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Biology

माउस कंकाल की मांसपेशी की असमान थोक संस्कृति आला और स्टेम सेल की गतिशीलता को पुन: उत्पन्न करने के लिए

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65433
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Univ Paris Est Creteil, INSERM, IMRB, F-94010 Creteil, France, 2Ecole nationale vétérinaire d'Alfort, IMRB, F-94700 Maisons-Alfort, France, 3EFS, IMRB, F-94010 Creteil, France, 4AP-HP, Hopital Mondor, Service d'histologie, F-94010 Creteil, France
* These authors contributed equally

Summary

कंकाल की मांसपेशी में निवासी स्टेम कोशिकाओं सहित कई सेल प्रकार शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक मांसपेशी होमियोस्टैसिस और पुनर्जनन में विशेष योगदान देता है। यहां, मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं की 2 डी संस्कृति और एक पूर्व विवो सेटिंग में मांसपेशी कोशिका आला जो कई शारीरिक, विवो और पर्यावरणीय विशेषताओं को संरक्षित करती है, का वर्णन किया गया है।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी शरीर का सबसे बड़ा ऊतक है और हरकत से लेकर शरीर के तापमान नियंत्रण तक कई कार्य करता है। इसकी कार्यक्षमता और चोटों से वसूली सेल प्रकारों की भीड़ और कोर मांसपेशी कोशिकाओं (मायोफाइबर, मांसपेशी स्टेम सेल) और उनके आला के बीच आणविक संकेतों पर निर्भर करती है। अधिकांश प्रयोगात्मक सेटिंग्स इस जटिल शारीरिक माइक्रोएन्वायरमेंट को संरक्षित नहीं करती हैं, और न ही वे मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के पूर्व विवो अध्ययन की अनुमति देते हैं, एक सेल अवस्था जो उनके लिए महत्वपूर्ण है। यहां, उनके आला के सेलुलर घटकों के साथ मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं की पूर्व विवो संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है। मांसपेशियों के यांत्रिक और एंजाइमेटिक टूटने के माध्यम से, सेल प्रकारों का मिश्रण प्राप्त किया जाता है, जिसे 2 डी संस्कृति में रखा जाता है। इम्यूनोस्टेनिंग से पता चलता है कि 1 सप्ताह के भीतर, कई आला कोशिकाएं मायोफाइबर के साथ संस्कृति में मौजूद हैं और, महत्वपूर्ण रूप से, पैक्स 7-पॉजिटिव कोशिकाएं जो क्विसेंट मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं को प्रदर्शित करती हैं। ये अद्वितीय गुण इस प्रोटोकॉल को सेल प्रवर्धन और क्विसेंट जैसी स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं जिनका उपयोग मौलिक और ट्रांसलेशनल प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

आंदोलन, श्वास, चयापचय, शरीर की मुद्रा, और शरीर का तापमान रखरखाव सभी कंकाल की मांसपेशियों पर निर्भर करते हैं, और कंकाल की मांसपेशियों में खराबी, इस प्रकार, दुर्बल विकृति (यानी, मायोपैथिस, मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी, आदि) का कारण बन सकती है। 1. इसके आवश्यक कार्यों और बहुतायत को देखते हुए, कंकाल की मांसपेशियों ने दुनिया भर में अनुसंधान प्रयोगशालाओं का ध्यान आकर्षित किया है जो सामान्य मांसपेशी समारोह का समर्थन करने वाले प्रमुख पहलुओं को समझने का प्रयास करते हैं और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन और स्टेम सेल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल है, क्योंकि स्वस्थ मांसपेशी पूरी तरह से चोट और अध: पतन के बाद पूरी तरह से आत्म-मरम्मत कर सकती है, ज्यादातर इसके निवासी स्टेम सेल2 के कारण; इन्हें उपग्रह कोशिकाएं भी कहा जाता है और मांसपेशी फाइबर3 की परिधि में बेसल लैमिना के तहत स्थानीयकृत होते हैं।

वयस्क कंकाल की मांसपेशियों की मुख्य कोशिकाएं मायोफाइबर (लंबी सिंकेटियल मल्टीन्यूक्लियर कोशिकाएं) और उपग्रह कोशिकाएं (मायोजेनिक क्षमता वाली स्टेम कोशिकाएं हैं जो तब तक सक्रिय होती हैं जब तक कि चोट उन्हें सक्रिय नहीं करती है)। बाद की कोशिकाएं मांसपेशियों के पुनर्जनन की केंद्रीय कोशिकाएं हैं, और यह प्रक्रिया उनकी अनुपस्थिति में नहीं हो सकतीहै 4,5,6,7। उनके तत्काल माइक्रोएन्वायरमेंट में, कई सेल प्रकार और आणविक कारक हैं जो उन्हें संकेत देते हैं। यह आला धीरे-धीरे पूरे विकास में और वयस्कता8 तक स्थापित होता है। वयस्क मांसपेशियों में कई सेल प्रकार (एंडोथेलियल कोशिकाएं, पेरिसाइट, मैक्रोफेज, फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज-एफएपी, नियामक टी कोशिकाएं, आदि) होते हैं। 9,10 और बाह्य मैट्रिक्स घटक (लैमिनिन, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, फाइब्रिलिन, पेरीओस्टिन, आदि) 11 जो स्वास्थ्य, बीमारी और पुनर्जनन के संदर्भ में एक दूसरे के साथ और उपग्रह कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं।

प्रयोगात्मक सेटिंग्स में इस जटिल आला को संरक्षित करना मौलिक लेकिन चुनौतीपूर्ण है। समान रूप से कठिन है क्वीसेंस को बनाए रखना या वापस लौटना, एक सेल अवस्था जोउपग्रह कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है। इन चुनौतियों से आंशिक रूप से निपटने के लिए कई तरीके पेश किए गए हैं, प्रत्येक के फायदे और नुकसान (चर्चा अनुभाग में विस्तृत)। यहां, एक विधि प्रस्तुत की गई है जो इन दो बाधाओं को आंशिक रूप से दूर कर सकती है। मांसपेशियों को शुरू में काटा जाता है और फिर हेटरोजेनस सेल मिश्रण को संस्कृति में डालने से पहले यांत्रिक और एंजाइमेटिक रूप से तोड़ दिया जाता है। संस्कृति के दौरान, आला के कई सेल प्रकारों का पता लगाया जाता है, और उपग्रह कोशिकाएं जो चमक में लौट आई हैं, देखी जाती हैं। प्रोटोकॉल के अंतिम चरण के रूप में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस चरण जो सार्वभौमिक रूप से स्वीकृत मार्करों के उपयोग के माध्यम से प्रत्येक सेल प्रकार का पता लगाने की अनुमति देते हैं, प्रस्तुत किए जाते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगों ने इंस्टीट्यूट मोंडोर डी रेचरचे बायोमेडिकल (INSERM U955) में फ्रांसीसी और यूरोपीय संघ के पशु नियमों का अनुपालन किया, विशेष रूप से निर्देश 2010/63 / UE। जानवरों को प्रमाणन संख्या ए 94 028 379 और डी 94-028-028 के साथ पशु सुविधाओं में एक नियंत्रित और समृद्ध वातावरण में रखा गया था; उन्हें केवल अधिकृत शोधकर्ताओं और पशु देखभाल करने वालों द्वारा संभाला गया था, और उन्हें अपने जीवनकाल के दौरान असुविधा के संकेतों के लिए पशु आवास कर्मियों द्वारा नेत्रहीन निरीक्षण किया गया था। विच्छेदन से पहले उन्हें ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी। जानवरों के जीवनकाल के दौरान कोई पारंपरिक प्रक्रिया नहीं की गई थी; इस प्रकार, एक आचार समिति और फ्रांसीसी उच्च शिक्षा, अनुसंधान और नवाचार मंत्रालय से प्रक्रिया के लिए अनुमोदन प्राप्त करना आवश्यक नहीं था। दरअसल, निर्देश 2010/63/यूई के अनुसार यूथेनाइजेशन और पोस्ट-मॉर्टम विच्छेदन के लिए कोई नैतिकता मंजूरी की आवश्यकता नहीं है। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत परिणाम जंगली प्रकार सी 57बीएल / 6एनआरजे लाइन ( सामग्री की तालिका देखें) और ट्रांसजेनिक टीजी: पैक्स 7-एनजीएफपी लाइन12 (हमारी टीम द्वारा प्रगायत) से हैं। प्रोटोकॉल 8-12 सप्ताह की आयु के नर और मादा चूहों पर लागू किया गया था।

1. अभिकर्मक और उपकरण तैयार करना पूर्व-पाचन

  1. विच्छेदन उपकरण (सीधी और घुमावदार कैंची, बल, सामग्री की तालिका देखें) को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें, और उन्हें कागज से सुखाएं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक कॉर्क प्लेट कोट करें, और पास में 10 सेमी पेट्री व्यंजन (प्रति जानवर एक) रखें। पहुंच में कागज और 70% इथेनॉल है।
    नोट: विच्छेदन के अंत में, विच्छेदन उपकरणों को पानी से धोएं, फिर उन्हें 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें, और उन्हें कागज से सुखाएं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पानी स्नान सेट करें, और डीएमईएम को 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.5 यू / एमएल कोलेजनेज़, 3 यू / एमएल डिस्पेस ( सामग्री की तालिका देखें), और 50 एमएल ट्यूब (एस) में 0.2% बीएसए के साथ मिलाकर पाचन मिश्रण (20 एमएल / पशु) तैयार करें।
  3. सेल कल्चर हुड में 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से पाचन मिश्रण को पारित करें।
    नोट: हर बार पाचन मिश्रण को ताजा तैयार करने की सिफारिश की जाती है।

2. पाचन के बाद अभिकर्मक और उपकरण तैयार करना

  1. पाचन के बाद, मिश्रण को जमे हुए या सुसंस्कृत किया जा सकता है। ठंड के लिए, 10% डीएमएसओ: 90% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), साथ ही क्रायोट्यूब का एक सेट (1 एमएल सेल निलंबन प्रति 2 एमएल क्रायोट्यूब) तैयार करें। संस्कृति के लिए, संस्कृति माध्यम (डीएमईएम 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 4 एनजी / एमएल बीएफजीएफ, और 20% एफबीएस के साथ पूरक) और 8-वेल प्लेटों का एक सेट तैयार करें। कोशिकाओं को चढ़ाने से पहले प्लेटों को लेपित किया जाना चाहिए (विवरण चरण 7.1 में प्रदान किए गए हैं)।
  2. धुंधला होने के लिए, फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) (8-वेल प्लेट का 0.15 एमएल / वेल) और ब्लॉकिंग समाधान (पीबीएस में 5% आईजीजी-मुक्त गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए]; 8-वेल प्लेट का 0.15 एमएल /
    सावधानी: पीएफए पाउडर में सांस न लें; इसे एक रासायनिक हुड के नीचे तैयार करें और संभालें।

3. विच्छेदन

  1. इच्छामृत्यु वाले जानवर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। पेट के स्तर पर बड़ी कैंची से क्षैतिज चीरा (शरीर के बाईं ओर दाईं ओर) करें, और कमर के चारों ओर काट लें। मांसपेशियों को प्रकट करने के लिए त्वचा को हिंदलिम्ब्स से खींचें (चित्रा 1 ए)।
  2. जानवर को एल्यूमीनियम पन्नी से ढके कॉर्क प्लेट पर रखें, और विपरीत फोरलिम्ब और हिंदलिम्ब को पिन करें। जल्दी से सभी हिंदलिम्ब मांसपेशियों (सामने और पीछे) को बर्फ पर रखे 10 सेमी पेट्री डिश में हटा दें (चित्रा 1 बी, सी)। क्वाड्रिसेप्स और पीछे की मांसपेशियों के आसपास के क्षेत्रों से वसा ऊतक को हटाने के लिए विशेष देखभाल करें। प्रावरणी, तंत्रिकाओं और कण्डरा को भी इस बिंदु पर हटाया जा सकता है यदि यह विच्छेदन पर खर्च किए गए समग्र समय से समझौता नहीं करता है।
    नोट: दोनों हिंदअंगों के लिए एक इष्टतम विच्छेदन समय लगभग 15-20 मिनट होना चाहिए। यह सलाह दी जाती है कि विच्छेदन का समय 30 मिनट से अधिक न हो।
  3. मांसपेशियों को नम रखने के लिए कभी-कभी डीएमईएम की बूंदें जोड़ें, लेकिन बहुत ज्यादा नहीं, क्योंकि इससे काटना मुश्किल हो जाएगा। दूसरे हिंदलिम्ब के लिए दोहराएं। एक बार जब एक जानवर की सभी मांसपेशियां पेट्री डिश (चित्रा 1 डी) में होती हैं, तो उन्हें चिकनी होमोजेनेट प्राप्त करने के लिए 7-10 मिनट के लिए कैंची से बारीक काट लें (चित्रा 1 ई)।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, डीएमईएम एल-ग्लूटामाइन, पाइरूवेट और 4.5 ग्राम / एल डी-ग्लूकोज के साथ पूरक है।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व-संस्कृति मांसपेशियों की तैयारी। (ए) त्वचा को हिंदलिम्ब मांसपेशियों को प्रकट करने के लिए हटा दिया जाता है, जैसा कि चरण 3.1 में वर्णित है। (बी, सी) सभी हिंदलिंब मांसपेशियों को हड्डियों के चारों ओर (बी) और (सी) हड्डियों के बीच काटा जाता है, जैसा कि चरण 3.2 में वर्णित है। (डी) कटी हुई मांसपेशियों को डीएमईएम बूंदों के साथ बर्फ पर 10 सेमी पेट्री डिश में रखा जाता है ताकि उन्हें नम रखा जा सके, जैसा कि चरण 3.3 में वर्णित है। (ई) मांसपेशियों को कैंची से बारीक काट दिया जाता है जब तक कि इस छवि में चित्रित स्थिरता के साथ एक चिकनी पेस्ट प्राप्त न हो जाए। (एफ) अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद गोली की एक छवि; नीला तीर गोली को उजागर करता है, जो ट्यूब के खिलाफ है, डैश ्ड ब्लू लाइन के नीचे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. पाचन

ध्यान दें: पाचन के अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सेंट्रीफ्यूज, बर्फ की एक बाल्टी, तीन सेल छन्नी (100 उम, 70 उम, 40 यूएम), और तीन 50 एमएल ट्यूब (प्रति जानवर) खंड 5 के लिए आवश्यक हैं।

  1. चरण 1.2 में वर्णित पाचन मिश्रण तैयार करें और फ़िल्टर करें। मिश्रण को बर्फ पर रखें।
  2. एक बार जब सभी मांसपेशियां कट जाती हैं, तो होमोजेनेट को 20 एमएल पाचन मिश्रण के साथ 50 एमएल ट्यूब में रखें। रिसाव को रोकने के लिए ढक्कन के किनारों को लचीली फिल्म के साथ लपेटें, और ट्यूब को कम से मध्यम गति (50 आरपीएम) पर 37 डिग्री सेल्सियस हिलने वाले पानी के स्नान में रखें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के बाद, ढक्कन खोलें, और एक समरूप मिश्रण प्राप्त करने के लिए 10 एमएल पिपेट के साथ सात बार ऊपर और नीचे धीरे-धीरे पाइप करके मिलाएं। ढक्कन के चारों ओर नई फिल्म लागू करें, और इसे हिलाते पानी के स्नान में वापस रखें। 1 घंटे के बाद, ट्यूब को हटा दें, और स्नान बंद कर दें।
    नोट: संस्कृति के लिए, अनुभाग 5 पर जाने से पहले चरण 7.1 में वर्णित प्लेटों को कोट करने के लिए इस इनक्यूबेशन समय का उपयोग करें।

5. निस्पंदन

  1. 50 एमएल तक ठंडे डीएमईएम (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के साथ पाचन ट्यूब भरें। ट्यूब को तीन बार घुमाकर मिलाएं। डीएमईएम को अगले चरणों के लिए बर्फ की बाल्टी में रखें।
  2. एक नई 50 एमएल ट्यूब पर 100 μm सेल छन्नी रखें। सेल स्ट्रेनर के माध्यम से पचे हुए मिश्रण को नई ट्यूब में पारित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को तरल अपशिष्ट कंटेनर में डालें।
  3. 1 एमएल ठंडे डीएमईएम (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) में गोली को फिर से निलंबित करें। उसी डीएमईएम के साथ 50 एमएल तक ट्यूब भरें। नोट: यदि सेंट्रीफ्यूजिंग को छोड़ दिया जाता है, तो अगली गोली को पहचानना और बनाए रखना अधिक कठिन होगा।
  4. एक नई 50 एमएल ट्यूब पर 70 μm सेल छन्नी रखें। सेल स्ट्रेनर के माध्यम से सेंट्रीफ्यूज/ रिसस्पेंडेड मिश्रण को नई ट्यूब में पारित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 80 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: यह कदम अनिवार्य नहीं है लेकिन सेल मलबे को खत्म करने के लिए अनुशंसित है।
  5. एक नई 50 एमएल ट्यूब पर 40 μm सेल छन्नी रखें। सेल स्ट्रेनर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला को नई ट्यूब में पारित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज, सतह पर तैरनेवाला को तरल अपशिष्ट कंटेनर में डालें, और कल्चर हुड के तहत एफबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। इस चरण में गोली बहुत छोटी है (चित्रा 1 एफ)।
    नोट: 40 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करना मलबे को हटा देता है, जो संस्कृतियों के बाद के धुंधलापन में एक गैर-विशिष्ट संकेत देगा।

6. (वैकल्पिक) फ्रीजिंग

नोट: धारा 6 वैकल्पिक है। फ़िल्टर करने के बाद प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है, लेकिन यह सेल अस्तित्व और संस्कृति की सफलता को कम कर सकता है।

  1. 10% डीएमएसओ: 90% एफबीएस अनुपात प्राप्त करने के लिए डीएमएसओ जोड़ें, और क्रायोट्यूब (प्रति 2 एमएल क्रायोट्यूब में 1 एमएल रिसस्पेंडेड पेलेट का 1 एमएल) में स्थानांतरित करें।
  2. क्रायोट्यूब को रात भर पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। दीर्घकालिक भंडारण के लिए अगले दिन -150 डिग्री सेल्सियस पर जाएं।
    नोट: -80 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक भंडारण भी संभव है।
  3. संस्कृति शुरू करते समय, क्रायोट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से पिघलाएं जब तक कि सेल निलंबन पिघल न जाए। संस्कृति हुड के तहत डीएमईएम के 4 एमएल के साथ मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर स्पिन करें। सतह पर तैरने वाले को बाहर निकालें, और चरण 7.2 में वर्णित के रूप में जारी रखें।

7. खेती

नोट: जमे हुए या ताजा सेल निलंबन से तीन से चार 8-वेल प्लेटों के 24-32 कुओं को भरने की उम्मीद की जा सकती है।

  1. कोटिंग समाधान के साथ 8-वेल प्लेटों को कोट करें, जिसे 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर पिघलाया जाना चाहिए (स्टॉक कोटिंग समाधान आमतौर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है)। एक कुएं में 0.4 एमएल कोटिंग घोल जोड़ें, और इसे अच्छी तरह से अच्छी तरह से पिपेट करें। सभी कुओं के माध्यम से कोटिंग समाधान को स्थानांतरित करने के बाद, इसे भविष्य की संस्कृतियों के लिए फिर से याद किया जा सकता है और फिर से जमे हुए किया जा सकता है। कोशिकाओं को चढ़ाने से पहले लेपित प्लेटों को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. 20% एफबीएस: 80% डीएमईएम अनुपात प्राप्त करने के लिए एफबीएस-सेल निलंबन में 4 एनजी / एमएल बीएफजीएफ ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक डीएमईएम (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) जोड़ें।
    नोट: भले ही बीएफजीएफ को जोड़ना प्राथमिक मायोब्लास्ट संस्कृतियों और थोक संस्कृतियों में उपग्रह जैसे सेल उत्पादन में फायदेमंद हो सकता है, लेकिन इसका जोड़ वैकल्पिक है, क्योंकि ~ 7 दिनों की थोक संस्कृतियों में इसकी चूक सेल पैदावार से गंभीर रूप से समझौता नहीं करती है।
  3. लेपित 8-वेल प्लेटों में प्रति कुएं (चरण 7.2 से) निलंबन की प्लेट 0.4 मिलीलीटर।
    नोट: जमे हुए और ताजा तैयारी के लिए प्रति जानवर 30 सेमी2 कल्चर की गणना करें।
  4. संस्कृतियों को 10 दिनों तक 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, संस्कृति के पीले रंग (आमतौर पर 5-7 दिन) में बदलने के बाद हर दिन माध्यम को बदलें।
    नोट: सेल चक्र 13 के एस चरण में कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए, निर्धारण से पहले10 μM EdU 2 h जोड़ें। पहले एस चरण को पकड़ने के लिए, प्लेटिंग से 10 μM EdU जोड़ें, और संस्कृति के 40 घंटे पर ठीक करें।

8. निर्धारण

नोट: अनुभाग 8-10 को कमरे के तापमान पर आयोजित किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो।

  1. कल्चर माध्यम को पाइप करें, और कोशिकाओं को 4% पीएफए (0.15 एमएल / वेल) के साथ ठीक करें।
    सावधानी: रासायनिक हुड के नीचे पीएफए जोड़ें।
    नोट: यदि सभी कुएं एक ही समय में तय किए जाते हैं, तो 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीएफए के साथ इनक्यूबेट करें। यदि कुओं को अलग-अलग समय बिंदुओं पर तय किया जाता है, तो ठीक किए जाने वाले कुओं में पीएफए जोड़ें, और इनक्यूबेटर में प्लेट को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. पीएफए को बाहर निकालें, और 10 एस (0.15 एमएल / वेल) के लिए पीबीएस जोड़ें। पीबीएस को पिपेट करें, और 5 मिनट (0.15 एमएल / वेल) के लिए ताजा पीबीएस जोड़ें।
    नोट: यदि सभी कुएं एक ही समय में तय किए जाते हैं, तो कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ इनक्यूबेट करें। यदि कुओं को अलग-अलग समय बिंदुओं पर तय किया जाता है, तो पीबीएस को निश्चित कुओं में जोड़ें, और इनक्यूबेटर में प्लेट को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। फिर, पीबीएस के 0.4 एमएल जोड़ें, और प्लेट को इनक्यूबेटर में 1 सप्ताह तक रखें।

9. परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग

  1. दाग लगाने के लिए तैयार होने पर, पीबीएस को पिपेट करें, और 8 मिनट के लिए पीबीएस (0.15 एमएल / वेल) में 0.5% ट्राइटनएक्स 100 के साथ छिड़काव करें। ट्राइटनएक्स 100 को पिपेट करें, पीबीएस के साथ 10 सेकंड (0.15 एमएल / वेल) के लिए कुल्ला करें, पीबीएस को पिपेट करें, और पीबीएस के साथ 5 मिनट (0.15 एमएल / वेल) के लिए धो लें।
  2. 30-60 मिनट (0.15 एमएल / वेल) के लिए पीबीएस में 5% आईजीजी-मुक्त बीएसए के साथ ब्लॉक।

10. धुंधला होना

  1. बीएसए को बाहर निकालें, और पीबीएस (0.15 एमएल / वेल) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें; कमजोर पड़ने वाले: एंटी-सीडी 31 1: 100, एंटी-एफओएसबी 1: 200, एंटी-जीएफपी 1: 1,000, एंटी-केआई 67 1: 1,000, एंटी-मायएचसी 1: 400, एंटी-मायोडी 1: 200, एंटी इनक्यूबेशन-एमओओडी 1: 100, एंटी-एमओजी 1: 150, एंटी-एमओजी 1: 100, एंटी-एमओजी 1: 100, एंटी-150
    नोट: एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, एंटीबॉडी मिश्रण इकट्ठा करें, सोडियम एज़ाइड जोड़ें, और भविष्य के पुन: उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस (एंटीबॉडी निर्माता के निर्देशों के अनुसार) पर रखें।
  2. एंटीबॉडी मिश्रण को पिपेट करें, पीबीएस के साथ 10 सेकंड (0.15 एमएल / वेल) के लिए कुल्ला करें, पीबीएस को पिपेट करें, और 5 मिनट (0.15 एमएल / वेल) के लिए पीबीएस से धो लें।
  3. वॉशिंग पीबीएस को बाहर निकालें, द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण (बकरी एंटी-माउस एलेक्सा फ्लुर 488, बकरी एंटी-रैबिट एलेक्सा फ्लुर 555, बकरी एंटी-रैट एलेक्सा फ्लुर 647, बकरी एंटी-माउस एलेक्सा फ्लुर 555, बकरी एंटी-चिकन एलेक्सा फ्लुर 488, सभी 1: 500-1,000 के कमजोर पड़ने पर उपयोग किया जाता है) और न्यूक्लियस मार्कर (जैसे, डीएपीआई) को पीबीएस (0.15 एमएल) में पतला करें। और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश से सुरक्षित।
  4. द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण को पिपेट करें, पीबीएस के साथ 10 सेकंड (0.15 एमएल / वेल) के लिए कुल्ला करें, पीबीएस को बाहर निकालें, पीबीएस के साथ 5 मिनट (0.15 एमएल / वेल) के लिए धोएं, पीबीएस को बाहर निकालें, और माउंट करें।
    नोट: यदि हटाने योग्य विभाजक के साथ 8-अच्छी प्लेटों का उपयोग किया जाता है, तो बढ़ने से पहले विभाजक को छील लें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल उपग्रह कोशिकाओं और अधिकांश कोशिकाओं को उनके अंतर्जात आला से संरक्षित करते हुए मांसपेशी कोशिका संस्कृति की अनुमति देता है। चित्रा 2 प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों को सारांशित करता है, जबकि विच्छेदन और पाचन के आवश्यक भागों को चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है। हिंदलिम्ब मांसपेशियों के विच्छेदन की सिफारिश की जाती है (चित्रा 1 ए-सी), क्योंकि मांसपेशियों के इस समूह का अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है और एक विकासात्मक उत्पत्ति और आणविक पदानुक्रम14 साझा करता है। बाँझ परिस्थितियों में सभी मिश्रणों को तैयार करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, कम संस्कृति संदूषण देखा गया जब पाचन मिश्रण को सेल कल्चर हुड के तहत 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित किया गया था।

जब 1 सेमी2 वेल प्लेटों पर लेपित थोक तैयारी का 1/30 चढ़ाना होता है, तो संस्कृति शुरू होने के 3-4 दिन बाद लम्बी कोशिकाएं दिखाई देती हैं। हालांकि, यह सेल एकाग्रता के आधार पर भिन्न हो सकता है, और लम्बी कोशिकाएं बाद में दिखाई देना शुरू कर सकती हैं, खासकर जब जमे हुए थोक तैयारी का विस्तार होता है। लगभग 7 दिन बाद, माध्यम पीला हो जाना चाहिए था, और इस बिंदु पर, दैनिक माध्यम परिवर्तन की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, इस बिंदु पर, कुओं को मायोट्यूब के साथ कवर करने की आवश्यकता होती है। एंडोथेलियल कोशिकाएं संस्कृति का एक मामूली अंश बनाती हैं। एक सफल संस्कृति का मुख्य संकेत प्रचुर मात्रा में पैक्स 7 + कोशिकाएं हैं, जिन्हें निर्धारण और धुंधला करने की आवश्यकता हो सकती है। एक सुविधाजनक माउस मॉडल जिसका उपयोग संभव होने पर किया जा सकता है वह है टीजी: पैक्स 7-एनजीएफपी लाइन12, जो जीएफपी अभिव्यक्ति के रूप में पैक्स 7 सकारात्मकता के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है; इस प्रकार, रिपोर्टर जीएफपी द्वारा उपग्रह कोशिकाओं का आसानी से पता लगाया जा सकता है। जीएफपी को उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर 20x आवर्धन पर देखा जा सकता है, इस प्रकार संस्कृति की सफलता के विश्लेषण की अनुमति मिलती है, जबकि संस्कृति चल रही है। यह थोक संस्कृतियों में पैक्स 7-जीएफपी कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग को भी संभव बनाता है। संस्कृतियों को 10 दिनों से अधिक नहीं छोड़ा जाना चाहिए। उसके बाद, आरक्षित कोशिकाएं संख्या में गिरावट शुरू करती हैं, और मायोट्यूब प्लेट से अलग हो सकते हैं। जमे हुए कोशिकाओं से संस्कृतियों के साथ हाल के अनुभव के आधार पर असफल संस्कृतियां अभी भी फाइबर का एक बड़ा अनुपात उत्पन्न कर सकती हैं लेकिन बहुत कम पैक्स 7-जीएफपी कोशिकाएं। पैक्स 7 के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर के बिना चूहों का उपयोग करते समय, आरक्षित सेल पीढ़ी की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए धुंधला प्रदर्शन करना आवश्यक है।

निम्नलिखित एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया है और प्रोटोकॉल खंड 10 में प्रस्तुत धुंधला प्रोटोकॉल के साथ अच्छी तरह से काम करता है: एंटी-पैक्स 7 (उपग्रह कोशिकाओं और सक्रिय मायोब्लास्ट्स 15 का एक मार्कर; इस संस्कृति में उभरने वाली आरक्षित कोशिकाओं का एक मार्कर भी), एंटी-मायोसिन (मायोट्यूब15 का एक मार्कर), एंटी-सीडी 31 (एंडोथेलियल कोशिकाओं का एक मार्कर16), एंटी-जीएफपी (यदि रिपोर्टर चूहों का उपयोग किया जाता है), एंटी-मायोडी (मायोब्लास्ट्स 15 का एक मार्कर), एंटी-एमएजीओजी (मायोसाइट्स 15 को अलग करने का एक मार्कर), एंटी-केआई 67 (कोशिकाओं के प्रसार का एक मार्कर17), और एंटी-पीडीजीएफआर (एफएपी15 का एक मार्कर)। चित्रा 3 संस्कृति में 7 दिनों के बाद मायोजेनिक और आला कोशिकाओं को दर्शाता है। चित्रा 3 ए-सी के संबंध में, मांसपेशियों के थोक को जंगली प्रकार के चूहों से सुसंस्कृत किया गया था, जबकि चित्रा 3 डी-एफ के लिए, मांसपेशियों के थोक को उपरोक्त टीजी: पैक्स 7-एनजीएफपी लाइन से संवर्धित किया गया था। पैक्स 7 और केआई 67 (चित्रा 3 ए) के साथ डबल धुंधलापन ने उन आरक्षित कोशिकाओं को चिह्नित करने की अनुमति दी जो संस्कृति में 5 दिनों के बाद दिखाई दीं और मांसपेशियों की स्टेम सेल विशेषताएं थीं, जैसे कि सेल चक्र से बाहर निकलना (केआई 67- स्थिति) और गठित मायोट्यूब के लिए "उपग्रह" के रूप में स्थानीयकरण। MyHC और MYOG (चित्रा 3B, D, E) के साथ डबल धुंधलापन ने मांसपेशियों के भेदभाव के माध्यम से उन्नत कोशिकाओं को चिह्नित करने की अनुमति दी और इस प्रकार, उत्तरोत्तर व्यक्त MYOG और फिर बहुउद्देशीय MyHC + मायोट्यूब बनाने के लिए विलय कर दिया। सीडी 31 या पीडीजीएफआर के साथ धुंधला करने से आला कोशिकाओं (चित्रा 3 सी), जैसे एंडोथेलियल कोशिकाओं और एफएपी को चिह्नित करने की अनुमति दी जाती है। चित्रा 3 डी, ई जीएफपी द्वारा चिह्नित उभरती हुई आरक्षित कोशिकाओं को दर्शाता है। जीएफपी और मायएचसी के साथ सह-धुंधला होने से आरक्षित कोशिकाओं की उपग्रह कोशिका स्थिति का मूल्यांकन करने की अनुमति मिलती है (चित्रा 3ई), जबकि जीएफपी और अन्य सक्रियण/विभेदन मार्करों के साथ सह-धुंधला करने से आरक्षित कोशिकाओं की क्वीसेंट जैसी प्रकृति का मूल्यांकन करने की अनुमति मिलती है (चित्रा 3एफ)।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल चरणों का अवलोकन। (A-D) (ए) विच्छेदन, (बी) पाचन, (सी) निस्पंदन, और (डी) संस्कृति के अनुक्रमिक चरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल आबादी का इम्यूनोस्टेनिंग। (ए) मायोजेनिक (पैक्स 7; हरे रंग द्वारा चिह्नित) और साइक्लिंग (केआई 67; लाल द्वारा चिह्नित) कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस। नाभिक को DAPI (नीले) के साथ प्रतिरूप किया जाता है। गैर-साइक्लिंग मायोजेनिक कोशिकाओं (केआई 67-पैक्स 7 +) की उपस्थिति से पता चलता है कि प्रोटोकॉल जंगली प्रकार के चूहों से क्विसेंट जैसी कोशिकाओं का उत्पादन कर सकता है जो संस्कृति के 7 दिनों में प्रचुर मात्रा में हैं। (बी) जंगली प्रकार के चूहों से कोशिकाओं की संस्कृति के 7 दिनों के बाद मायोट्यूब (मायोसिन भारी श्रृंखला [MyHC]; हरा) और मायोसाइट्स (MYOG; लाल द्वारा चिह्नित) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस। नाभिक को DAPI (नीले) के साथ प्रतिरूप किया जाता है। (सी) जंगली प्रकार के चूहों से कोशिकाओं की संस्कृति के 7 दिनों के बाद मायोजेनिक कोशिकाओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस (पैक्स 7; हरे रंग द्वारा चिह्नित), मेसेनकाइमल फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों (पीडीजीएफआरए; लाल द्वारा चिह्नित), और एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीडी 31; मैजेंटा द्वारा चिह्नित)। नाभिक को DAPI (नीले) के साथ प्रतिरूप किया जाता है। (डी) जीएफपी + कोशिकाओं (हरे) और मायोसाइट्स (MYOG; मैजेंटा द्वारा चिह्नित) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस टीजी: पैक्स 7-एनजीएफपी चूहों से कोशिकाओं की संस्कृति के 8 दिनों के बाद, जिसमें पैक्स 7-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को परमाणु जीएफपी द्वारा चिह्नित किया जाता है। (ई) टीजी: पैक्स 7-एनजीएफपी चूहों से कोशिकाओं की संस्कृति के 7 दिनों के बाद जीएफपी + कोशिकाओं (हरे) और मायोट्यूब (MyHC; लाल द्वारा चिह्नित) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस। ध्यान दें कि उपग्रह-कोशिका जैसी कोशिकाएं 7 दिनों के बाद संस्कृति में दिखाई देती हैं। (एफ) जीएफपी + सेल अनुपात का परिमाणीकरण जो उपग्रह कोशिकाओं (पैक्स 7), सक्रियण (एफओएसबी), प्रसार (केआई 67), या मायोजेनिक भेदभाव (एमवाईओडी, एमओजी) के मार्करों को सह-व्यक्त करता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं। स्केल बार: 100 um। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वयस्क कंकाल की मांसपेशी समारोह को सेलुलर इंटरैक्शन और आणविक संकेतों के एक बारीक व्यवस्थित सेट द्वारा रेखांकित किया जाता है। यहां, एक विधि प्रस्तुत की जाती है जो एक पूर्व विवो सेटिंग में इन मापदंडों के अध्ययन की अनुमति देती है जो शारीरिक माइक्रोएन्वायरमेंट से निकटता से मिलती-जुलती है।

कई समूहों ने मायोजेनिक कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए इन विट्रो विधियों की सूचना दी है। इन विधियों का उद्देश्य उपग्रह कोशिकाओं को उनके मायोजेनिक पूर्वज गुणों का अध्ययन करने के लिए अलग करना था। शुद्ध उपग्रह कोशिकाओं को अलग करने के लिए दो मुख्य दृष्टिकोणों का उपयोग किया जाता है, या तो सोलस और / या ईडीएल मांसपेशियों18से पृथक तंतुओं की संस्कृतियों से या एफएसीएस-पृथक उपग्रह कोशिकाओं से, थोक मांसपेशियों से, सकारात्मक चयन के लिए पैक्स 7, सीडी 34, और ए 7-इंटीग्रिन के लिए एंटीबॉडी के एक पैनल का उपयोग करके और नकारात्मक चयन के लिए सीडी 45, सीडी 31, और एससीए 1 19,20,21।. अन्य लोगों ने एफएपी22,23 जैसे अन्य कोशिकाओं की तुलना में जिलेटिन-प्लेटेड प्लेटों पर थोक संस्कृतियों से प्राथमिक मायोब्लास्ट्स को अलग करने के लिए यांत्रिक नल ों का भी उपयोग किया है। जबकि ये दृष्टिकोण उपग्रह कोशिकाओं के सक्रियण का अध्ययन करने या संस्कृति में उनका विस्तार करने के लिए उपयुक्त हैं, कोशिकाएं सहायक कोशिकाओं से वंचित वातावरण में बढ़ती हैं जो आमतौर पर उनके आला में योगदान करती हैं। इसके अलावा, इन दृष्टिकोणों को मायोजेनिक पूर्वजों को 2 सप्ताह से अधिक समय तक रखने की आवश्यकता होती है ताकि उच्च पैक्स 7 अभिव्यक्ति18 के साथ क्विसेंट मोनोन्यूक्लियेटेड रिजर्व कोशिकाओं को स्थापित किया जा सके। उपग्रह कोशिकाओं और मैक्रोफेज जैसे अन्य सेल प्रकारों की सह-संस्कृतियों की भी सूचना दी गई है। इसने प्रसार, भेदभाव और संलयन24 जैसे मायोजेनिक गुणों के लिए एक विशिष्ट सेल के प्रत्यक्ष योगदान के अध्ययन को सक्षम किया है। कई एकल-कोशिका आरएनए-सेक अध्ययनों ने कंकाल की मांसपेशी25,26 के सेलुलर मेकअप को विस्तृत किया है। जैसा कि हमारी संस्कृति की स्थिति मायोजेनिक कोशिकाओं की पीढ़ी के पक्ष में है, हमने विवो अध्ययनों में इनकी तुलना में थोक संस्कृतियों में आरक्षित कोशिकाओं का बहुत अधिक अनुपात और समर्थन कोशिकाओं का कम अनुपात देखा है।

यहां वर्णित विधि में तीन महत्वपूर्ण चरणों की पहचान की गई है जो दक्षता बढ़ा सकते हैं। सबसे पहले, पाचन के 2 घंटे के दौरान इष्टतम मांसपेशी पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए तेज और कुशल चॉपिंग आवश्यक है और बाद में, एक उच्च सेल उपज। दूसरे, ऊतक के माध्यम से एंजाइमों के उचित प्रसार को सुनिश्चित करने के लिए पाचन के दौरान निरंतर रोटेशन बहुत महत्वपूर्ण है। अंत में, इष्टतम ऊतक पृथक्करण के लिए कोमल यांत्रिक पृथक्करण भी महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल की चार मुख्य सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह एक पूर्व विवो प्रणाली बनी हुई है, जिसका अर्थ है कि कुछ शारीरिक और बायोफिज़िकल संकेत खो सकते हैं या बदल सकते हैं। इसमें मांसपेशी फाइबर से / से संकेत देना शामिल है, क्योंकि चढ़ाना से पहले फाइबर खो जाते हैं, और संस्कृति के दौरान मायोट्यूब का पुनर्निर्माण किया जाता है। दूसरे, यह देखा जाना बाकी है कि क्या गठित मायोट्यूब में भ्रूण या वयस्क विशेषताएं हैं और क्या वे धीमी और तेज मांसपेशियों में विभिन्न फाइबर प्रकारों का प्रतिनिधित्व करते हैं। संदर्भ के लिए, सी 2 सी 12 मांसपेशी सेल लाइन और मानव मायोब्लास्ट ्स की संस्कृतियों से पता चला है कि 2 डी संस्कृति में मायोट्यूब विवो समकक्षों27,28 की तुलना में कम परिपक्व हैं, जबकि प्राथमिक माउस मायोब्लास्ट संस्कृतियां विवो29 में पाए जाने वाले मायोसिन प्रकारों के प्रतिनिधि हैं। तीसरा, इस विधि के साथ, ऊतक पृथक्करण के दौरान कोशिकाएं अपनी सीटू स्थिति खो देती हैं, और नवगठित मायोट्यूब में न्यूरोमस्कुलर और मायोटेंडिनस जंक्शनों की कमी होती है; इस प्रकार, स्थानिक विशेषताओं पर परिणामों को सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। चौथा, प्रस्तुत प्रोटोकॉल को स्वस्थ वयस्क मांसपेशियों के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन अनुकूलन आवश्यक हो सकता है यदि शुरुआती सामग्री वृद्ध या मायोपैथिक मांसपेशियों से उत्पन्न होती है जो व्यापक फाइब्रोसिस, एडिपोजेनिक जमाव में वृद्धि, या समझौता सेल सक्रियण पेश करती है।

इन सीमाओं में से अधिकांश पूर्व विवो मांसपेशी अध्ययन के अन्य तरीकों के लिए आम हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल में उन पर कई फायदे हैं। यह एकमात्र प्रोटोकॉल है जो बड़ी संख्या में क्विसेंट जैसे आरक्षित उपग्रह कोशिकाओं की कटाई की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह एक सस्ती और सीधी विधि का प्रतिनिधित्व करता है जिसे प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, भ्रूण स्टेम सेल, मायोस्फीयर कल्चर या ऑर्गनॉइड कल्चर से जुड़ी विशेष संस्कृति स्थितियों या विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, थोक संस्कृति जटिल बुनियादी ढांचे और मानकीकरण पर निर्भर नहीं करती है जो हाइड्रोगेल या अन्य मचानों में मायोजेनिक कोशिकाओं की संस्कृतियों से जुड़ी है। पृथक मायोफाइबर, एफएसीएस-पृथक प्राथमिक कोशिकाओं, या प्रीप्लेटिंग-समृद्ध प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृतियों की तुलना में, थोक संस्कृति अधिक सेल आबादी को संरक्षित करती है जो शारीरिक मांसपेशी वातावरण में मौजूद हैं। ये कोशिकाएं आमतौर पर विवो30,31 में मांसपेशियों के उत्थान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सांप के जहर से चरम और असामान्य संकेतों के बजाय संस्कृति माध्यम के विकास कारकों द्वारा संचालित सक्रियण और भेदभाव के अपेक्षाकृत शारीरिक पथ से गुजरती हैं। अंत में, प्रस्तुत सेल संस्कृति सी 2 सी 12 कोशिकाओं का उपयोग करने पर फायदेमंद है, जो किसी भी सेल लाइन के साथ, अंतर्जात या प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में आनुवंशिक परिवर्तन हैं।

उपरोक्त फायदे इस प्रोटोकॉल को सेल प्रवर्धन और एक क्विसेंट-जैसे उपग्रह सेल पूल की पीढ़ी जैसे अनुप्रयोगों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं, जो सेल थेरेपी विकसित करने के लिए आवश्यक हैं या यहां तक कि क्विसेंस और सेलुलर / आणविक विनियमन पर मौलिक सवालों के जवाब भी देते हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग दवाओं, सीआरएनए लक्ष्यीकरण, या वैक्टर (प्लास्मिड, वायरस) के साथ अभिकर्मक के माध्यम से आणविक सिग्नलिंग को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है जो रुचि के कारकों के प्रमुख नकारात्मक रूपों के अतिवृद्धि या अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

चित्रा 2 के लिए, सर्वियर मेडिकल आर्ट (https://smart.servier.com/) के टेम्प्लेट का उपयोग किया गया था। एफआर प्रयोगशाला को एसोसिएशन फ्रैंकाइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथिस - एएफएम के माध्यम से ट्रांसलामसल (अनुदान 19507 और 22946), फोंडेशन पोर ला रेचरचे मेडिकेल - एफआरएम (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), एजेंस नेशनल े पोर ला रेचरचे - एएनआर (एएनआर -21-सीई 13-0006-02, एएनआर -19-सीई 13-0006-02, एएनआर -19-सीई 13-13-13-10) द्वारा समर्थित किया गया है। उपरोक्त फंडर्स की इस अध्ययन के डिजाइन, संग्रह, विश्लेषण, व्याख्या, या रिपोर्टिंग या इस पांडुलिपि के लेखन में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD31 BD 550274 dilution 1:100
anti-FOSB Santa Cruz sc-7203 dilution 1:200
anti-GFP Abcam ab13970 dilution 1:1000
anti-Ki67 Abcam ab16667 dilution 1:1000
anti-MyHC DSHB MF20-c dilution 1:400
anti-MYOD Active Motif 39991 dilution 1:200
anti-MYOG Santa Cruz sc-576 dilution 1:150
anti-Pax7 Santa Cruz sc-81648 dilution 1:100
anti-PDGFRα Invitrogen PA5-16571 dilution 1:50
b-FGF Peprotech 450-33 concentration 4 ng/mL
Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion  Sigma Aldrich A7906-1006 concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining Jackson ImmunoResearch 001-000-162 concentration 5%
Cell strainer 40 um Dominique Dutscher 352340
Cell strainer 70 um Dominique Dutscher 352350
Cell strainer 100 um Dominique Dutscher 352360
Collagenase Roche 10103586001 concentration 0.5 U/mL
Culture plate Sarstedt 94.6140.802
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Euromedex UD8050-05-A
Dispase Roche 4942078001 concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5 Fine Science Tools 91150-20
Dissection forceps size 55 Fine Science Tools 11295-51
Dissection scissors (big, straight) Fine Science Tools 9146-11 ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved) Fine Science Tools 15017-10
Dissection scissors (small, straight) Fine Science Tools 14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 41966-029
EdU Click-iT kit ThermoFisher C10340
Fetal bovine serum – option 1 Eurobio CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2 Gibco 10270-106 
Matrigel Corning Life Sciences 354234 coating solution
Parafilm Dominique Dutscher 090261 flexible film
Paraformaldehyde – option 1 PanReac AppliChem ITW Reagents 211511.1209 concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2 ThermoFisher 28908 concentration 4%
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122
Shaking water bath ThermoFisher TSSWB27
TritonX100 Sigma Aldrich T8532-500 ML concentration 0.5%
Wild-type mice Janvier C57BL/6NRj

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References

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माउस कंकाल की मांसपेशी की असमान थोक संस्कृति आला और स्टेम सेल की गतिशीलता को पुन: उत्पन्न करने के लिए
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Zaidan, L., Geara, P., Borok, M. J., Machado, L., Mademtzoglou, D., Mourikis, P., Relaix, F. Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence. J. Vis. Exp. (196), e65433, doi:10.3791/65433 (2023).

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