A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.
A tuberculose (TB), principal causa de morte no mundo por um agente infeccioso, matou 1,6 milhão de pessoas em 2022, só sendo superada pela Covid-19 durante a pandemia de 2019-2021. A doença é causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis (M.tb). A cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), única vacina contra a tuberculose, é a mais antiga vacina licenciada no mundo, ainda em uso. Atualmente, há 12 vacinas em testes clínicos e dezenas de vacinas em desenvolvimento pré-clínico. O método de escolha para avaliar a eficácia das vacinas contra TB em estudos pré-clínicos é a enumeração de colônias bacterianas pelo ensaio de unidades formadoras de colônias (UFC). Este ensaio demorado leva de 4 a 6 semanas para ser concluído, requer espaço substancial no laboratório e na incubadora, tem altos custos de reagentes e é propenso a contaminação. Aqui descrevemos um método otimizado para enumeração de colônias, a micro-UFC (mCFU), que oferece uma solução simples e rápida para analisar os resultados de eficácia da vacina M.tb . O ensaio de mCFU requer dez vezes menos reagentes, reduz o período de incubação três vezes, levando de 1 a 2 semanas para ser concluído, reduz o espaço do laboratório e o custo do reagente e minimiza os riscos de saúde e segurança associados ao trabalho com um grande número de M.tb. Além disso, para avaliar a eficácia de uma vacina contra a TB, amostras podem ser obtidas de uma variedade de fontes, incluindo tecidos de animais vacinados infectados com micobactérias. Também descrevemos um método otimizado para produzir uma cultura de micobactérias unicelular, uniforme e de alta qualidade para estudos de infecção. Finalmente, propomos que esses métodos sejam universalmente adotados para estudos pré-clínicos de determinação da eficácia vacinal, levando à redução do tempo no desenvolvimento de vacinas contra TB.
A tuberculose (TB) é a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso, a bactéria Mycobacterium tuberculosis (M.tb), matando mais pessoas do que qualquer outro patógeno. Em 2021, a tuberculose foi responsável por 1,6 milhão de mortes e foi superada pela Covid-19 durante a pandemia1 de 2019-2021. Além disso, de acordo com o relatório global de TB da Organização Mundial da Saúde de 2022, a pandemia de COVID-19 foi responsável por um aumento de novos casos de TB. A OMS também relata grandes quedas no número de pessoas diagnosticadas com TB nesse período, o que poderia aumentar ainda mais o número de casos de TB1.
O Bacillus Calmette-Guérin (BCG) é uma cepa viva atenuada do patogênico Mycobacterium bovis, utilizada pela primeira vez como vacina há mais de 100 anos. Esta é a única vacina contra a TB e é a mais antiga vacina licenciada no mundo ainda em uso 2,3. Atualmente, existem 12 vacinas em diferentes fases de ensaios clínicos4, e dezenas de vacinas estão em desenvolvimento pré-clínico 5,6. A avaliação pré-clínica das vacinas contra TB inclui a avaliação da segurança e imunogenicidade7, que podem ser obtidas em diversos modelos animais, como peixes-zebra, camundongos, cobaias, coelhos, bovinos e primatas não humanos8,9,10. Além disso, avaliar a capacidade de uma vacina em induzir proteção contra a infecção e/ou transmissão da M.tb, ou seja, a eficácia da vacina, requer um desafio M.tb in vivo 5,11. Curiosamente, a vacinação BCG induz efeitos inespecíficos que afetam a sobrevivência de outros patógenos bacterianos e virais12,13 através do mecanismo de imunidade treinada14. Para quantificar a carga bacteriana viável em um animal infectado, o método de escolha é a enumeração de colônias bacterianas através do ensaio de unidades formadoras de colônias (UFC)5,15. A UFC é uma unidade que estima o número de microrganismos (bactérias ou fungos) que formam colônias sob condições específicas de crescimento. As UFCs originam-se de microrganismos viáveis e replicativos, e o número absoluto de microrganismos vivos dentro de cada colônia é difícil de estimar. É incerto se uma colônia se originou de um ou mais microrganismos. A unidade UFC reflete essa incerteza, portanto, uma grande variabilidade pode ser observada em réplicas de uma mesma amostra. Este ensaio demorado requer técnicos especializados treinados para trabalhar em uma instalação de nível de biossegurança 3 (BSL3), espaço substancial de laboratório e incubadora, leva de 4 a 6 semanas para ser concluído e é propenso a contaminação.
Neste estudo, descrevemos um método otimizado para enumeração de colônias, a micro-UFC (mUFC), e oferecemos uma solução simples e rápida para analisar os resultados 15,16,17,18,19,20. O ensaio de mCFU requer dez vezes menos reagentes, reduz o período de incubação três vezes, levando de 1 a 2 semanas para ser concluído, reduz o espaço do laboratório e o custo do reagente e minimiza os riscos de saúde e segurança associados ao trabalho com um grande número de M.tb. Propomos que esse método seja universalmente adotado para estudos pré-clínicos de determinação da eficácia vacinal, levando à redução do tempo no desenvolvimento de vacinas contra TB. Finalmente, este método otimizado de enumeração de UFC tem sido utilizado para quantificar não só micobactérias, mas também outras bactérias, como Escherichia coli e Ralstonia solanacearum21.
A TB é um importante problema de saúde pública com importância crescente, particularmente em países de baixa e média renda. A interrupção dos serviços de saúde para diagnosticar e tratar a TB durante a pandemia COVID-19 causou um impacto negativo na incidência de novos casos1. Além disso, as cepas M.tb multidrogas e extensivamente resistentes e a co-infecção de M.tb e HIV devem ser urgentemente abordadas para o controle dessa epidemia 1,…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por financiamento interno da Faculdade de Medicina da Universidade Católica Portuguesa e financiamento externo da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), no âmbito das bolsas UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 e EXPL/SAU-INF/0742/2021.
96-well plates | VWR | 734-2781 | |
DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
DSLR camera | Nikon | D3400 | |
DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
OADC enrichment | BD | 211886 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |