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Médecine

Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65447
,
1Faculty of Medicine,Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health,Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy,Universidade de Lisboa

Summary

La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.

Abstract

La tuberculose, première cause de décès par agent infectieux dans le monde, a tué 1,6 million de personnes en 2022, n’étant dépassée que par la COVID-19 pendant la pandémie de 2019-2021. La maladie est causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La souche de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), le seul vaccin contre la tuberculose, est le plus ancien vaccin homologué au monde, toujours utilisé. À l’heure actuelle, 12 vaccins font l’objet d’essais cliniques et des dizaines de vaccins sont en cours de développement préclinique. La méthode de choix utilisée pour évaluer l’efficacité des vaccins antituberculeux dans les études précliniques est le dénombrement des colonies bactériennes par le test des unités formant colonies (UFC). Ce test fastidieux prend de 4 à 6 semaines à conclure, nécessite un espace de laboratoire et d’incubateur important, a des coûts de réactifs élevés et est sujet à la contamination. Nous décrivons ici une méthode optimisée pour le dénombrement des colonies, la micro-UFC (mCFU), qui offre une solution simple et rapide pour analyser les résultats d’efficacité du vaccin contre la tubercule anti-M.tb . Le test mCFU nécessite dix fois moins de réactifs, réduit la période d’incubation par trois, prenant 1 à 2 semaines pour conclure, réduit l’espace de laboratoire et le coût des réactifs, et minimise les risques pour la santé et la sécurité associés au travail avec un grand nombre de M.tb. De plus, pour évaluer l’efficacité d’un vaccin antituberculeux, des échantillons peuvent être prélevés à partir de diverses sources, y compris des tissus d’animaux vaccinés infectés par des mycobactéries. Nous décrivons également une méthode optimisée pour produire une culture mycobactérienne unicellulaire, uniforme et de haute qualité pour les études d’infection. Enfin, nous proposons que ces méthodes soient universellement adoptées pour les études précliniques de détermination de l’efficacité des vaccins, ce qui, en fin de compte, conduirait à réduire le temps de développement des vaccins contre la tuberculose.

Introduction

La tuberculose est la principale cause de décès dans le monde causée par un seul agent infectieux, la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M.tb), qui tue plus de personnes que tout autre agent pathogène. En 2021, la tuberculose a été responsable de 1,6 million de décès et a été dépassée par la COVID-19 pendant la pandémie de 2019-20211. De plus, selon le rapport mondial sur la tuberculose de 2022 de l’Organisation mondiale de la santé, la pandémie de COVID-19 a été responsable d’une augmentation des nouveaux cas de tuberculose. L’OMS signale également une forte baisse du nombre de personnes diagnostiquées avec la tuberculose au cours de cette période, ce qui pourrait encore augmenter le nombre de cas de tuberculose1.

Le bacille de Calmette-Guérin (BCG) est une souche vivante atténuée de l’agent pathogène Mycobacterium bovis, utilisée pour la première fois comme vaccin il y a plus de 100 ans. C’est le seul vaccin contre la tuberculose et le plus ancien vaccin homologué au monde encore utilisé 2,3. À l’heure actuelle, 12 vaccins sont en cours d’essais cliniques4 et des dizaines de vaccins sont en cours de développement préclinique 5,6. L’évaluation préclinique des vaccins contre la tuberculose comprend l’évaluation de l’innocuité et de l’immunogénicité7, qui peut être obtenue dans divers modèles animaux tels que le poisson-zèbre, la souris, le cochon d’Inde, le lapin, le bétail et les primates non humains 8,9,10. De plus, l’évaluation de la capacité d’un vaccin à induire une protection contre l’infection et/ou la transmission de M.tb, c’est-à-dire l’efficacité du vaccin, nécessite une provocation M.tb in vivo 5,11. Il est intéressant de noter que la vaccination par le BCG induit des effets non spécifiques qui affectent la survie d’autres agents pathogènes bactériens et viraux12,13 par le mécanisme de l’immunité entraînée14. Pour quantifier la charge bactérienne viable chez un animal infecté, la méthode de choix est le dénombrement des colonies bactériennes à l’aide du test des unités formant colonie (UFC) 5,15. L’UFC est une unité qui estime le nombre de micro-organismes (bactéries ou champignons) qui forment des colonies dans des conditions de croissance spécifiques. Les UFC proviennent de micro-organismes viables et réplicatifs, et le nombre absolu de micro-organismes vivants au sein de chaque colonie est difficile à estimer. On ne sait pas avec certitude si une colonie provient d’un ou de plusieurs micro-organismes. L’unité UFC reflète cette incertitude, d’où une grande variabilité peut être observée dans les répétitions d’un même échantillon. Ce test qui prend beaucoup de temps nécessite des techniciens spécialisés formés pour travailler dans une installation de niveau de biosécurité 3 (BSL3), un espace de laboratoire et d’incubateur important, prend de 4 à 6 semaines pour être conclu et est sujet à la contamination.

Dans cette étude, nous décrivons une méthode optimisée pour le dénombrement des colonies, le micro-UFC (mCFU), et proposons une solution simple et rapide pour analyser les résultats 15,16,17,18,19,20. Le test mCFU nécessite dix fois moins de réactifs, réduit la période d’incubation par trois, prenant 1 à 2 semaines pour conclure, réduit l’espace de laboratoire et le coût des réactifs, et minimise les risques pour la santé et la sécurité associés au travail avec un grand nombre de M.tb. Nous proposons que cette méthode soit universellement adoptée pour les études précliniques de détermination de l’efficacité des vaccins, ce qui conduirait à terme à une réduction du temps nécessaire à la mise au point de vaccins contre la tuberculose. Enfin, cette méthode optimisée de dénombrement de l’UFC a été utilisée pour quantifier non seulement les mycobactéries mais aussi d’autres bactéries, telles que Escherichia coli et Ralstonia solanacearum21.

Protocol

REMARQUE : Le protocole décrit ici est pour le BCG mais peut être appliqué à n’importe quelle mycobactérie. Le BCG peut être utilisé comme bactérie de substitution pour les expériences sur la tuberculose lorsque les installations BSL3 ne sont pas disponibles22. Les procédures suivantes utilisant le BCG doivent être effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) et suivre les directives de biosécurité appropriées et les bonnes pratiques de laboratoire pour la m…

Representative Results

Le test mCFU décrit ici augmente la quantité d’informations pouvant être récupérées à partir d’une seule boîte de Pétri à au moins 96 fois. La figure 5 illustre une comparaison de deux méthodes d’administration de médicaments pour l’utilisation réorientée du saquinavir (SQV)31,32 comme médicament dirigé contre l’hôte pour traiter la tuberculose. Dans ce test, quatre souches différentes de Mycobacterium…

Discussion

La tuberculose est un problème de santé publique important qui prend de plus en plus d’importance, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire. La perturbation des établissements de santé pour diagnostiquer et traiter la tuberculose pendant la pandémie de COVID-19 a eu un impact négatif sur l’incidence des nouveaux cas1. De plus, il est urgent de s’attaquer aux souches multirésistantes et très résistantes de M.tb, ainsi qu’à la co-infection de M.t…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés par des fonds internes de la Faculté de médecine de l’Universidade Católica Portuguesa et des financements externes de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), dans le cadre des subventions UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 et EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Materials

96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 – 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051
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References

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Citer Cet Article
Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).
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