रयोग के लिए आवश्यक कम से कम करने के लिए इमेजिंग timepoints रखें.
  5. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ठीक चिमटी और संदंश का उपयोग करके हार्वेस्ट तराजू। बाद में पैमाने धुंधला के लिए संग्रह ट्यूबों में काटा तराजू स्थानांतरण.
    नोट: काटे जा सकने वाले तराजू की अधिकतम संख्या स्थानीय नैतिक अनुमोदनों पर निर्भर करेगी जो जगह में हैं। हम आम तौर पर चारों ओर फसल 20 करने के लिए 30 तराजू और पैमाने धुंधला बाद में के लिए व्यक्तिगत संग्रह ट्यूबों में उन्हें इकट्ठा, इस तरह के एएलपी, वॉन कोसा14 के रूप में.
  6. तराजू को या तो 1.5 एमएल या 2 एमएल संग्रह ट्यूब में ले लीजिए। यह इस्तेमाल किया धुंधला तकनीक पर निर्भर करता है.
    1. एएलपी और वॉन कोसा धुंधला दोनों के लिए, तराजू को विआयनीकृत पानी युक्त संग्रह ट्यूबों में स्थानांतरित करें, जबकि टीआरएपी धुंधला या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, तराजू को 4% पीएफए (फिक्सिंग समाधान) युक्त संग्रह ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  7. वैकल्पिक: ट्यूबों में तराजू स्थानांतरित करने से पहले, यदि आवश्यक हो तो व्यक्तिगत कटाई तराजू की छवियों पर कब्जा.
    नोट: सुझाए गए पैमाने की फसल टाइमपॉइंट दिन 0 (ontogenetic), दिन 10, और दिन 21 (पुनर्जीवित तराजू) हैं।

2. लाइव हड्डी धुंधला हो जाना

नोट: लाइव कंकाल धुंधला या तो किया जा सकता है जब प्रयोगात्मक मछली फ्लोरोसेंट पत्रकारों के लिए ट्रांसजेनिक नहीं हैं या जब एकल रंग ट्रांसजेनिक पत्रकारों ले जाने. लाइव धुंधला ट्रांसजेनिक्स के पूरक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, कोई ओस्टियोब्लास्ट रिपोर्टर जैसे एसपी 7 / ओएसएक्स का उपयोग एक रंग (जैसे, जीएफपी) में कर सकता है, फिर एलिज़रीन लाल (एआर) के साथ लाल रंग में हड्डी को दाग सकता है। एआर और कैल्सिन ग्रीन का उपयोग एक ही मछली के लिए एक साथ किया जा सकता है; इस परिदृश्य में, एआर का उपयोग वृद्ध हड्डी के खनिज मैट्रिक्स से बंधकर मूल या ऑन्टोजेनेटिक हड्डी को लेबल करने के लिए किया जाता है, और कैल्सिन कैल्शियम आयनों को बांधता है जो नवगठित हड्डी में प्रचुर मात्रा में होते हैं। उदाहरण के लिए, जब एक ऑन्टोजेनेटिक स्केल को धुंधला किया जाता है, तो एआर की कल्पना की जा सकती है, लेकिन कैल्सिन ग्रीन अनुपस्थित या न्यूनतम हो सकता है क्योंकि ऑन्टोजेनेटिक स्केल में नई हड्डी के गठन का स्तर कम होता है।

  1. लाइव एलिज़रीन रेड (एआर) धुंधला प्रदर्शन करें।
    1. 1 एम स्टॉक एचईपीईएस (अंतिम एकाग्रता, 10 मिमी) के 10 एमएल के साथ 0.5% (डब्ल्यू / वी) स्टॉक एलिज़रीन समाधान (10 एमएल) मिश्रण करके 2x एआर धुंधला समाधान की एक बोतल तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. 1x Danieau समाधान के साथ 1 L तक ऊपर ( सामग्री की तालिकादेखें)। समाधान को अंधेरे में रखा जाना चाहिए या पन्नी के साथ लपेटा जाना चाहिए।
    3. प्रयोग के दिन, जेब्राफिश सुविधा में 2x एआर समाधान के 500 एमएल लाएं, और 1x काम करने वाले एआर समाधान बनाने के लिए 500 एमएल सिस्टम पानी (मछलीघर से) जोड़ें।
    4. एक 1x काम एआर धुंधला समाधान में अपने टैंक से मछली स्थानांतरण और 15-20 मिनट के लिए छोड़ दें. सिस्टम पानी में 15 मिनट 'धोने' के साथ मछली पर अतिरिक्त दाग को धो लें।
  2. लाइव कैल्सिन ग्रीन धुंधला प्रदर्शन करें।
    1. 1x Danieau समाधान के 900 एमएल में 45 मिलीग्राम कैल्सिन पाउडर जोड़कर 2x कैल्सिन ग्रीन धुंधला समाधान की एक बोतल तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। पाउडर को पूरी तरह से भंग करने की अनुमति देने के लिए एक चुंबकीय स्टिरर का उपयोग करें।
    2. पीएच को 8 पर समायोजित करें। यह 2x स्टॉक कैल्सिन ग्रीन समाधान है। समाधान को 1 महीने तक पन्नी के साथ अंधेरे / लपेटा में संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. प्रयोग के दिन, ज़ेब्राफिश सुविधा में 2x कैल्सीन ग्रीन समाधान के 500 एमएल लाएं, और 1x काम करने वाले कैल्सिन ग्रीन समाधान बनाने के लिए 500 एमएल सिस्टम पानी जोड़ें। ताजा बने कैल्सिन धुंधला समाधान का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    4. मछली को उनके टैंकों से 1x काम करने वाले कैल्सिन ग्रीन धुंधला समाधान में स्थानांतरित करें और 1-2 घंटे के लिए छोड़ दें। मछली के आकार के आधार पर, लंबे समय तक धुंधला होने के समय की आवश्यकता हो सकती है।
    5. सिस्टम के पानी में 15 मिनट 'धुलाई' से मछली पर अतिरिक्त दाग को धो लें।
      नोट: कैल्सिन ग्रीन दाग वाली मछली को जल्द से जल्द चित्रित करें क्योंकि यह दाग कुछ घंटों में फीका पड़ जाएगा।

3. फसल के बाद तराजू पर क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) धुंधला हो जाना

  1. 100 मिमी NaCl और 50 मिमी MgCl2 के साथ 100 मिमी Tris (एचसीएल के साथ पीएच 9.5) मिश्रण करके एएलपी धुंधला समाधान तैयार करें.
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध NBT/BCIP स्टॉक समाधान का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. तराजू को विआयनीकृत पानी युक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  4. 5 मिनट के लिए एएलपी धुंधला समाधान में तराजू कुल्ला.
  5. इस बीच, एएलपी धुंधला बफर के 10 एमएल के लिए एनबीटी / बीसीआईपी समाधान के 200 माइक्रोन जोड़कर एक काम धुंधला समाधान तैयार करें। यह धुंधला होने के समय ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
  6. 15 मिनट के लिए काम कर रहे एएलपी धुंधला समाधान के साथ तराजू दाग.
  7. विआयनीकृत पानी के साथ तराजू rinsing द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो.

4. फसल के बाद तराजू पर वॉन कोसा धुंधला हो जाना

  1. 5% (w/v) सिल्वर नाइट्रेट घोल तैयार करें।
  2. 5% (w/v) सोडियम थायोसल्फेट घोल तैयार करें।
  3. कटाई किए गए तराजू को विआयनीकृत पानी वाली ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  4. मजबूत प्रकाश के तहत 40 मिनट के लिए चांदी नाइट्रेट समाधान में तराजू सेते हैं.
    नोट: पीपीई (व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण) पहनें क्योंकि चांदी नाइट्रेट एक दाग छोड़ देता है जिसे निकालना मुश्किल है।
  5. विआयनीकृत पानी के साथ 5 मिनट के लिए दो बार तराजू धो लें.
    नोट: सिल्वर नाइट्रेट कचरे को स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुसार एकत्र और निपटाया जाना चाहिए।
  6. 5 मिनट के लिए सोडियम थायोसल्फेट में तराजू सेते हैं।
  7. विआयनीकृत पानी के साथ 5 मिनट के लिए दो बार तराजू धो लें.

5. वर्णमिति जाल धुंधला हो जाना

नोट: विस्तृत प्रक्रिया के लिए, कृपया पहले प्रकाशित कार्य18 देखें।

  1. धुंधला समाधान तैयार करें।
    1. 10 mg/mL नेफ़थोल AS-MX फॉस्फेट समाधान तैयार करें।
      1. 5 मिलीग्राम नेफ़थोल एएस-एमएक्स फॉस्फेट वजन करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      2. धूआं हुड में, एन, एन'-डाइमिथाइलफॉर्ममाइड के 0.5 एमएल के साथ एक ट्यूब तैयार करें और एन, एन'-डाइमिथाइलफॉर्ममाइड के 0.5 एमएल में नेफ्थोल एएस-एमएक्स फॉस्फेट के 5 मिलीग्राम को भंग करने के लिए नेफ्थोल एएस-एमएक्स फॉस्फेट के 10 मिलीग्राम / एमएल का स्टॉक समाधान बनाने के लिए (धीरे से हिलाएं)।
    2. 50 मिमी सोडियम टार्ट्रेट में फास्ट रेड वायलेट एलबी स्टॉक समाधान के 1.6 मिमी तैयार करें।
      1. पीएच 5 पर 0.1 एम सोडियम एसीटेट के 50 एमएल तैयार करें (50 एमएल विआयनीकृत पानी में 0.41015 ग्राम सोडियम एसीटेट जोड़ें और पीएच को 100% एसिटिक एसिड के साथ 5 में समायोजित करें)।
      2. 0.575 ग्राम सोडियम एल-टार्ट्रेट डिबासिक डाइहाइड्रेट ( सामग्री की तालिकादेखें) को 0.1 एम सोडियम एसीटेट बफर (पीएच = 5) के 50 एमएल में भंग करें।
      3. 30 मिलीग्राम तेज लाल बैंगनी एलबी नमक जोड़ें।
    3. पीबीएस -0.1 टीएक्स तैयार करें (पीबीएस के 500 एमएल में ट्राइटन-एक्स के 500 माइक्रोन भंग)।
      1. पीबीएस 0.1Tw (पीबीएस के 500 एमएल में ट्वीन -20 के 500 माइक्रोन भंग) तैयार करें।
  2. एक कार्यशील TRAP समाधान तैयार करें।
    1. धूआं हुड में एक साथ दोनों स्टॉक समाधान मिलाएं (10 मिलीग्राम / एमएल नेफ़थोल एएस-एमएक्स फॉस्फेट समाधान के 0.5 एमएल और 50 एमएम सोडियम टार्ट्रेट में 1.6 एमएम फास्ट रेड वायलेट एलबी स्टॉक समाधान के 50 एमएल)।
      नोट: काम कर रहे समाधान अब धूआं हुड के बाहर इस्तेमाल किया जा सकता है। इसे फ्रिज में (पन्नी में लिपटे) एक महीने तक स्टोर किया जा सकता है। जुड़नार के प्रति संवेदनशील एंटीबॉडी या अन्य अभिकर्मकों से अलग कंटेनरों में स्टोर करें। जितना हो सके प्रकाश से दूर रखें।
    2. वैकल्पिक: पीबीएस और 0.1% ट्वीन-20 (पीबीएस-0.1% टीडब्ल्यू) में विरंजन समाधान (ट्रैप दाग वाले पोस्ट-फिक्स्ड नमूनों पर) तैयार करें।
    3. 0.5% पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) (10% स्टॉक समाधान (w/v)) और 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) (33% स्टॉक समाधान, फ्रिज में संग्रहीत) का अंतिम सांद्रता मिश्रण तैयार करें।
  3. नमूना निर्धारण करें।
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 40 मिनट के लिए 1x पीबीएस रॉकिंग या घूर्णन में 4% पीएफए में तराजू को ठीक करें।
    2. 4% पीएफए निकालें और पीबीएस-0.1Tx के साथ कम से कम 3 बार 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए धो लें।
    3. सीधे TRAP धुंधला (सबसे अच्छा दृष्टिकोण) पर जाएं या रात भर PBS-0.1 Tx में स्टोर करें।
  4. तराजू का TRAP धुंधला हो जाना करें।
    1. पीबीएस -0.1 टीएक्स समाधान निकालें और नमूनों को पूरी तरह से कवर करने के लिए वर्णमिति जाल कार्य समाधान (चरण 5.2.1) जोड़ें (यानी, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल)।
    2. आरटी पर 1-2 घंटे के लिए सेते हैं, अंधेरे में कमाल करते हैं।
    3. धुंधला समाधान निकालें और 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए पीबीएस 0.1 ट्व के साथ कम से कम 3 बार धो लें।
    4. आरटी पर 30 मिनट के लिए 4% पीएफए में नमूनों को ठीक करने के बाद, धीरे अंधेरे में कमाल कर रहा है।
    5. प्रत्येक चरण में 5 मिनट के लिए पीबीएस-0.1 ट्व के साथ 3 बार धोकर पीएफए समाधान निकालें।
      नोट: नमूने संग्रहीत किया जा सकता है (भंडारण समाधान में/खुर्दबीन स्लाइड पर घुड़सवार) अनिश्चित काल के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर।

6. सना हुआ तराजू का बढ़ना

  1. ग्लिसरॉल के 6 ग्राम में 2.4 ग्राम Mowiol 4-88 क्रिस्टल जोड़कर बढ़ते माध्यम को तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। किसी भी पसंदीदा बढ़ते मीडिया का उपयोग किया जा सकता है।
  2. 6 एमएल विआयनीकृत पानी जोड़ें और एक घंटे के लिए चुंबकीय उत्तेजक पर छोड़ दें।
  3. 0.2 एम ट्रिस (पीएच 8.5) के 12 एमएल जोड़ें और लगभग 53 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि मोविओल क्रिस्टल पूरी तरह से भंग न हो जाएं।
  4. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 2000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करके समाधान स्पष्ट करें।
  5. समाधान को भंडारण कंटेनर में स्थानांतरित करें। बढ़ते माध्यम को लगभग 12 महीने तक फ्रीजर में रखा जा सकता है। डीफ़्रॉस्टेड Mowiol समाधान 1 महीने तक स्थिर रहता है।
  6. माध्यम बढ़ते में एक खुर्दबीन स्लाइड पर तराजू माउंट, एक coverslip के साथ उन्हें कवर और एक खुर्दबीन के तहत उन्हें देखने.

7. तराजू की पूर्व विवो संस्कृति

नोट: यह कदम de Vrieze et al.12 से अनुकूलित है।

  1. एक बाँझ वातावरण में तराजू कटाई से पहले, osteogenic माध्यम तैयार करेंऔर संस्कृति प्लेट.
    1. ओस्टोजेनिक कल्चर मीडियम (ओसीएम): एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 1% गोजातीय बछड़ा सीरम, 1% (200 एमएम एल-एल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड 0.85% NaCl में), 1% एंटीबायोटिक / एंटीमायोटिक समाधान (100x) समाधान, 4 मिमी CaCl2, 10 मिमी β-ग्लिसरॉफॉस्फेट, 1 एनएम सोडियम पाइरूवेट और 1% एम्फोटेरिसिन बी (वैकल्पिक) ( सामग्री की तालिकादेखें) की अंतिम सांद्रता में मानक सेल संस्कृति माध्यम (उच्च ग्लूकोज, कोई ग्लूटामाइन, कोई फिनोल लाल) में 15 एमएल ओसीएम बनाएं।
    2. एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में ओसीएम डालो, और एक multichannel विंदुक का उपयोग करके, 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 माइक्रोन जोड़ें.
    3. 96-अच्छी प्लेट को सील करें और प्लेट को स्टोर करें। ओसीएम को रेफ्रिजरेटर में एक छोटी अवधि (रात भर से 1 सप्ताह) के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और उपयोग करने से पहले 28 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  2. स्केल हार्वेस्टिंग और पीबीएस वॉशिंग करें।
    1. बाँझ चिमटी/संदंश का उपयोग तराजू फसल और एक बाँझ पीबीएस समाधान युक्त एक पेट्री पकवान में उन्हें जमा.
  3. प्लेट सेटअप करें।
    1. बाँझ संदंश का उपयोग कर ओसीएम (28 डिग्री सेल्सियस तक गर्म) के 100 माइक्रोन के साथ 96 अच्छी तरह से थाली पर प्रत्येक अच्छी तरह से पेट्री डिश से प्रत्येक पैमाने स्थानांतरण.
    2. एक बार सभी तराजू थाली में स्थानांतरित कर रहे हैं, एक stereomicroscope के तहत थाली लाने. एक ठीक, बाँझ विंदुक टिप का उपयोग धीरे अच्छी तरह से के नीचे करने के लिए प्रत्येक पैमाने ले जाने के लिए और छवि अधिग्रहण के दौरान प्रकाश प्रतिबिंब से बचने के लिए उन्हें कुओं के पक्ष से दूर रखने के लिए.
      नोट: यह कदम केवल लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करते समय आवश्यक है।
    3. ध्यान से इनक्यूबेटर या लाइव इमेजिंग सिस्टम (एलआईएस, सामग्री की तालिका) (28 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेट) (28 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेट) के लिए थाली हस्तांतरण, जहां तराजू अप करने के लिए 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है.
  4. ओसीएम (वैकल्पिक) ताज़ा करें।
    1. फ्रिज में संग्रहीत ओसीएम को 28 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. ध्यान से एक बाँझ वातावरण के लिए 96 अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, प्रत्येक अच्छी तरह से से 50 माइक्रोन महाप्राण. इसके लिए, दीवारों के खिलाफ युक्तियों को दबाएं और तराजू को महाप्राण / स्थानांतरित / हटाने से बचने के लिए उन्हें नीचे तक डुबोएं नहीं। विभिन्न स्थितियों के लिए नए सुझावों का उपयोग करें।
    3. ओसीएम को एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में डालें, और मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से ओसीएम के 60 माइक्रोन जोड़ें।
    4. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट रखें और गलत तराजू (दीवारों के बहुत करीब, फ्लोटिंग, या मीडिया के भीतर एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में) की जांच करें। यदि आवश्यक हो तो उन्हें एक ठीक, बाँझ विंदुक टिप के साथ बदलें।
    5. थाली वापस इनक्यूबेटर/एलआईएस में रखें.
      नोट: प्रयोग circadian ताल (सीआर) शामिल है, तो माध्यम ताज़ा न करें, के रूप में सीरम सदमे जैविक घड़ी को प्रभावित कर सकते हैं. ध्यान दें कि सीआर का अध्ययन करते हुए नोट किया गया है कि प्रकाश की स्थिति भी घड़ी को रीसेट करती है।
  5. संस्कृति के बाद पैमाने धुंधला हो जाना और इमेजिंग (वैकल्पिक) प्रदर्शन.
    1. संस्कृति के 6 दिनों के बाद, उन्हें ठीक करें और उन्हें उचित धुंधला के लिए निर्देशित करें जैसे कि वॉन कोसा और एएलपी ऊपर उल्लेख किया गया है।
    2. वैकल्पिक रूप से, यदि प्रयोगात्मक मछली एक फ्लोरोसेंट टैग है, एक जीवित इमेजिंग प्रणाली में थाली डाल दिया.
      नोट: यदि लाइव इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि यह प्रयोग के लिए उपयुक्त तापमान और सीओ2 स्तर पर सेट है। आमतौर पर, इस अध्ययन में, 28 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 का उपयोग किया गया था। उपयुक्त फिल्टर और इमेजिंग timepoints का चयन करें (यहाँ, 2 या 4 घंटे का अंतराल, जो osteoblast प्रवास का पालन करने के लिए पर्याप्त है, इस्तेमाल किया गया था) और कम बढ़ाई उद्देश्यों (यानी, 4x) पूरे कुओं की भी इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए. ऐसा इसलिए है क्योंकि तराजू कुओं के अंदर चले जाते हैं, खासकर मीडिया परिवर्तनों के दौरान।

Representative Results

स्केल पुनर्जनन
स्केल पुनर्जनन को ज़ेब्राफिश के फ्लैंक इमेजिंग द्वारा एक मानक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ ट्रैक किया जा सकता है। चित्रा 3 ए 4 महीने के जेब्राफिश में स्केल पुनर्जनन के दौरान तराजू की एसपी 7 / चित्रा 3 ए में दिखाए गए फ्लैंक इमेजिंग के लिए टाइमपॉइंट्स ऑन्टोजेनेटिक (मूल तराजू, कटाई से पहले), दिन 2, दिन 4, और दिन 10 कटाई के बाद हैं। हम आम तौर पर osx (भी osterix या sp7 के रूप में जाना जाता है) ट्रांसजेनिक लाइनों (या तो एक GFP के रूप में उपयोग (Tg (Ola.sp7: NLS-eGFP)19 या mCherry Tg(osterix: mCherry-NTR) पीडी46)17 कंकाल प्रणाली में परिवर्तन को ट्रैक करने के रूप में यह लेबल हड्डी बनाने osteoblasts. नवगठित तराजू के प्रारंभिक पैटर्न को पुनर्जनन के 2 दिनों में देखा जा सकता है। पैमाने पर उत्थान का यह प्रारंभिक पैटर्न कुछ मामलों में बाधित होता है, विशेष रूप से कंकाल म्यूटेंट में। उत्थान की प्रगति पर नज़र रखकर, कोई भी पुनर्जनन की क्षमता और दर का विश्लेषण कर सकता है। पैमाने पर कटाई के दिन, काटा तराजू की व्यक्तिगत इमेजिंग चित्रा 3 बी में दिखाया गया के रूप में एक ही stereomicroscope का उपयोग पार्श्व इमेजिंग के बाद किया जा सकता है. पुनर्जीवित तराजू में दिन 0 ऑन्टोजेनेटिक तराजू की तुलना में बहुत अधिक ओएसएक्स अभिव्यक्ति होती है क्योंकि नई हड्डी के गठन के लिए ओस्टियोब्लास्ट की आवश्यकता होती है।

पूर्व विवो स्केल संस्कृति
यद्यपि कोई मछली के किनारे पर पुनर्जनन प्रक्रिया को ट्रैक करके डी नोवो हड्डी गठन प्रक्रिया का अध्ययन कर सकता है, हम इस मॉडल का उपयोग स्केलपेल के साथ तराजू पर चोट लगाकर पूर्व विवो स्केल संस्कृति के साथ कंकाल की चोटों की मरम्मत और उपचार का अध्ययन करने के लिए भी कर सकते हैं। लाइव इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके, मरम्मत को वास्तविक समय में ट्रैक किया जा सकता है। चित्रा 4 एक संस्कृति में 3 दिनों में एक ontogenetic पैमाने पर एक चोट उपचार प्रतिक्रिया का एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है जहां osteoblasts osx: mCherry के साथ लेबल कर रहे हैं. संस्कृति की शुरुआत में इनसेट द्वारा दिखाया चोट साइट osteoblasts और पैमाने circuli (चित्रा 4 ए) के बीच एक स्पष्ट अंतर से पता चलता है. समय-चूक इमेजिंग के साथ चोट स्थल की ओर ओस्टियोब्लास्ट के प्रवास की निगरानी कर सकते हैं। संस्कृति में 3 दिनों के बाद, अंतर की चौड़ाई कम हो जाती है, औरओएसएक्स की अभिव्यक्ति अंतर और नवगठित पैमाने परिपत्र(चित्रा 4बी)के बीच देखी जा सकती है। इसके अतिरिक्त, ओस्टियोब्लास्ट के आकार के संदर्भ में आकृति विज्ञान, संस्कृति की शुरुआत में अधिक गोलाकार है और 3 दिनों के बाद, अधिक लम्बी है। ओस्टियोब्लास्ट उपस्थिति में यह परिवर्तन संस्कृति में होने की संभावना है और इसके प्राकृतिक वातावरण (मछली से जुड़ी) में नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1: तराजू के लिए इमेजिंग विकल्पों के उदाहरण। ओस्टियोब्लास्ट्स को osx/sp7 ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों (या तो GFP या mCherry में) के साथ देखा जा सकता है। एएलपी धुंधला ऑस्टियोब्लास्ट गतिविधि को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। TRAP धुंधला हो जाना osteoclasts की गतिविधि दिखा सकते हैं. एलिज़रीन लाल (एआर) और कैल्सिन हरा दोनों रंग हैं जिनका उपयोग जीवित मछली में किया जा सकता है; एआर लेबल खनिजकरण और कैल्सिन लेबल नवगठित हड्डी। खनिजकरण की सीमा को वॉन कोसा धुंधला होने के साथ भी दिखाया जा सकता है। स्केल बार: 500 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक पैमाने पुनर्जनन प्रयोग का योजनाबद्ध चित्रण। एक पैमाने के पुनर्जनन प्रयोग के जेनेरिक योजनाबद्ध से पता चलता है कि प्रयोग से पहले मछली को अलग-अलग टैंकों में अलग किया जाता है। लंबाई, लिंग और स्वास्थ्य दर्ज किया जाता है। योजनाबद्ध भी फसल तराजू और सुझाए गए इमेजिंग टाइमपॉइंट के लिए मछली के फ्लैंक पर सुझाए गए क्षेत्र को दिखाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 4 महीने के ज़ेब्राफिश से लिए गए पैमाने के उत्थान के दौरान शुरमुर्ग अभिव्यक्ति (ओस्टियोब्लास्ट की कल्पना करने के लिए) की प्रतिनिधि छवियां। (ए) ओएसएक्स अभिव्यक्ति में परिवर्तनों पर नज़र रखने के लिए दिन 0 (पूर्व-फसल, ओंटोजेनेटिक तराजू), 2 डीपीएच (फसल के बाद के दिन) दिन 2, 4 डीपीएच, और 10 डीपीएच पर कब्जा कर लिया गया फ्लैंक छवियां। स्केल बार: 1 मिमी। (बी) एक ओंटोजेनेटिक पैमाने की प्रतिनिधि छवियां और पैनल (ए) के रूप में एक ही मछली से ली गई 10 डीपीएच पर एक पैमाने। osx अभिव्यक्ति के बढ़े हुए स्तर पर ध्यान दें जैसा कि पुनर्जीवित तराजू के केंद्र में मैजेंटा में दिखाया गया है। स्केल बार: 500 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक जीवित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर एक 4 महीने पुराने ज़ेब्राफिश से कब्जा कर लिया एक ontogenetic पैमाने पर कंकाल की चोट की मरम्मत प्रतिक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम. (ए) संस्कृति के फसल (टाइमपॉइंट 0/दिन0) के रूप में एक ही दिन स्केलपेल द्वारा की गई चोट के साथ ओंटोजेनेटिक तराजू। (बी) चोट के 3 दिन बाद एक ही पैमाने दिखाया गया है। इनसेट चोट के क्षेत्र को दर्शाता है। स्केल बार: 500 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

कंकाल अनुसंधान के लिए एक उपन्यास मॉडल के रूप में ज़ेब्राफिश के इलास्मोइड तराजू, हड्डी के रखरखाव, पुनर्जनन और चोट की मरम्मत की हमारी समझ में मदद करने के लिए काफी क्षमता रखते हैं। मछली पर तराजू की प्रचुरता मध्यम से उच्च-थ्रूपुट यौगिक स्क्रीनिंग की अनुमति देती है, जबकि उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करती है और अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता को सीमित करती है। यहां, पुनर्जनन और पूर्व विवो स्केल संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल पुनर्जनन और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं।

इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर विचार करने की आवश्यकता है। तराजू का सावधानीपूर्वक निष्कासन आवश्यक है, खासकर जब कटाई के कारण सेल आबादी में गड़बड़ी को सीमित करने के लिए ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन का उपयोग करना। यदि तुलना ऑन्टोजेनेटिक तराजू से की जानी है, तो सुनिश्चित करें कि इस क्षेत्र में अनायास पुनर्जीवित तराजू नहीं हैं (जो स्वाभाविक रूप से मछली के जीवनकाल के माध्यम से हो सकता है)। सुनिश्चित करें कि पर्यावरण और उपकरण पूर्व विवो संस्कृति के लिए इष्टतम सेल अस्तित्व और संस्कृति में न्यूनतम संक्रमण प्राप्त करने के लिए बाँझ हैं।

विशिष्ट शोध प्रश्न के आधार पर, पुनर्जनन औरमरम्मत 11,14 के दौरान जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के अन्य सेल प्रकारों की कल्पना करने के लिए विभिन्न ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के संयोजन के रूप में प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलन किया जा सकता है।

धुंधला होने की विस्तृत श्रृंखला तराजू पर प्रदर्शन कर सकती है इसका मतलब है कि प्रत्येक परीक्षण किए गए यौगिक या स्थिति के लिए कोई भी विभिन्न कोणों से हड्डी पर इसके प्रभावों को देख सकता है; जबकि एसपी 7 / ओएसएक्स रिपोर्टर ओस्टियोब्लास्ट नंबर दिखा सकते हैं, एएलपी धुंधला ओस्टियोब्लास्ट गतिविधि की कल्पना कर सकता है, ट्रैप धुंधला ओस्टियोक्लास्ट गतिविधि की कल्पना कर सकता है, कैल्सिन ग्रीन लाइव धुंधला नव गठन हड्डी और अलीज़रीन लाल या वॉन कोसा धुंधला पैमाने पर खनिज दिखा सकता है। ओस्टियोब्लास्ट की मात्रा निर्धारित करने के लिए लूसीफ़ेरेज़ गतिविधि का उपयोग12 भी किया जा सकता है। इन धुंधला तकनीकों के साथ संयुक्त, कोई भी किसी दिए गए हड्डी प्रभाव के लिए ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट के सापेक्ष योगदान को सीख सकता है। तराजू में ऑस्टियोसाइट्स की कमी होती है, जो स्तनधारी हड्डी में प्रचलित हैं और हड्डी मेकेनोसेंसरी प्रतिक्रिया के मुख्य चालक हैं; इस मॉडल में स्केल मरम्मत और उत्थान मुख्य रूप से ओस्टियोक्लास्ट 8,9 द्वारा बाद के रीमॉडेलिंग के साथ ओस्टियोब्लास्ट द्वारा संचालित होते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि व्यक्तियों और आयु समूहों के बीच भिन्नताहोती है। इसे कम करने के लिए, स्केल फसल क्षेत्र स्थिर होना चाहिए, क्योंकि विभिन्न स्थान अलग-अलग पैमाने की आकृति विज्ञान को जन्म दे सकते हैं, और एक ही भाई-बहन समूहों की मछली का उपयोग किया जाता है ताकि उम्र और आकार सुसंगत हों। हालांकि, क्योंकि प्रति मछली कई तराजू काटा जा सकता है, कोई भी कम मछली का उपयोग करके अधिक प्रयोग चला सकता है, जिससे अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता कम हो जाती है।

सारांश में, इन प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक तकनीकों है कि ontogenetic और पुनर्जीवित तराजू के लिए लागू किया जा सकता है दिखा. अंत में, इलास्मोइड तराजू हड्डी के गठन और मरम्मत की समझ में सहायता के लिए एक कंकाल मॉडल के रूप में बड़ी क्षमता दिखाते हैं; और उच्च थ्रूपुट ऑस्टियोएनाबॉलिक यौगिक स्क्रीनिंग के लिए पशु उपयोग को कम करने में मदद करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम मछली पालन के लिए पशु सेवा इकाई के मैथ्यू ग्रीन और वोल्फसन बायोइमेजिंग सेंटर से कैटी जेपसन को धन्यवाद देना चाहते हैं। सीएलएच, डीबी और क्यूटी को बनाम गठिया (सीएलएच सीनियर फैलोशिप 21937, डीबी और क्यूटी इंटरमीडिएट फैलोशिप 22044) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, आरआर को (एनएचएमआरसी APP1158758) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस काम को BBSRC अनुदान (BB/T001984/1) द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 70013-016 PBS
12-Multichanel Pipette Sartorius 728230 Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. 
15 mL Centrifuge tubes Corning 430791 Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic
4% Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 PFA
Alizarin red Sigma A5533
Amphotericin B ThermoFisher Scientific  15290026
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher Scientific  11772644 Sealing film
Calcein powder Sigma C0875
Calcium Chloride Thermo Scientific L13191.30
Corning 96 well plate Corning 3596 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile
Cover slips VWR 631-0146
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum Fisher Scientific  SH30072.03
Danieau Sigma
DMEM Life Technologies 31053
Falcon tubes Corning 430828
Fast Red Violet LB stock solution Sigma F3381
GlutaMAX Supplement Life Technologies 35050
Glycerol Sigma 81381
Hepes Sigma H3375
Incubator X Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2
IncuCyte Zoom Sartorious X Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2
Leica stereomicroscope X Sterioscope
L-tartrate dibasic dihydrate Sigma 228729
Mgcl2 BDH Laboratory Sup.  261237T
Microscope slides Epredia J2800AMNZ
Mowiol 4-88 Sigma 9002-89-5
MQ water X
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) Merck D4451
NaCL Fisher Chemical S/3120/53
Naphthol AS-MX phosphate Merck N4875
NBT/BCIP solution Sigma #000000011681451001
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140
Petri Dishes Corning 430589 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene.
Reagent Reservoir Startub E2310-1025 25mL Reagent Reservoir
Silver nitrate Sigma 209139
Sodium acetate Sigma 52889
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate Thermo Scientific L03425.14
Sodium pyruvate solution Sigma S8636
Sodium tartrate Sigma S4797
Sodium thioculphate Sigma 563188
Tricaine methane sulfonate (MS222) Sigma E10521
Tris Sigma 252859
Triton-X100 Sigma T8787
Tween-20  SLS CHE3852
Tweezers Number 5 Dumont 500341 Tweezer, INOX, biology grade
Zebrafish tanks  Tecniplast  ZB30BCP 3.5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm
Zebrafish tanks  Tecniplast  ZB30BCP 1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm

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References

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इस महीने में जोव अंक 207
Zebrafish स्केल पुनर्जनन <em>टोटो और</em> <em>पूर्व विवो</em> संस्कृति तराजू में
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Tong, Q., Raele, R., Bergen, D.,… More

Tong, Q., Raele, R., Bergen, D., Hammond, C. Zebrafish Scale Regeneration In Toto and Ex Vivo Culture of Scales. J. Vis. Exp. (207), e65396, doi:10.3791/65396 (2024).

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