Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

יישום של Ha-CoV-2 Pseudovirus לכימות מהיר של גרסאות SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65793
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Infectious Disease Research, School of Systems Biology, George Mason University

Summary

פרוטוקול זה מתאר את היישום של פסאודו-וירוס היברידי חדשני מסוג אלפא-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) כפלטפורמה לכימות מהיר של הדבקה של וריאנטים של SARS-CoV-2 ורגישותם לנוגדנים מנטרלים.

Abstract

מגיפת מחלת הקורונה 2019 (COVID-19) הדגישה את הצורך בבדיקות מהירות כדי למדוד במדויק את ההדבקה של וריאנטים מתפתחים של SARS-CoV-2 ואת היעילות של נוגדנים מנטרלים הנגרמים על ידי חיסון נגד וריאנטים ויראליים. בדיקות אלה חיוניות למעקב אחר מגפות ולאימות חיסונים וחיסוני דחף ספציפיים לווריאנט. כתב יד זה מדגים את היישום של פסאודו-וירוס היברידי חדשני מסוג אלפא-וירוס-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) לכימות מהיר של הדבקה בווריאנט SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים הנגרמים על ידי חיסון לווריאנטים נגיפיים. Ha-CoV-2 הוא חלקיק דמוי נגיף SARS-CoV-2 המורכב מחלבונים מבניים נגיפיים (S, M, N ו-E) וגנום RNA בעל ביטוי מהיר שמקורו באלפא-וירוס, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 מכיל גם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וגנים מדווחים של לוציפראז המאפשרים כימות מהיר של הדבקה ויראלית. לדוגמה, נמדדת ההדבקה של הווריאנטים דלתא של SARS-CoV-2 (B.1.617.2) ואומיקרון (B.1.1.529), ונמדדת גם רגישותם לנוגדן מנטרל (27VB). דוגמאות אלה מדגימות את הפוטנציאל הגדול של Ha-CoV-2 כפלטפורמה חזקה לכימות מהיר של וריאנטים של SARS-CoV-2 ורגישותם לנוגדנים מנטרלים.

Introduction

נכון למאי 2023, היו כעת יותר מ-766 מיליון מקרי COVID-191. למרות מבצעי חיסון ברחבי העולם, SARS-CoV-2 מסתובב ומדביק אנשים ללא הרף, בעיקר בשל הופעתם של וריאנטים חדשים כגון דלתא (B.1.617.2) ואומיקרון (B.1.1.529) המניעים גלים חדשים של זיהום 2,3,4. בהתחשב בכך ש- SARS-CoV-2 מתפתח כל הזמן, חשוב לפתח בדיקות מהירות שיכולות למדוד במדויק את ההדבקה של וריאנטים מתפתחים ואת היעילות של נוגדנים מנטרלים הנגרמים על ידי חיסון נגד וריאנטים אלה. בדיקות אלה חיוניות למעקב אחר מגפות ולקביעת יעילות החיסונים והבוסטרים הספציפיים לווריאנט שלהם.

בשל האופי המדבק מאוד של SARS-CoV-2, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) דורש כי המחקר של SARS-CoV-2 והגרסאות שלו מתבצע ברמת בטיחות ביולוגית (BSL) 3 מתקנים 5,6. דרישת BSL-3 זו מגבילה את השימוש בנגיפים חיים לכימות ההדבקה של וריאנטים נגיפיים והנוגדנים המנטרלים שלהם במעבדות מחקר וקליניות נפוצות. בנוסף, מבחני נטרול מסורתיים של SARS-CoV-2, כגון בדיקות מבוססות פלאק או אפקט ציטופתי באמצעות וירוסים חיים בעלי יכולת שכפול, גוזלות זמן רב ודורשות תקופות דגירה ארוכות7. מספר פסאודו-וירוסים מסוג SARS-CoV-2 של חלבון ספייק (S) פותחו כדי לכמת את היעילות של נוגדנים מנטרלים 8,9,10,11,12. ב- SARS-CoV-2, חלבון S הוא החלבון העיקרי המתווך כניסה נגיפית13, והוא האנטיגן העיקרי המשמש בחיסוני SARS-CoV-2 9,10,14,15,16. נגיפים פסאודוטיפיים של חלבון S, כגון אלה של וירוס סטומטיטיס שלפוחית השתן (VSV-G) או lentivirus, שימשו לכימות נוגדנים מנטרלים 17,18,19. עם זאת, הפסאודו-וירוס מבוסס הלנטיוירוס דורש בדרך כלל 2 עד 3 ימים של הדבקה על מנת לכמת את אותות המדווח. מערכות פסאודו-וירוס מבוססות VSV מכילות לעתים קרובות שאריות וירוסי VSV, אשר יכולים לגרום לשיעורים גבוהים של תוצאות חיוביות שגויות ובדרך כלל דורשים 24 שעות של זיהום20.

מערכת פסאודו-וירוס חדשה של SARS-CoV-2, הפסאודו-וירוס ההיברידי אלפא-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), פותחה לאחרונה על ידי Hetrick et al12. Ha-CoV-2 מספק כלי חדש לכימות מהיר של הדבקה בנגיפים ורגישות הנגיף לנוגדנים מנטרלים במעבדות BSL-2 נפוצות. מבחינה מבנית, Ha-CoV-2 דומה לחלקיק הנגיפים SARS-CoV-2, המורכב מחלבונים מבניים של SARS-CoV-2 כולל חלבון S (S), הממברנה (M), הנוקלאוקפסיד (N) והמעטפת (E), ואין חלבון מבני מנגיפים אחרים. בנוסף, חלקיק Ha-CoV-2 מכיל גנום RNA בעל ביטוי מהיר מאלפא-וירוס לביטוי מהיר של כתב בתאים. הוכח כי Ha- CoV-2 מודד במהירות את הפעילות המנטרלת של נוגדנים בסרה של מחוסנים ומחלימים12. כפי שהודגם על ידי Hetrick et al., בהשוואה לפסאודו-וירוס מבוסס LENTIVIRUS SARS-CoV-2 במבחן מסלול זמן, Ha-CoV-2 ביטא את כתב לוק כבר 2-4 שעות לאחר ההדבקה ואילו הלנטיוירוס-פסאודו-וירוס ביטא לוק לאחר 24 שעות12. בנוסף, היישום הפוטנציאלי של גרסאות Ha-CoV-2 לכימות נוגדנים מנטרלים מודגם עוד יותר על ידי שימוש בנוגדן מנטרל חד-שבטי סטנדרטי, 27BV (ראה איור משלים 1)12. עבודה זו מפרטת את השימוש בפלטפורמת Ha-CoV-2 לכימות מהיר של ההדבקה של וריאנטים של SARS-CoV-2, תוך שימוש בווריאנטים דלתא (B.1.617.2) ואומיקרון (B.1.1.529) כדוגמאות. בנוסף, היישום הפוטנציאלי של גרסאות Ha-CoV-2 לכימות נוגדנים מנטרלים מודגם עוד יותר על ידי שימוש בנוגדן מנטרל חד שבטי סטנדרטי, 27BV12.

Protocol

1. הרכבת וירוסים וחלקיקים נגיפיים

  1. וקטורים: רכישת וקטורי ביטוי עבור SARS-CoV-2 M, E או N וכן עבור SARS-CoV-2 S (סוג פראי, Wt), דלתא (B.1.617.2) ואומיקרון (B.1.1.529) באופן מסחרי.
    הערה: רצפי חלבונים של וקטורי הביטוי מופיעים בקובץ משלים 1. את הספק של וקטורי ביטוי אלה ניתן למצוא גם תחת טבלת החומרים.
  2. תאים ותרבית תאים: לשמור על HEK293T תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 50 יחידות / מ"ל פניצילין, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין.
    הערה: כל עבודת תרבית התאים צריכה להיעשות בארון בטיחות ביולוגית למינרי של זרימת אוויר. טרנספקציית פוליאתילנימין (PEI) דורשת בדרך כלל דגירה של 5-6 שעות. יש לשקול היטב את זמני ההתחלה מראש.
  3. הרכבת וירוסים וקוטרנספקציה מבוססת PEI: הרכבת חלקיקי Ha-CoV-2 על ידי קוטרנספקציה של תאי HEK293T. תאי זרעים בצלחת פטרי תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ (4-5 x 10,6 תאים לצלחת) ב-10 מ"ל של מדיום DMEM שלם ביום שלפני הטרנספקציה. במחקר זה, שלוש צלחות פטרי משמשות לזרע תאים להרכבת Ha-CoV-2 מסוג בר, דלתא ואומיקרון, בהתאמה.
  4. לדגור צלחות פטרי לילה באינקובטור CO2 ב 37 ° C. בדקו את הכלים למחרת בבוקר כדי לוודא שהתאים נפגשים ב-80%. הסר את המדיום המלא והחלף אותו ב- 9 מ"ל של מדיה ללא סרום DMEM.
  5. עבור כל מנה, הכינו תערובת קוטרנספקציה עם 2.5 מיקרוגרם של כל אחד מווקטורי ביטוי החלבונים המבניים של SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 מיקרוגרם pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (גנום HaCoV2), ו-2.5 מיקרוגרם של וקטור ביטוי חלבון S, גרסאות דלתא או אומיקרון S ו-45 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה מבוסס PEI. אפשר לתערובת cotransfection ליצור קומפלקסים על ידי דגירה במשך 13 דקות (לא לדגור במשך יותר מ 30 דקות).
  6. לאחר הדגירה, מוסיפים את תערובת הקוטרנספקציה לכל צלחת פטרי לאט, טיפה אחר טיפה. מניחים את הכלים בתוך אינקובטור CO2 ב 37 ° C במשך 6 שעות. לאחר 6 שעות, הסר DMEM ללא סרום והחלף אותו במדיום DMEM מלא. וירוס הקציר ב 48-60 שעות לאחר cotransfection.
  7. קצירת וירוסים ואחסונם: קציר חלקיקים ב 48 שעות לאחר cotransfection. נתק תאים על ידי צנרת שוב ושוב על פני השטח של monolayer ולאסוף תאים מכל צלחת, לשים לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות. אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. אחסן את הפסאודו-וירוס Ha-CoV-2 ב -80 °C.

2. בדיקת הדבקה ויראלית

  1. תאים ותרבית תאים: לשמור על HEK293T (ACE2/TMPRSS2) תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% FBS מומת חום, 50 יחידות / מ"ל של פניצילין ו 50 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין.
  2. זריעת תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2): יום לפני בדיקת ההדבקה הנגיפית, זרעו תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) בצלחת של 96 בארות במדיית DMEM מלאה של 50 מיקרוליטר. עבור כל צלחת 96 בארות, זרעו 2.5 x 104 תאים לתוך כל באר, ובסך הכל 2.5 x 106 תאים נדרשים עבור צלחת אחת. הניחו את צלחת הבאר 96 באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. זיהום של HEK293T(ACE2/TMPRSS2): השתמש בחלקיקי גרסאות Ha-CoV-2 כדי להדביק תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2). בבוקר ההדבקה, להסיר 50 μL של DMEM מן מראש זרע 96 צלחת באר. החלף מדיה עם 50 μL של Ha-CoV-2 Wild-type, דלתא, או אומיקרון במשך 18 שעות ב 37 ° C.
    הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן עד שהזיהום הגיע ל -18 שעות של דגירה והצלחת מוכנה לניתוח באמצעות בדיקת לוציפראז. הצלחת הזיהום נקבעת על ידי בדיקת לוציפראז הנובעת מגן הכתב לוציפראז המתבטא בתאים הנגועים, ולכן ככל שמופק יותר אות, כך ההדבקה של וריאנט Ha-CoV-2 מוצלחת יותר.
  4. בדיקת Luciferase: לאחר 18 שעות של דגירה, להוסיף 7.5 μL של חיץ ליזה התא ישירות לכל באר ולערבב על ידי טלטול אורביטלי במשך 2 דקות. תאי ליז בחיץ ליזיס למשך 5 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
  5. הכן את תמיסת בדיקת Firefly luciferase על ידי ערבוב תמיסת D-luciferin עם תמיסת הבדיקה Firefly luciferase ביחס של 1:50. לקבלת צלחת שלמה של 96 בארות, שלב 3 מ"ל של תמיסת מצע לוציפראז עם 60 מיקרוליטר של תמיסת D-luciferin עם 2940 μL של תמיסת החיץ Firefly luciferase.
  6. הוסף 25 μL של תמיסת הבדיקה Firefly luciferase לליזטים התא וערבב את הצלחת על ידי ניעור אורביטלי במשך דקה אחת. נתח את פעילות luciferase באמצעות קורא microplate לוציפראז מסחרי.

3. מיצוי RNA של Ha-CoV-2 ו- PCR כמותי של שעתוק לאחור (RT-qPCR)

  1. מיצוי RNA נגיפי: יש לחלץ את ה-RNA הנגיפי מחלקיקי ה-Ha-CoV-2 Wild-type ומחלקיקי ה-Ha-CoV-2 Delta ו-Omicron באמצעות ערכת מיצוי RNA נגיפית מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. אחסן את הרנ"א הנגיפי שחולץ בטמפרטורה של -80°C או השתמש בו מיד עבור RT-qPCR.
  2. RT-qPCR: בצעו RT-qPCR על RNA נגיפי באמצעות תערובת מאסטר חד-שלבית. בצע את התגובה במכשיר PCR מסחרי. שימו לב כי יעד ההגברה הוא ה-RNA הגנומי של Ha-CoV-2. השתמש ב- DNA וקטורי Ha-CoV-2 כתקן ליצירת עקומה סטנדרטית ולחישוב מספר העתק ה- RNA של כל גרסה.

4. בדיקת נוגדנים מנטרלים

  1. זריעה HEK293T(ACE2/TMPRSS2) תאים: יום לפני הבדיקה, זרעו HEK293T תאים (ACE2/TMPRSS2) בצלחת באר 96 ב 50 μL של מדיה DMEM מלאה. תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) נרכשים באופן מסחרי.
  2. לספירת תאים, השג 20 תאי μL מבקבוק T75 המכיל תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2), וערבב עם 20 μL של תמיסת טריפאן כחולה. הוסף 20 μL של תערובת זו לתא ספירת התאים וספור את מספר התאים למ"ל. כדי לזרוע צלחת 96 באר לזיהום, להשתמש 2.5 x 104 תאים לכל באר, ו 2.5 x 106 תאים יהיה צורך בסך הכל. מניחים צלחת באר 96 באינקובטור CO2 ב 37 ° C למשך הלילה.
  3. בדיקת נוגדנים מנטרלים: בפלטת פוליפרופילן סטרילית בעלת 96 בארות, מכינים את הנוגדן המנטרל הסטנדרטי 27BV ואת תערובת Ha-CoV-2. הוסף 8 μL של 27BV (45 מ"ג / מ"ל) לצלחת ובצע דילולים סדרתיים של הנוגדן עם 6 μL של DMEM ללא סרום.
    הערה: הקפד להחליף קצוות פיפטה בין העברות באר וודא שהמדיום נטול הנוגדנים והסרום מעורבבים היטב כדי להפיק תוצאות מדויקות.
  4. לנוגדן המדולל סדרתי, להוסיף 54 μL של חלקיק Ha-CoV-2 ולערבב את הנגיף ואת הנוגדן. טרום דגירה של חלקיקי Ha-CoV-2 עם 27BV בדילול סדרתי למשך שעה אחת ב-37°C ב-5% CO2. לאחר הדגירה של 1 שעות, יש למרוח 50 μL של הנוגדן ותערובת Ha-CoV-2 על צלחת 96 בארות המכילה את תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2.5 x 104 תאים לכל באר) שנזרעו יום קודם.
  5. עבור בקרות, השאר לפחות שלוש בארות המכילות רק את תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2). הוסף 50 μL של תווך שלם לבארות אלה כדי לשמש בארות לא נגועות עבור אות רקע של קריאות בדיקת לוציפראז.
    הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן עד שהזיהום יגיע ל -18 שעות של דגירה ב -37 מעלות צלזיוס, ואז הצלחת מוכנה לניתוח באמצעות בדיקת לוציפראז.
  6. בדיקת לוציפראז: לאחר 18 שעות של דגירה, יש להוסיף 7.5 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ישירות לכל באר ולערבב על ידי טלטול אורביטלי במשך 2 דקות. תאי ליז בחיץ ליזיס למשך 5 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
  7. הכן את תמיסת בדיקת Firefly luciferase על ידי ערבוב תמיסת D-luciferin עם תמיסת הבדיקה Firefly luciferase ביחס של 1:50. לקבלת צלחת שלמה של 96 בארות, שלב 3 מ"ל של תמיסת מצע luciferase עם 60 μL של תמיסת D-luciferin עם 2940 μL של תמיסת חיץ luciferase גחלילית.
  8. הוסף 25 μL של תמיסת הבדיקה Firefly luciferase לליזטים התא וערבב את הצלחת על ידי ניעור אורביטלי במשך דקה אחת. נתח את פעילות luciferase באמצעות קורא microplate לוציפראז מסחרי.

5. כימות וניתוח סטטיסטי

  1. איסוף נתונים: בצעו בדיקות זיהום ולוציפראז בטריפליקט כפי שמצוין (איור 1). כמת ביטוי luciferase עם קריאות assay luciferase. הממוצע הוא הערך הממוצע של שלוש קריאות בדיקת לוציפראז. קריאות אות אות רקע מבארות לא נגועות מופחתות מערך ממוצע זה. סטיית תקן (SD) נקבעת מהערך הממוצע של קריאות בדיקת לוציפראז.
  2. ניתוח נתונים: התווה פעילות נטרול נוגדנים וחשב את ערכי ID50 (מינון עיכוב של 50%) באמצעות תוכנת גרפים מסחרית. ערך ID50 מוגדר כדילול מעכב נוגדנים שבו מושגת הפחתה של 50% בזיהום של תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (בהתבסס על קריאות בדיקת לוציפראז).

Representative Results

חלקיקי Ha-CoV-2 הורכבו באמצעות חמישה וקטורי דנ"א שונים המבטאים את גנום הרנ"א Ha-CoV-2 ואת החלבונים המבניים (M, N, E ו-S) של SARS-CoV-2 בתאי HEK293T. וקטור חלבון S משתנה בהתאם לגרסת S. חלבון S מזן Ha-CoV-2 המקורי של ווהאן (Wild-type, Wt) שימש כבקרה חיובית, והוא הורכב יחד עם חלבון S מכל אחד משני הווריאנטים האחרים: דלתא (B.1.617.2) או אומיקרון (B.1.1.529). אותם M, N, E שימשו בכל הגרסאות. Ha-CoV-2(Wt) וחלקיקים שונים נאספו 48 שעות לאחר cotransfection ולאחר מכן שימשו כדי להדביק תאים HEK293T(ACE2/TMPRSS2). ההדבקה נמדדה על ידי ביטוי של לוציפראז ב 18 שעות לאחר ההדבקה. במערכת זו, רמות ביטוי גבוהות יותר של אות לוציפראז משקפות זיהום גבוה יותר של תאים על ידי Ha-CoV-2. אות הלוציפראז נורמל עם עותקי RNA גנומיים על ידי RT-qPCR עבור כל וריאנט. כפי שניתן לראות באיור 1, וריאנט האומיקרון Ha-CoV-2 יצר אות גבוה פי 4 עד פי 10 מאשר Ha-CoV-2(Wt) המקורי, מה שמרמז על הדבקה גבוהה יותר.

כמו כן, כומתה היכולת של 27BV לנטרל את הווריאנטים HaCoV-2(Wt), דלתא ואומיקרון. 27BV הוא נוגדן חד שבטי ארנב שפותח כנגד תחום RBD של חלבון SARS-COV-2 S1. לצורך מבחני נטרול, דילולים סדרתיים של 27BV בוצעו בלוח של 96 בארות, הודגרו מראש עם Ha-CoV-2, ולאחר מכן נוספו לתאי מטרה HEK293T(ACE2/TMPRSS2). התוצאות הראו של-27BV הייתה פעילות מנטרלת כנגד כל הווריאנטים שנבדקו (איור 2). מעניין לציין כי מזהה50 של 27VB עבור אומיקרון היה בערך פי 10 פחות חזק מאשר ID50 עבור Ha-CoV-2(WT) ו- Ha-CoV-2 (דלתא; איור 2). תוצאות אלה מראות כי פלטפורמת Ha-COV-2 יכולה לשמש כשיטה מהירה לכימות נוגדנים מנטרלים הנגרמים על ידי חיסון בווריאנטים מתפתחים.

Figure 1
איור 1. הרכבה וכימות של גרסאות Ha-CoV-2. (A) איור של הרכבת Ha-CoV-2 וחלקיקים משתנים. הווקטורים המבטאים את גנום כתב Ha-CoV-2 ואת החלבונים המבניים (M, S, N ו- E) נגועים בתאים HEK293T. חלקיקים נקצרו 48 שעות לאחר cotransfection (הדמיה של חלקיקי ויריון ותאים HEK293T נוצרו עם Biorender.com). (B) כימות ההדבקה של וריאנטים Ha-CoV-2. ההדבקה היחסית של שני הווריאנטים (דלתא ואומיקרון) מכומתת ומנורמלת באמצעות עותקי RNA גנומיים של וריאנטים בודדים של Ha-CoV-2 (Luc). סוג פראי הוא Ha-COV-2 (Wt), המשמש כבקרה להשוואה. בדיקות זיהום ולוציפראז בוצעו פי 3. RU, יחידה יחסית. הממוצע וסטיית התקן (SD) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. כימות פעילות נטרול 27BV כנגד גרסאות Ha-CoV-2(Luc) פעילות נטרול של 27BV נותחה 18 שעות לאחר הדבקה של תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2). ID50 חושב באמצעות שיעור זיהום יחסי (פעילות לוציפראז) לעומת ריכוז 27BV. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. זיהום של HEK293T(ACE2/TMPRSS2) עם Ha-CoV-2(GFP). חלקיקי Ha-CoV-2(GFP) הורכבו ולאחר מכן שימשו להדבקת תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2). ביטוי GFP נצפה 48 שעות לאחר ההדבקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השדה הלבן של תאים נגועים מוצג משמאל, והדמיית GFP מוצגת מימין. הפס הלבן מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1. תקציר גרפי. המבנה והיישום של הפסאודו-וירוס Ha-CoV-2. התמונה נוצרה באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1. רצפי חלבונים. רשימת הרצפים של חלבוני SARS-CoV-2 S, M, N ו-E. רצפי חלבון S כוללים גם את וריאנטים SARS-CoV-2 אומיקרון (B.1.1.529) ודלתא (B.1.617.2). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

פלטפורמת Ha-CoV-2 מספקת זרימת עבודה מהירה, חזקה ופשוטה לכימות וריאנטים נגיפיים ולנטרול נוגדנים. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים הדורשים תשומת לב. הייצור של הפסאודו-וירוס Ha-CoV-2 צריך להתבצע באמצעות תאי HEK293T עם כדאיות גבוהה. ניתן לנטר את יעילות הקוטרנספקציה 24 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות הגן GFP reporter מהגנום Ha-CoV-2. גנום Ha-CoV-2 יכול להכיל שני כתבים (GFP ו-Luc), ו-GFP יכול לבוא לידי ביטוי במהלך העברה משותפת ולאחר זיהום Ha-CoV-2 בתאי מטרה12. תאי GFP+ מהדבקה הם בדרך כלל באחוז נמוך (1% עד 5%), אולם כל תא נגוע מבטא אותות GFP חזקים (איור 3). אחוז GFP נמוך זה עשוי להגביל את השימוש ב- GFP כקריאה חזקה לכימות נטרול נוגדנים, בהשוואה לכתב Luc, המכמת את כל אוכלוסיית התאים הנגועים.

בעת ביצוע בדיקת הנטרול, חיוני להחליף את קצות פיפטה בין העברות באר ולוודא שהנוגדנים והמדיום נטול הסרום מעורבבים ביסודיות כדי להפיק תוצאות מדויקות. בנוסף, בעת ביצוע פרוטוקול הבדיקה luciferase, תאים חייב להיות lysed מלא לפחות 3 דקות כדי להבטיח ליזה מלאה של תאים ואת שחרורו של האנזים luciferase. זה יבטיח את הדיוק של הבדיקה. בנוסף, לאחר הוספת תמיסת בדיקת Firefly luciferase ללוחות הבאר האופטיים בעלי הדפנות הלבנות 96, יש לנתח את הצלחת תוך 10 דקות מכיוון שפליטת האור הראשונית גבוהה אך פוחתת עם הזמן ככל שה- ATP מתרוקן21.

ככל שיותר וריאנטים של SARS-CoV-2 ממשיכים להתפתח, יש צורך מוגבר בפלטפורמות כמו Ha-CoV-2 כדי לסנן במהירות הדבקה של וריאנטים ורגישות וריאנטים לנוגדנים מנטרלים הנגרמים על ידי חיסון. פלטפורמת Ha-CoV-2 מציעה מהירות גבוהה יותר, יחס אות לרעש גבוה יותר ופרוטוקול פשוט בהשוואה למבחני נטרול קיימים מבוססי פסאודו-וירוס 8,9,10,11. פלטפורמת Ha-CoV-2 מציעה גם את היתרון שניתן להשתמש בה במעבדות BSL-2 ואינה דורשת שימוש במתקני BSL-3. זה מאפשר ל- SARS-CoV-2 למחקר להמשיך במחקר משותף ובמעבדות קליניות. יתר על כן, פלטפורמת Ha-CoV-2 מפיקה תוצאות מהירות בהשוואה למערכות אחרות. לדוגמה, המחקר של נוגדנים מנטרלים נגד נגיף SARS-CoV-2 מדבק עושה לעתים קרובות שימוש במבחן נטרול הפחתת פלאק (PRINT)22. למרות ש- PRINT מפיק תוצאות אמינות, ספירה ידנית של יחידות יוצרות פלאק (PFU) היא איטית ודורשת 3-5 ימים כדי לקבל תוצאות23,24. מערכות פסאודו-טייפ אחרות, כגון lentivirus-pseudovirus זקוקות ל-24-72 שעות כדי לייצר אות כתב12 הניתן לזיהוי. לשם השוואה, בדיקת נטרול Ha-CoV-2 יכולה להפיק תוצאות תוך 18 שעות. ה- Ha-CoV-2 מספק כלי נוח לסינון וכימות מהיר של וריאנטים נגיפיים ונוגדנים מנטרלים לניטור מגפות.

ניטור ההדבקה של SARS-CoV-2 הוא חיוני ככל שוריאנטים נוספים של דאגה (VOC) ממשיכים לצוץ. Ha-CoV-2 מציע את היתרון של קביעה מהירה של זיהום של תרכובות אורגניות נדיפות. מחקרים קודמים השתמשו במידול מבוסס בינה מלאכותית (AI) כדי לנתח כמותית את ההדבקה של תת-וריאנט האומיקרון והווריאנטים האחרים של SARS-CoV-2, כגון וריאנט דלתא25. מחקרים אלה הראו כי וריאנט האומיקרון מדבק יותר מהנגיף המקורי, ובעל סיכוי גבוה יותר לחמוק מנוגדנים מנטרלים25. במחקרים אלה, באמצעות Ha-CoV-2, נצפו פנוטיפים דומים. בנוסף, בבדיקות נטרול הנוגדנים, הסיכוי של וריאנט האומיקרון להיות מנוטרל נמוך פי עשרה ב-27BV מאשר הזנים ווהאן והדלתא. תוצאות אלה עולות בקנה אחד גם עם הדיווח על העברה גבוהה יותר של וריאנט אומיקרון, שיש לו לפחות 15 מוטציות בתחום קשירת הקולטן שלו (RBD), מה שככל הנראה מגביר את זיקת הקישור הנגיפית לקולטן ACE2 להעברה גבוהה יותר ובריחה חיסונית גדולה יותר26.

Disclosures

פטנט הוגש על ידי אוניברסיטת ג'ורג 'מייסון ורישיון Virongy Biosciences Inc. לפיתוח מוצרים. י.ו. הוא מייסד וחבר במועצה המייעצת של Virongy Biosciences. B.H הוא כיום המנכ"ל והמדען הראשי של Virongy Biosciences. למחברים אין ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הפנימית של אוניברסיטת ג'ורג' מייסון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody Virongy Biosciences 27VBI-01
500 mL - US Origin FBS Neuromics FBS001
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit  Genesee Scientific Cat# 24-300 
Allegra 6R Centrifuge Beckman Coulter 2043-30-1158
DMEM (1x)  ThermoFisher  11995-073
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit Genesee Scientfic 25-209
GlowMax Discover Microplate reader Promega  GM3000 
Ha-CoV-2 E Vector  Virongy Biosciences pCoV2_E
Ha-CoV-2 M Vector  Virongy Biosciences pCoV2_M
Ha-CoV-2 N Vector  Virongy Biosciences pCoV2_N
Ha-CoV-2 WT S Vector Virongy Biosciences pCoV2_WT S
Hek293T cells ATCC CRL-3214
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays Gold Bio  I-930-1000
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney)  VWR  Cat# 82050-758 
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector  In house
PEI-based Transfection Reagent Virongy Biosciences Transfectin
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Invitrogen 10378016
Polyethylenimine, branched Millipore Sigma 408727-100ML
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System ThermoFisher  A43163
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells Virongy Biosciences Ready-To-Use-Cells
SARS-CoV-2 S  Omicron (B.1.1.529) Vector Virongy Biosciences pCoV2-B.1.1.529
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector Virongy Biosciences pCoV2- B.1.617.2
Syringe Filters, PES, 0.22µm Genesee Scientfic 25-244
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix ThermoFisher  4444432
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher  15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
  2. Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
  3. Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
  4. El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
  5. CDC. Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).
  6. Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
  7. Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
  8. Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
  9. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  10. Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
  11. Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
  12. Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
  13. Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  14. Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
  15. Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  16. Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
  17. Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
  18. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
  19. Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
  20. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
  21. Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
  22. Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
  23. Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
  24. Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
  25. Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
  26. Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).

Tags

Ha-CoV-2 Pseudovirus גרסאות SARS-CoV-2 נוגדנים מנטרלים כימות מהיר יעילות החיסון מעקב אחר מגיפה מאיצים ספציפיים לווריאנט אלפא-וירוס היברידי-SARS-CoV-2 פסאודו-וירוס מדידת זיהומיות וריאנטים ויראליים וריאנט דלתא SARS-CoV-2 וריאנט אומיקרון SARS-CoV-2 חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) גנים כתב לוציפראז
יישום של Ha-CoV-2 Pseudovirus לכימות מהיר של גרסאות SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chilin, L., Hetrick, B., Wu, Y.… More

Chilin, L., Hetrick, B., Wu, Y. Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies. J. Vis. Exp. (199), e65793, doi:10.3791/65793 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter