Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تطبيق الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وتحييد الأجسام المضادة

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65793
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Infectious Disease Research, School of Systems Biology, George Mason University

Summary

يصف هذا البروتوكول تطبيق فيروس كاذب هجين جديد من فيروس ألفا-سارس-كوف-2 (Ha-CoV-2) كمنصة للقياس الكمي السريع لعدوى متغيرات SARS-CoV-2 وحساسيتها لتحييد الأجسام المضادة.

Abstract

سلطت جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) الضوء على الحاجة إلى فحوصات سريعة لقياس عدوى متغيرات SARS-CoV-2 الناشئة بدقة وفعالية الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح ضد المتغيرات الفيروسية. هذه المقايسات ضرورية لترصد الجائحة والتحقق من صحة اللقاحات والمعززات الخاصة بالمتغيرات. توضح هذه المخطوطة تطبيق فيروس كاذب هجين جديد لفيروس ألفا-سارس-كوف-2 (Ha-CoV-2) من أجل القياس الكمي السريع للعدوى المتغيرة ل SARS-CoV-2 والأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح للمتغيرات الفيروسية. Ha-CoV-2 هو جسيم يشبه فيروس SARS-CoV-2 يتكون من بروتينات هيكلية فيروسية (S و M و N و E) وجينوم RNA سريع التعبير مشتق من فيروس ألفا ، فيروس غابة Semliki (SFV). يحتوي Ha-CoV-2 أيضا على كل من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وجينات مراسل luciferase التي تسمح بالقياس الكمي السريع للعدوى الفيروسية. على سبيل المثال ، يتم تحديد عدوى متغيرات SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) ، كما يتم قياس حساسياتها تجاه الجسم المضاد المعادل (27VB). توضح هذه الأمثلة الإمكانات الكبيرة ل Ha-CoV-2 كمنصة قوية للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وقابليتها لتحييد الأجسام المضادة.

Introduction

اعتبارا من مايو 2023 ، كان هناك الآن أكثر من 766 مليون حالة COVID-191. على الرغم من حملات التطعيم في جميع أنحاء العالم ، فإن SARS-CoV-2 يدور باستمرار ويصيب الناس ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى ظهور متغيرات جديدة مثل Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) التي تدفع موجات جديدة من العدوى 2,3,4. بالنظر إلى أن SARS-CoV-2 يتطور باستمرار ، فمن المهم تطوير فحوصات سريعة يمكنها قياس عدوى المتغيرات الناشئة بدقة وفعالية الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح ضد هذه المتغيرات. هذه المقايسات ضرورية لترصد الجائحة ولتحديد فعالية اللقاحات ومعززاتها الخاصة بالمتغيرات.

نظرا للطبيعة شديدة العدوى ل SARS-CoV-2 ، يتطلب مركز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) إجراء دراسة SARS-CoV-2 ومتغيراته في مرافق مستوى السلامة البيولوجية (BSL)3 5,6. يحد متطلب BSL-3 هذا من استخدام الفيروسات الحية لتحديد عدوى المتغيرات الفيروسية وأجسامها المضادة المعادلة في الأبحاث الشائعة والمختبرات السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقايسات تحييد SARS-CoV-2 التقليدية ، مثل المقايسات القائمة على تأثير البلاك أو الاعتلال الخلوي باستخدام الفيروسات الحية ذات الكفاءة المتماثلة ، تستغرق وقتا طويلا وتتطلب فترات حضانة طويلة7. تم تطوير العديد من الفيروسات الكاذبة من النوع الكاذب لبروتين SARS-CoV-2 لتحديد فعالية تحييد الأجسام المضادة8،9،10،11،12. في SARS-CoV-2 ، بروتين S هو البروتين الرئيسي الذي يتوسط دخول الفيروس13 ، وهو المستضد الرئيسي المستخدم في لقاحات SARS-CoV-29،10،14،15،16. تم استخدام الفيروسات ذات النمط الكاذب للبروتين S ، مثل فيروسات التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) أو lentivirus ، لتحديد كمية الأجسام المضادة المعادلة17،18،19. ومع ذلك ، فإن الفيروس الكاذب القائم على lentivirus يتطلب عادة 2 إلى 3 أيام من العدوى من أجل تحديد إشارات المراسل. غالبا ما تحتوي أنظمة الفيروسات الكاذبة القائمة على VSV على فيروسات VSV المتبقية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى معدلات عالية من النتائج الإيجابية الكاذبة وتتطلب عادة 24 ساعة من العدوى20.

تم مؤخرا تطوير نظام فيروس كاذب جديد ل SARS-CoV-2 ، وهو الفيروس الكاذب الهجين alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) ، بواسطة Hetrick etal 12. يوفر Ha-CoV-2 أداة جديدة للقياس الكمي السريع لعدوى الفيروس وحساسية الفيروس لتحييد الأجسام المضادة في مختبرات BSL-2 الشائعة. من الناحية الهيكلية ، يشبه Ha-CoV-2 جسيم virion SARS-CoV-2 ، الذي يتكون من بروتينات هيكلية ل SARS-CoV-2 بما في ذلك بروتين S (S) ، والغشاء (M) ، و nucleocapsid (N) ، والغلاف (E) ، ولا يوجد بروتين هيكلي من فيروسات أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي جسيم Ha-CoV-2 على جينوم RNA سريع التعبير من فيروس ألفا للتعبير السريع في الخلايا. ثبت أن Ha- CoV-2 يقيس بسرعة النشاط المعادل للأجسام المضادة في أمصال الأفراد الذين تم تطعيمهم والنقاهة12. كما أوضح Hetrick et al. ، عند مقارنته بالفيروس الكاذب SARS-CoV-2 القائم على فيروس lentivirus في فحص الدورة الزمنية ، أعرب Ha-CoV-2 عن مراسل Luc في وقت مبكر من 2-4 ساعات بعد الإصابة بينما عبر الفيروس الكاذب lentivirus عن Luc بعد 24 ساعة12. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح التطبيق المحتمل لمتغيرات Ha-CoV-2 لقياس الأجسام المضادة المعادلة بشكل أكبر باستخدام جسم مضاد معادل وحيد النسيلة قياسي ، 27BV (انظر الشكل التكميلي 1)12. يفصل هذا العمل استخدام منصة Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لعدوى متغيرات SARS-CoV-2 ، باستخدام متغيرات Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) كأمثلة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح التطبيق المحتمل لمتغيرات Ha-CoV-2 لتحديد الأجسام المضادة المعادلة باستخدام جسم مضاد قياسي وحيد النسيلة ، 27BV12.

Protocol

1. تجميع الفيروسات والجسيمات الفيروسية

  1. المتجهات: شراء متجهات التعبير ل SARS-CoV-2 M أو E أو N بالإضافة إلى SARS-CoV-2 S (النوع البري ، بالوزن) ، دلتا (B.1.617.2) ، وأوميكرون (B.1.1.529) تجاريا.
    ملاحظة: يتم توفير تسلسلات البروتين لمتجهات التعبير في الملف التكميلي 1. يمكن أيضا العثور على بائع متجهات التعبير هذه ضمن جدول المواد.
  2. الخلايا وزراعة الخلايا: الحفاظ على الخلايا HEK293T في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) ، و 50 وحدة / مل من البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
    ملاحظة: يجب أن تتم جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية لتدفق الهواء الرقائقي. يتطلب نقل البولي إيثيلين (PEI) عادة حضانة لمدة 5-6 ساعات. يجب النظر في أوقات البدء بعناية مسبقا.
  3. تجميع الفيروسات والنقل المشترك القائم على جزيرة الأمير إدوارد: تجميع جزيئات Ha-CoV-2 عن طريق النقل المشترك للخلايا HEK293T. خلايا البذور في طبق بتري لزراعة الخلايا 10 سم (4-5 × 106 خلايا لكل طبق) في 10 مل من وسط DMEM الكامل في اليوم السابق للنقل المشترك. في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاثة أطباق بتري لزرع الخلايا لتجميع النوع البري Ha-CoV-2 ودلتا وأوميكرون ، على التوالي.
  4. احتضان أطباق بتري طوال الليل في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية. تحقق من الأطباق في صباح اليوم التالي للتأكد من أن الخلايا متقاربة بنسبة 80٪. أزيلي الوسط الكامل واستبدليه ب 9 مل من الوسائط الخالية من مصل DMEM.
  5. لكل طبق ، قم بإعداد خليط cotransfection مع 2.5 ميكروغرام من كل من ناقلات التعبير البروتيني الهيكلي SARS-CoV-2 (N ، E ، M) ، و 10 ميكروغرام pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (جينوم HaCoV2) ، و 2.5 ميكروغرام من ناقل تعبير البروتين S ، إما متغيرات Delta أو Omicron S و 45 ميكرولتر من كاشف النقل القائم على PEI. اسمح لخليط النقل المشترك بتكوين مجمعات عن طريق الحضانة لمدة 13 دقيقة (لا تحتضن لمدة تزيد عن 30 دقيقة).
  6. بعد الحضانة ، أضف خليط النقل إلى كل طبق بتري ببطء ، قطرة قطرة. ضع الأطباق داخل حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. بعد 6 ساعات ، قم بإزالة DMEM الخالي من المصل واستبدله بوسط DMEM كامل. فيروس الحصاد في 48-60 ساعة بعد النقل.
  7. حصاد الفيروسات وتخزينها: حصاد الجسيمات في 48 ساعة بعد النقل. افصل الخلايا عن طريق السحب بشكل متكرر على سطح الطبقة الأحادية وجمع الخلايا من كل طبق ، ووضعها في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. جمع طاف وتمريره من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 في -80 درجة مئوية.

2. مقايسة العدوى الفيروسية

  1. الخلايا وزراعة الخلايا: الحفاظ على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ FBS معطل حراريا و 50 وحدة / مل من البنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
  2. خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): في اليوم السابق لفحص العدوى الفيروسية ، HEK293T الخلايا (ACE2 / TMPRSS2) في صفيحة 96 بئرا في 50 ميكرولتر من وسائط DMEM الكاملة. لكل صفيحة 96 بئرا ، بذرة 2.5 × 104 خلايا في كل بئر ، وما مجموعه 2.5 × 106 خلايا مطلوبة للوحة واحدة. ضع صفيحة البئر 96 في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. إصابة HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): استخدم جزيئات متغيرات Ha-CoV-2 لإصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). في صباح يوم الإصابة ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من DMEM من لوحة البئر 96 المصنفة مسبقا. استبدل الوسائط ب 50 ميكرولتر من النوع البري Ha-CoV-2 أو Delta أو Omicron لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا حتى تصل العدوى إلى 18 ساعة من الحضانة وتكون اللوحة جاهزة للتحليل عبر فحص Luciferase Assay. يتم تحديد نجاح العدوى من خلال مقايسة Luciferase الناتجة عن جين مراسل Luciferase المعبر عنه في الخلايا المصابة ، وبالتالي كلما تم إنتاج المزيد من الإشارات ، زادت نجاح عدوى متغير Ha-CoV-2.
  4. مقايسة لوسيفيراز: بعد 18 ساعة من الحضانة ، أضف 7.5 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية مباشرة إلى كل بئر واخلطه عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 2 دقيقة. خلايا التحلل في المخزن المؤقت للتحلل لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإعداد محلول فحص Firefly luciferase عن طريق خلط محلول D-luciferin مع محلول فحص Firefly luciferase بنسبة 1:50. للحصول على صفيحة كاملة من 96 بئرا ، ادمج 3 مل من محلول ركيزة لوسيفيراز مع 60 ميكرولتر من محلول D-luciferin مع 2940 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت Firefly luciferase .
  6. أضف 25 ميكرولتر من محلول فحص Firefly luciferase إلى تحلل الخلية واخلط اللوحة عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 1 دقيقة. تحليل نشاط لوسيفيراز باستخدام قارئ لوحة لوسيفيراز الميكروية التجارية.

3. استخراج الحمض النووي الريبي ل Ha-CoV-2 والنسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR)

  1. استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي: استخرج الحمض النووي الريبي الفيروسي من نوع Ha-CoV-2 Wild وجزيئات Ha-CoV-2 Delta و Omicron المتغيرة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي التجارية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتخزين الحمض النووي الريبي الفيروسي المستخرج عند -80 درجة مئوية أو استخدمه على الفور ل RT-qPCR.
  2. RT-qPCR: قم بإجراء RT-qPCR على الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام مزيج رئيسي من خطوة واحدة. قم بإجراء التفاعل في جهاز PCR تجاري. يرجى ملاحظة أن هدف التضخيم هو الحمض النووي الريبي الجينومي ل Ha-CoV-2. استخدم الحمض النووي المتجه Ha-CoV-2 كمعيار لإنشاء منحنى قياسي وحساب رقم نسخة الحمض النووي الريبي لكل متغير.

4. تحييد مقايسة الأجسام المضادة

  1. خلايا HEK293T البذر (ACE2 / TMPRSS2): في اليوم السابق للفحص ، HEK293T الخلايا الأولية (ACE2 / TMPRSS2) في صفيحة بئر 96 في 50 ميكرولتر من وسائط DMEM الكاملة. يتم شراء خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) تجاريا.
  2. لعد الخلايا ، احصل على 20 خلية ميكرولتر من قارورة T75 تحتوي على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) ، واخلطها مع 20 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق. أضف 20 ميكرولتر من هذا الخليط إلى غرفة عد الخلايا واحسب عدد الخلايا لكل مل. لزرع صفيحة بئر 96 للعدوى ، استخدم 2.5 × 104 خلايا لكل بئر ، وستكون هناك حاجة إلى 2.5 × 106 خلايا في المجموع. ضع 96 صفيحة بئر في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. مقايسة تحييد الأجسام المضادة: في صفيحة معقمة من مادة البولي بروبيلين 96 بئرا ، قم بإعداد الجسم المضاد المعادل القياسي 27BV وخليط Ha-CoV-2. أضف 8 ميكرولتر من 27BV (45 مجم / مل) إلى اللوحة وقم بإجراء التخفيفات التسلسلية للجسم المضاد باستخدام 6 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل.
    ملاحظة: تأكد من تبادل أطراف الماصة بين عمليات نقل البئر وتأكد من خلط الجسم المضاد والوسط الخالي من المصل جيدا للحصول على نتائج دقيقة.
  4. إلى الجسم المضاد المخفف بشكل متسلسل ، أضف 54 ميكرولتر من جسيم Ha-CoV-2 وامزج الفيروس والجسم المضاد. احتضان جسيمات Ha-CoV-2 مسبقا باستخدام 27BV المخفف بشكل متسلسل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، ضع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد وخليط Ha-CoV-2 على لوحة 96 بئرا تحتوي على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) (2.5 × 104 خلايا لكل بئر) المصنفة في اليوم السابق.
  5. بالنسبة للضوابط ، اترك ثلاثة آبار على الأقل تحتوي فقط على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). أضف 50 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى هذه الآبار لتكون بمثابة آبار غير مصابة لإشارة الخلفية لقراءات فحص لوسيفيراز.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا حتى تصل العدوى إلى 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، ومن ثم تكون اللوحة جاهزة للتحليل عن طريق مقايسة لوسيفيراز.
  6. مقايسة لوسيفيراز: بعد 18 ساعة من الحضانة ، أضف 7.5 ميكرولتر من محلول التحلل مباشرة إلى كل بئر واخلطها عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 2 دقيقة. خلايا التحلل في المخزن المؤقت للتحلل لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
  7. قم بإعداد محلول فحص Firefly luciferase عن طريق خلط محلول D-luciferin مع محلول فحص Firefly luciferase بنسبة 1:50. للحصول على صفيحة كاملة من 96 بئرا ، ادمج 3 مل من محلول ركيزة لوسيفيراز مع 60 ميكرولتر من محلول D-luciferin مع 2940 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت لوسيفيراز اليراع.
  8. أضف 25 ميكرولتر من محلول فحص Firefly luciferase إلى تحلل الخلية واخلط اللوحة عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 1 دقيقة. تحليل نشاط لوسيفيراز باستخدام قارئ لوحة لوسيفيراز الميكروية التجارية.

5. القياس الكمي والتحليل الإحصائي

  1. جمع البيانات: إجراء مقايسات العدوى واللوسيفيراز في ثلاث نسخ كما هو موضح (الشكل 1). تحديد تعبير لوسيفيراز مع قراءات مقايسة لوسيفيراز. المتوسط هو متوسط قيمة قراءات مقايسة لوسيفيراز الثلاث. يتم طرح قراءات إشارة الخلفية من الآبار غير المصابة من هذه القيمة المتوسطة. يتم تحديد الانحراف المعياري (SD) من متوسط قيمة قراءات مقايسة لوسيفيراز.
  2. تحليل البيانات: رسم نشاط تحييد الأجسام المضادة وحساب قيم ID50 (جرعة تثبيط 50٪) باستخدام برنامج الرسوم البيانية التجارية. يتم تعريف قيمة ID50 على أنها التخفيفات المثبطة للأجسام المضادة التي يتم فيها تحقيق انخفاض بنسبة 50٪ في إصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) (بناء على قراءات فحص لوسيفيراز).

Representative Results

تم تجميع جسيمات Ha-CoV-2 باستخدام خمسة ناقلات مختلفة للحمض النووي تعبر عن جينوم Ha-CoV-2 RNA والبروتينات الهيكلية (M و N و E و S) ل SARS-CoV-2 في خلايا HEK293T. يختلف ناقل البروتين S اعتمادا على متغير S. تم استخدام بروتين S من سلالة Ha-CoV-2 Wuhan الأصلية (النوع البري ، Wt) كعنصر تحكم إيجابي ، وتم تجميعه مع بروتين S من كل من المتغيرين الآخرين: دلتا (B.1.617.2) أو Omicron (B.1.1.529). تم استخدام نفس M و N و E في جميع المتغيرات. تم جمع Ha-CoV-2 (Wt) والجسيمات المتغيرة بعد 48 ساعة من النقل المشترك ثم استخدمت لإصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). تم قياس العدوى عن طريق التعبير عن لوسيفيراز في 18 ساعة بعد الإصابة. في هذا النظام ، تعكس مستويات التعبير الأعلى لإشارة لوسيفيراز عدوى أعلى للخلايا بواسطة Ha-CoV-2. تم تطبيع إشارة لوسيفيراز بنسخ الحمض النووي الريبي الجينومي بواسطة RT-qPCR لكل متغير. كما هو موضح في الشكل 1 ، ولد متغير Ha-CoV-2 Omicron إشارة أعلى من 4 إلى 10 أضعاف من Ha-CoV-2 (Wt) الأصلي ، مما يشير إلى ارتفاع العدوى.

علاوة على ذلك ، تم تحديد قدرة 27BV على تحييد متغيرات HaCoV-2 (Wt) و Delta و Omicron. 27BV هو جسم مضاد أحادي النسيلة للأرانب تم تطويره ضد مجال RBD لبروتين SARS-COV-2 S1. بالنسبة لمقايسات التحييد ، تم إجراء التخفيفات التسلسلية ل 27BV في صفيحة 96 بئرا ، تم تحضينها مسبقا باستخدام Ha-CoV-2 ، ثم إضافتها إلى الخلايا المستهدفة HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). أظهرت النتائج أن 27BV كان له نشاط تحييد ضد جميع المتغيرات التي تم اختبارها (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام أن المعرف50 ل 27VB ل Omicron كان أقل قوة بحوالي 10 مرات من المعرف50 ل Ha-CoV-2 (WT) و Ha-CoV-2 (Delta; الشكل 2). توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام منصة Ha-COV-2 كطريقة سريعة لقياس الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح في المتغيرات الناشئة.

Figure 1
الشكل 1. تجميع وقياس متغيرات Ha-CoV-2. (أ) رسم توضيحي لتجميع Ha-CoV-2 والجسيمات المتغيرة. يتم نقل النواقل التي تعبر عن جينوم مراسل Ha-CoV-2 والبروتينات الهيكلية (M و S و N و E) في خلايا HEK293T. تم حصاد الجسيمات بعد 48 ساعة من النقل المشترك (تم إنشاء تصوير جسيمات virion والخلايا HEK293T باستخدام Biorender.com). (ب) التحديد الكمي لعدوى متغيرات Ha-CoV-2. يتم تحديد العدوى النسبية للمتغيرين (دلتا وأوميكرون) وتسطيعها باستخدام نسخ الحمض النووي الريبي الجينومي لمتغيرات Ha-CoV-2 (Luc) الفردية. النوع البري هو Ha-COV-2 (Wt) ، والذي يستخدم كعنصر تحكم للمقارنة. تم إجراء فحوصات العدوى و luciferase 3x. RU ، الوحدة النسبية. يتم عرض المتوسط والانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. القياس الكمي لنشاط تحييد 27BV ضد متغيرات Ha-CoV-2 (Luc) تم تحليل نشاط التحييد ل 27BV بعد 18 ساعة من إصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). تم حساب معرف50 باستخدام معدل الإصابة النسبي (نشاط لوسيفيراز) مقابل تركيز 27BV. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. إصابة HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) ب Ha-CoV-2 (GFP). تم تجميع جزيئات Ha-CoV-2 (GFP) ثم استخدامها لإصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). لوحظ تعبير GFP في 48 ساعة بعد الإصابة باستخدام المجهر الفلوري. يظهر الحقل الأبيض للخلايا المصابة على اليسار ، ويظهر تصوير GFP على اليمين. يمثل الشريط الأبيض 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1. ملخص رسومي. بنية الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 وتطبيقه. تم إنشاء الصورة باستخدام Biorender.com. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1. تسلسل البروتين. قائمة تسلسل بروتينات SARS-CoV-2 S و M و N و E. تتضمن تسلسلات البروتين S أيضا متغيرات SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) و Delta (B.1.617.2). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

توفر منصة Ha-CoV-2 سير عمل سريع وقوي وبسيط لتحديد المتغيرات الفيروسية وتحييد الأجسام المضادة. ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام. يجب إجراء إنتاج الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 باستخدام خلايا HEK293T ذات قابلية عالية للحياة. يمكن مراقبة كفاءة النقل المشترك بعد 24 ساعة من النقل باستخدام جين مراسل GFP من جينوم Ha-CoV-2. يمكن أن يحتوي جينوم Ha-CoV-2 على مراسلين (GFP و Luc) ، ويمكن التعبير عن GFP أثناء النقل المشترك وبعد عدوى Ha-CoV-2 للخلايا المستهدفة12. عادة ما تكون خلايا GFP + من العدوى بنسبة منخفضة (1٪ إلى 5٪) ، لكن كل خلية مصابة تعبر عن إشارات GFP قوية (الشكل 3). قد تحد هذه النسبة المئوية المنخفضة من GFP من استخدام GFP كقراءة قوية لقياس تحييد الأجسام المضادة ، مقارنة بمراسل Luc ، الذي يحدد عدد الخلايا المصابة بالكامل.

عند إجراء مقايسة التحييد ، من الضروري تغيير أطراف الماصة بين عمليات نقل البئر ولضمان خلط الجسم المضاد والوسط الخالي من المصل جيدا للحصول على نتائج دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، عند إجراء بروتوكول فحص لوسيفيراز ، يجب تحليل الخلايا بالكامل لمدة 3 دقائق على الأقل لضمان التحلل الكامل للخلايا وإطلاق إنزيم لوسيفيراز. هذا سيضمن دقة الفحص. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد إضافة محلول فحص Firefly luciferase إلى لوحات الآبار البصرية ذات الجدران البيضاء 96 ، يجب تحليل اللوحة في غضون 10 دقائق لأن انبعاث الضوء الأولي مرتفع ولكنه ينخفض بمرور الوقت مع استنفاد ATP21.

مع استمرار تطور المزيد من متغيرات SARS-CoV-2 ، هناك حاجة متزايدة لمنصات مثل Ha-CoV-2 للكشف بسرعة عن العدوى المتغيرة والحساسية المتغيرة للأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح. توفر منصة Ha-CoV-2 سرعة أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى وبروتوكولا بسيطا مقارنة بفحوصات التحييد الحالية القائمة على الفيروسات الكاذبة8،9،10،11. توفر منصة Ha-CoV-2 أيضا ميزة أنه يمكن استخدامها في مختبرات BSL-2 ولا تتطلب استخدام مرافق BSL-3. وهذا يسمح ل SARS-CoV-2 بمتابعة الأبحاث في الأبحاث المشتركة والمختبرات السريرية. علاوة على ذلك ، تنتج منصة Ha-CoV-2 نتائج سريعة مقارنة بالأنظمة الأخرى. على سبيل المثال ، غالبا ما تستخدم دراسة تحييد الأجسام المضادة ضد فيروس SARS-CoV-2 المعدي اختبار تحييد تقليل البلاك (PRINT)22. على الرغم من أن PRINT ينتج نتائج موثوقة ، إلا أن العد اليدوي لوحدات تشكيل البلاك (PFUs) بطيء ويتطلب 3-5 أيام للحصول على النتائج23,24. تحتاج أنظمة النمط الكاذب الأخرى ، مثل الفيروس الكاذب lentivirus إلى 24-72 ساعة لإنتاج إشارة مراسل يمكن اكتشافها12. بالمقارنة ، يمكن أن يؤدي اختبار تحييد Ha-CoV-2 إلى نتائج في غضون 18 ساعة. يوفر Ha-CoV-2 أداة ملائمة للفحص السريع والقياس الكمي للمتغيرات الفيروسية وتحييد الأجسام المضادة لرصد الجائحة.

تعد مراقبة عدوى SARS-CoV-2 أمرا ضروريا مع استمرار ظهور المزيد من المتغيرات المثيرة للقلق (VOCs). يوفر Ha-CoV-2 ميزة تحديد عدوى المركبات العضوية المتطايرة بسرعة. استخدمت الدراسات السابقة النمذجة القائمة على الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) لتحليل عدوى المتغير الفرعي Omicron ومتغيرات SARS-CoV-2 الأخرى ، مثل متغير دلتا25. أظهرت هذه الدراسات أن متغير Omicron أكثر عدوى من الفيروس الأصلي ، وأكثر عرضة للهروب من الأجسام المضادة المعادلة25. في هذه الدراسات ، باستخدام Ha-CoV-2 ، لوحظت أنماط ظاهرية مماثلة. بالإضافة إلى ذلك ، في مقايسات تحييد الأجسام المضادة ، تقل احتمالية تحييد متغير Omicron بعشر مرات بواسطة 27BV عن سلالات ووهان ودلتا. تتوافق هذه النتائج أيضا مع قابلية الانتقال العالية المبلغ عنها لمتغير Omicron ، والذي يحتوي على 15 طفرة على الأقل في مجال ربط المستقبلات (RBD) ، مما يعزز على الأرجح تقارب الارتباط الفيروسي بمستقبل ACE2 لزيادة قابلية الانتقال وزيادة الهروب المناعي26.

Disclosures

تم تقديم براءة اختراع من قبل جامعة جورج ميسون ومرخصة لشركة Virongy Biosciences Inc. لتطوير المنتجات. YW هو مؤسس وعضو في المجلس الاستشاري لشركة Virongy Biosciences. يشغل B. H حاليا منصب الرئيس التنفيذي والمدير العلمي لشركة Virongy Biosciences. ليس لدى المؤلفين أي تضارب آخر في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق الأبحاث الداخلية بجامعة جورج ميسون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody Virongy Biosciences 27VBI-01
500 mL - US Origin FBS Neuromics FBS001
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit  Genesee Scientific Cat# 24-300 
Allegra 6R Centrifuge Beckman Coulter 2043-30-1158
DMEM (1x)  ThermoFisher  11995-073
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit Genesee Scientfic 25-209
GlowMax Discover Microplate reader Promega  GM3000 
Ha-CoV-2 E Vector  Virongy Biosciences pCoV2_E
Ha-CoV-2 M Vector  Virongy Biosciences pCoV2_M
Ha-CoV-2 N Vector  Virongy Biosciences pCoV2_N
Ha-CoV-2 WT S Vector Virongy Biosciences pCoV2_WT S
Hek293T cells ATCC CRL-3214
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays Gold Bio  I-930-1000
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney)  VWR  Cat# 82050-758 
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector  In house
PEI-based Transfection Reagent Virongy Biosciences Transfectin
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Invitrogen 10378016
Polyethylenimine, branched Millipore Sigma 408727-100ML
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System ThermoFisher  A43163
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells Virongy Biosciences Ready-To-Use-Cells
SARS-CoV-2 S  Omicron (B.1.1.529) Vector Virongy Biosciences pCoV2-B.1.1.529
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector Virongy Biosciences pCoV2- B.1.617.2
Syringe Filters, PES, 0.22µm Genesee Scientfic 25-244
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix ThermoFisher  4444432
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher  15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
  2. Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
  3. Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
  4. El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
  5. CDC. Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).
  6. Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
  7. Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
  8. Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
  9. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  10. Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
  11. Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
  12. Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
  13. Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  14. Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
  15. Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  16. Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
  17. Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
  18. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
  19. Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
  20. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
  21. Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
  22. Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
  23. Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
  24. Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
  25. Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
  26. Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).

Tags

الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 ، متغيرات SARS-CoV-2 ، الأجسام المضادة المعادلة ، القياس الكمي السريع ، فعالية اللقاح ، مراقبة الوباء ، المعززات الخاصة بالمتغيرات ، الفيروس الكاذب الهجين Alphavirus-SARS-CoV-2 ، قياس العدوى ، المتغيرات الفيروسية ، متغير دلتا SARS-CoV-2 ، متغير SARS-CoV-2 Omicron ، بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، جينات مراسل Luciferase
تطبيق الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وتحييد الأجسام المضادة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chilin, L., Hetrick, B., Wu, Y.… More

Chilin, L., Hetrick, B., Wu, Y. Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies. J. Vis. Exp. (199), e65793, doi:10.3791/65793 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter