קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.
שחפת, סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי, הרגה 1.6 מיליון בני אדם בשנת 2022, רק עקף על ידי COVID-19 במהלך המגיפה 2019-2021. המחלה נגרמת על ידי החיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb). זן Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), החיסון היחיד לשחפת, הוא החיסון המורשה העתיק ביותר בעולם, שעדיין נמצא בשימוש. נכון לעכשיו, ישנם 12 חיסונים בניסויים קליניים ועשרות חיסונים בפיתוח פרה-קליני. שיטת הבחירה המשמשת להערכת היעילות של חיסוני שחפת במחקרים פרה-קליניים היא ספירת מושבות חיידקים על ידי בדיקת יחידות יוצרות מושבה (CFU). בדיקה זו גוזלת זמן רב ואורכת 4 עד 6 שבועות, דורשת שטח מעבדה ואינקובטור משמעותי, יש לה עלויות ריאגנטים גבוהות והיא מועדת לזיהום. כאן אנו מתארים שיטה אופטימלית לספירת מושבות, מיקרו-CFU (mCFU), המציעה פתרון פשוט ומהיר לניתוח תוצאות יעילות החיסון M.tb . בדיקת mCFU דורשת פי עשרה פחות ריאגנטים, מפחיתה את תקופת הדגירה פי שלושה, לוקח שבוע עד שבועיים לסיים, מפחיתה את שטח המעבדה ואת עלות המגיב, וממזערת את סיכוני הבריאות והבטיחות הקשורים לעבודה עם מספר גדול של M.tb. יתר על כן, כדי להעריך את יעילותו של חיסון נגד שחפת, ניתן לקבל דגימות ממגוון מקורות, כולל רקמות מבעלי חיים מחוסנים הנגועים במיקובקטריה. אנו מתארים גם שיטה אופטימלית לייצור תרבית מיקובקטריאלית חד-תאית, אחידה ואיכותית למחקרי זיהום. לבסוף, אנו מציעים לאמץ שיטות אלה באופן אוניברסלי למחקרים פרה-קליניים של קביעת יעילות החיסון, מה שיוביל בסופו של דבר לקיצור זמן בפיתוח חיסונים נגד שחפת.
שחפת היא סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי יחיד, חיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb), והורגת יותר אנשים מכל פתוגן אחר. בשנת 2021, שחפת הייתה אחראית ל -1.6 מיליון מקרי מוות ועקפה את COVID-19 במהלך המגיפה 2019-20211. יתר על כן, על פי דו”ח השחפת העולמי של ארגון הבריאות העולמי לשנת 2022, מגפת COVID-19 הייתה אחראית לעלייה במקרי שחפת חדשים. ארגון הבריאות העולמי מדווח גם על ירידה גדולה במספר האנשים שאובחנו עם שחפת בתקופה זו, מה שעלול להגדיל עוד יותר את מספר מקרי השחפת1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) הוא זן חי מוחלש של Mycobacterium bovis הפתוגני ששימש לראשונה כחיסון לפני יותר מ-100 שנה. זהו החיסון היחיד נגד שחפת והוא החיסון המורשה העתיק ביותר בעולם שעדיין בשימוש 2,3. נכון לעכשיו, ישנם 12 חיסונים בשלבים שונים של ניסויים קליניים4, ועשרות חיסונים נמצאים בפיתוח פרה-קליני 5,6. הערכה פרה-קלינית של חיסונים נגד שחפת כוללת הערכה של הבטיחות והאימונוגניות7, שניתן להשיג במודלים מגוונים של בעלי חיים כגון דגי זברה, עכברים, שרקנים, ארנבות, בקר ופרימטים לא אנושיים 8,9,10. בנוסף, הערכת יכולתו של חיסון לגרום להגנה מפני זיהום ו/או העברה של M.tb, כלומר יעילות החיסון, דורשת אתגר M.tb in vivo 5,11. באופן מעניין, חיסון BCG גורם להשפעות לא ספציפיות המשפיעות על הישרדותם של פתוגנים חיידקיים ונגיפיים אחרים12,13 באמצעות מנגנון של חסינות מאומנת14. כדי לכמת את הנטל החיידקי הקיים בחיה נגועה, שיטת הבחירה היא ספירת מושבות חיידקים באמצעות בדיקת יחידות יוצרות מושבה (CFU) 5,15. CFU היא יחידה המעריכה את מספר המיקרואורגניזמים (חיידקים או פטריות) היוצרים מושבות בתנאי גידול ספציפיים. CFUs מקורם במיקרואורגניזמים בני קיימא ומשכפלים, וקשה להעריך את המספר המוחלט של מיקרואורגניזמים חיים בתוך כל מושבה. לא בטוח אם המושבה נוצרה ממיקרואורגניזם אחד או יותר. יחידת CFU משקפת אי ודאות זו, ולכן ניתן לראות שונות גדולה בהעתקים של אותו מדגם. בדיקה גוזלת זמן זו דורשת טכנאים מיוחדים שהוכשרו לעבוד במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL3), שטח מעבדה ואינקובטור משמעותי, לוקח בין 4 ל -6 שבועות להסיק, והוא נוטה לזיהום.
במחקר זה, אנו מתארים שיטה אופטימלית לספירת מושבות, מיקרו-CFU (mCFU), ומציעים פתרון פשוט ומהיר לניתוח התוצאות 15,16,17,18,19,20. בדיקת mCFU דורשת פי עשרה פחות ריאגנטים, מפחיתה את תקופת הדגירה פי שלושה, לוקח שבוע עד שבועיים לסיים, מפחיתה את שטח המעבדה ואת עלות המגיב, וממזערת את סיכוני הבריאות והבטיחות הקשורים לעבודה עם מספר גדול של M.tb. אנו מציעים לאמץ שיטה זו באופן אוניברסלי למחקרים פרה-קליניים של קביעת יעילות החיסון, מה שיוביל בסופו של דבר לקיצור זמן בפיתוח חיסונים נגד שחפת. לבסוף, שיטה אופטימלית זו של ספירת CFU שימשה לכימות לא רק מיקובקטריה אלא גם חיידקים אחרים, כגון Escherichia coli ו– Ralstonia solanacearum21.
שחפת היא בעיה חשובה בבריאות הציבור עם חשיבות גוברת, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. השיבוש במסגרות הבריאות לאבחון וטיפול בשחפת במהלך מגפת COVID-19 גרם להשפעה שלילית על שכיחות המקרים החדשים1. בנוסף, יש לטפל בדחיפות בזני M.tb הרב-תרופתיים והעמידים לתרופות, ובהדבקה המ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון פנימי מהפקולטה לרפואה, Universidade Católica Portuguesa, ומימון חיצוני מ- Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), במסגרת המענקים UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 ו- EXPL/SAU-INF/0742/2021.
96-well plates | VWR | 734-2781 | |
DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
DSLR camera | Nikon | D3400 | |
DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
OADC enrichment | BD | 211886 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |