Summary
Detta protokoll beskriver tillämpningen av ett nytt hybrid-alfavirus-SARS-CoV-2-pseudovirus (Ha-CoV-2) som en plattform för snabb kvantifiering av infektionsförmågan hos SARS-CoV-2-varianter och deras känslighet för neutraliserande antikroppar.
Abstract
Coronavirussjukdomen 2019-pandemin (COVID-19) har belyst behovet av snabba analyser för att noggrant mäta infektionsförmågan hos nya SARS-CoV-2-varianter och effektiviteten hos vaccininducerade neutraliserande antikroppar mot virusvarianter. Dessa analyser är viktiga för pandemiövervakning och validering av vacciner och variantspecifika påfyllnadsdoser. Detta manuskript demonstrerar tillämpningen av ett nytt hybrid-alfavirus-SARS-CoV-2-pseudovirus (Ha-CoV-2) för snabb kvantifiering av SARS-CoV-2-variantens infektionsförmåga och vaccininducerade neutraliserande antikroppar mot virusvarianter. Ha-CoV-2 är en SARS-CoV-2-virusliknande partikel som består av virala strukturella proteiner (S, M, N och E) och ett snabbt uttryckande RNA-genom som härrör från ett alfavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 innehåller också både grönt fluorescerande protein (GFP) och luciferasreportergener som möjliggör snabb kvantifiering av viral infektionsförmåga. Som ett exempel kvantifieras smittsamheten hos varianterna SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) och Omicron (B.1.1.529), och deras känslighet för en neutraliserande antikropp (27VB) mäts också. Dessa exempel visar den stora potentialen hos Ha-CoV-2 som en robust plattform för snabb kvantifiering av SARS-CoV-2-varianter och deras känslighet för neutraliserande antikroppar.
Introduction
I maj 2023 hade det nu förekommit mer än 766 miljoner fall av covid-191. Trots världsomspännande vaccinationskampanjer cirkulerar och infekterar SARS-CoV-2 kontinuerligt människor, till stor del på grund av uppkomsten av nya varianter som delta (B.1.617.2) och omikron (B.1.1.529) som driver nya infektionsvågor 2,3,4. Med tanke på att SARS-CoV-2 ständigt utvecklas är det viktigt att utveckla snabba analyser som exakt kan mäta smittsamheten hos nya varianter och effektiviteten hos vaccininducerade neutraliserande antikroppar mot dessa varianter. Dessa analyser är viktiga för pandemiövervakning och för att fastställa effektiviteten hos vacciner och deras variantspecifika boosters.
På grund av den mycket smittsamma karaktären hos SARS-CoV-2 kräver Center for Disease Control and Prevention (CDC) att studien av SARS-CoV-2 och dess varianter utförs i biosäkerhetsnivå (BSL) 3-anläggningar 5,6. Detta BSL-3-krav begränsar användningen av levande virus för att kvantifiera smittsamheten hos virusvarianter och deras neutraliserande antikroppar i vanliga forsknings- och kliniska laboratorier. Dessutom är traditionella SARS-CoV-2-neutraliseringsanalyser, såsom plack- eller cytopatiska effektbaserade analyser med replikationskompetenta levande virus, tidskrävande och kräver långa inkubationsperioder7. Flera spikprotein-pseudotypade SARS-CoV-2-pseudovirus har utvecklats för att kvantifiera effektiviteten av neutraliserande antikroppar 8,9,10,11,12. I SARS-CoV-2 är S-proteinet det huvudsakliga proteinet som förmedlar virusinträde13, och är det huvudsakliga antigenet som används i SARS-CoV-2-vacciner 9,10,14,15,16. S-protein-pseudotypade virioner, såsom de från vesikulär stomatitvirus (VSV-G) eller lentivirus, har använts för kvantifiering av neutraliserande antikroppar 17,18,19. Det lentivirusbaserade pseudoviruset kräver dock normalt 2 till 3 dagars infektion för att kvantifiera rapportörssignaler. VSV-baserade pseudovirussystem innehåller ofta kvarvarande VSV-virus, vilket kan resultera i höga nivåer av falskt positiva resultat och kräver vanligtvis 24 timmars infektion20.
Ett nytt SARS-CoV-2 pseudovirussystem, hybrid-alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), har nyligen utvecklats av Hetrick et al12. Ha-CoV-2 tillhandahåller ett nytt verktyg för snabb kvantifiering av virusinfektionsförmåga och viruskänslighet för neutraliserande antikroppar i vanliga BSL-2-laboratorier. Strukturellt liknar Ha-CoV-2 virionpartikeln, som består av SARS-CoV-2 strukturella proteiner inklusive S-proteinet (S), membranet (M), nukleokapsiden (N) och höljet (E), och det finns inget strukturellt protein från andra virus. Dessutom innehåller Ha-CoV-2-partikeln ett snabbt uttryckande RNA-genom från ett alfavirus för snabbt reporteruttryck i celler. Ha-CoV-2 har visat sig snabbt mäta den neutraliserande aktiviteten av antikroppar i serumet hos vaccinerade och konvalescenta individer12. Som visats av Hetrick et al., när det jämfördes med lentivirusbaserat SARS-CoV-2-pseudovirus i en tidsförloppsanalys, uttryckte Ha-CoV-2 Luc-reportern så tidigt som 2-4 timmar efter infektion medan lentivirus-pseudoviruset uttryckte Luc efter 24 timmar12. Dessutom demonstreras den potentiella tillämpningen av Ha-CoV-2-varianter för kvantifiering av neutraliserande antikroppar ytterligare genom att använda en standard monoklonal neutraliserande antikropp, 27BV (se kompletterande figur 1)12. Detta arbete beskriver användningen av Ha-CoV-2-plattformen för snabb kvantifiering av infektionsförmågan hos SARS-CoV-2-varianter, med hjälp av deltavarianterna (B.1.617.2) och Omicron (B.1.1.529) som exempel. Dessutom demonstreras den potentiella tillämpningen av Ha-CoV-2-varianter för kvantifiering av neutraliserande antikroppar ytterligare genom att använda en standard monoklonal neutraliserande antikropp, 27BV12.
Protocol
1. Sammansättning av virus och viruspartiklar
- Vektorer: Köp uttrycksvektorer för SARS-CoV-2 M, E eller N samt SARS-CoV-2 S (Wild-type,Wt), Delta (B.1.617.2) och Omicron (B.1.1.529) kommersiellt.
Anmärkning: Proteinsekvenser för expressionsvektorerna finns i tilläggsfil 1. Leverantören av dessa uttrycksvektorer finns också under Materialförteckning. - Celler och cellodling: Behåll HEK293T celler i Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) som innehåller 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 50 enheter/ml penicillin och 50 μg/ml streptomycin.
OBS: Allt cellodlingsarbete måste göras i ett biosäkerhetsskåp med laminärt luftflöde. Polyetenimin (PEI) transfektion kräver vanligtvis 5-6 timmars inkubation. Starttiderna måste övervägas noggrant i förväg. - Virusmontering och PEI-baserad kotransfektion: Montera Ha-CoV-2-partiklar genom kotransfektion av HEK293T celler. Fröceller i en petriskål med 10 cm cellodling (4-5 x 106 celler per skål) i 10 ml komplett DMEM-medium dagen före kotransfektion. För denna studie används tre petriskålar för att fröa celler för sammansättning av Ha-CoV-2 vildtyp, Delta respektive Omicron.
- Inkubera petriskålar över natten i en CO2 -inkubator vid 37 °C. Kontrollera disken nästa morgon för att säkerställa att cellerna är 80 % sammanflytande. Ta bort hela mediet och ersätt det med 9 ml DMEM serumfritt medium.
- För varje maträtt bereds en kotransfektionsblandning med 2,5 μg av var och en av SARS-CoV-2-vektorerna för strukturellt proteinuttryck (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-genom) och 2,5 μg av S-proteinuttrycksvektorn, antingen Delta- eller Omicron S-varianterna och 45 μL PEI-baserat transfektionsreagens. Låt kotransfektionsblandningen bilda komplex genom att inkubera i 13 minuter (inkubera inte längre än 30 minuter).
- Efter inkubationen, tillsätt kotransfektionsblandningen till varje petriskål långsamt, droppe för droppe. Placera skålarna i en CO2 -inkubator vid 37 °C i 6 timmar. Efter 6 timmar, ta bort serumfri DMEM och ersätt den med komplett DMEM-medium. Skörda virus 48-60 timmar efter kotransfektion.
- Skörd och lagring av virus: Skörda partiklar 48 timmar efter kotransfektion. Lossa cellerna genom att pipettera upprepade gånger över monolagrets yta och samla upp cellerna från varje skål, lägg dem i 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter. Samla upp supernatanten och låt den passera genom ett 0,22 μM filter. Förvara pseudoviruset Ha-CoV-2 vid -80 °C.
2. Bestämning av virusets smittsamhet
- Celler och cellodling: Behåll HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) som innehåller 10 % värmeinaktiverat FBS, 50 enheter/ml penicillin och 50 μg/ml streptomycin.
- Sådd av HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler: Dagen före virusinfektionsanalys, frö HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler i en 96-hålars platta i 50 μL komplett DMEM-medium. För varje platta med 96 brunnar, frö 2,5 x 104 celler i varje brunn, och totalt behövs 2,5 x 106 celler för en platta. Placera plattan med 96 brunnar i en CO2 -inkubator vid 37 °C över natten.
- Infektion av HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Använd partiklar av Ha-CoV-2-varianter för att infektera HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler. På infektionsmorgonen, ta bort 50 μL DMEM från försådd 96-brunnsplatta. Byt ut media mot 50 μL av antingen Ha-CoV-2 Wild-type, Delta eller Omicron i 18 timmar vid 37 °C.
OBS: Protokollet kan stoppas här tills infektionen har nått 18 timmars inkubation och plattan är redo att analyseras via Luciferas-analys. Infektionens framgång bestäms av Luciferas-analysen som är resultatet av Luciferas-reportergenen som uttrycks i de infekterade cellerna, därför är infektionen av Ha-CoV-2-varianten mer framgångsrik ju mer signal som produceras. - Luciferasanalys: Efter 18 timmars inkubation, tillsätt 7,5 μl celllysbuffert direkt till varje brunn och blanda genom orbitalskakning i 2 minuter. Lysera cellerna i lysbuffert i minst 5 minuter vid rumstemperatur.
- Bered Fireflys luciferasanalyslösning genom att blanda D-luciferinlösningen med Fireflys luciferasanalyslösning i förhållandet 1:50. För en hel 96-hålsplatta, kombinera 3 ml luciferassubstratlösning med 60 μl D-luciferinlösning med 2940 μl Firefly luciferasbuffertlösning.
- Tillsätt 25 μl av Fireflys luciferasanalyslösning till celllysaten och blanda plattan genom orbitalskakning i 1 minut. Analysera luciferasaktiviteten med hjälp av en kommersiell luciferasmikroplattläsare.
3. RNA-extraktion av Ha-CoV-2 och kvantitativt omvänt transkriptas PCR (RT-qPCR)
- Viral RNA-extraktion: Extrahera virus-RNA från Ha-CoV-2 Wild-type och Ha-CoV-2 Delta- och Omicron-variantpartiklarna med hjälp av ett kommersiellt viralt RNA-extraktionskit, enligt tillverkarens instruktioner. Förvara det extraherade virala RNA:t vid -80 °C eller använd det omedelbart för RT-qPCR.
- RT-qPCR: Utför RT-qPCR på viralt RNA med hjälp av en mastermix i ett steg. Utför reaktionen i en kommersiell PCR-maskin. Observera att målet för amplifiering är det genomiska RNA:t för Ha-CoV-2. Använd Ha-CoV-2-vektor-DNA som standard för att skapa en standardkurva och beräkna RNA-kopieantalet för varje variant.
4. Neutraliserande antikroppsanalys
- Sådd av HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler: Dagen före analysen, så HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler i en 96-brunnsplatta i 50 μL komplett DMEM-medium. HEK293T (ACE2/TMPRSS2) celler köps kommersiellt.
- För att räkna celler, erhåll 20 μL celler från en T75-kolv som innehåller HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler och blanda med 20 μL trypanblå lösning. Tillsätt 20 μl av denna blandning till cellräkningskammaren och räkna antalet celler per ml. För att så en 96-brunnsplatta för infektion, använd 2,5 x 104 celler per brunn, och 2,5 x 106 celler kommer att behövas totalt. Placera 96-brunnsplattan i en CO 2-inkubator vid 37 °C över natten.
- Neutraliserande antikroppsanalys: I en steril 96-hålsplatta av polypropen, förbered standarden 27BV neutraliserande antikropp och Ha-CoV-2-blandningen. Tillsätt 8 μl 27BV (45 mg/ml) till plattan och späd antikroppen i serie med 6 μl serumfritt DMEM.
OBS: Var noga med att byta pipettspetsar mellan brunnsöverföringar och se till att antikroppen och det serumfria mediet blandas noggrant för att ge korrekta resultat. - Tillsätt 54 μl Ha-CoV-2-partikel till den seriespädda antikroppen och blanda viruset och antikroppen. Förinkubera Ha-CoV-2-partiklar med serieutspädd 27BV i 1 timme vid 37 °C vid 5 % CO2 . Efter inkubationen på 1 timme appliceras 50 μl av antikropps- och Ha-CoV-2-blandningen på 96-hålsplattan som innehåller de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) cellerna (2,5 x 104 celler per brunn) som såddes dagen innan.
- För kontroller, lämna minst tre brunnar som endast innehåller HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler. Tillsätt 50 μL komplett medium till dessa brunnar för att fungera som icke-infekterade brunnar för bakgrundssignal från luciferasanalysavläsningarna.
OBS: Protokollet kan stoppas här tills infektionen har nått 18 timmars inkubation vid 37 °C, och då är plattan redo att analyseras via luciferasanalys. - Luciferas-analys: Efter 18 timmars inkubation, tillsätt 7,5 μl lyseringsbuffert direkt till varje brunn och blanda genom orbital skakning i 2 minuter. Lysera cellerna i lysbuffert i minst 5 minuter vid rumstemperatur.
- Bered Fireflys luciferasanalyslösning genom att blanda D-luciferinlösningen med Fireflys luciferasanalyslösning i förhållandet 1:50. För en hel 96-hålsplatta, kombinera 3 ml luciferassubstratlösning med 60 μl D-luciferinlösning med 2940 μl eldflugeluciferasbuffertlösning.
- Tillsätt 25 μl av Fireflys luciferasanalyslösning till celllysaten och blanda plattan genom orbitalskakning i 1 minut. Analysera luciferasaktiviteten med hjälp av en kommersiell luciferasmikroplattläsare.
5. Kvantifiering och statistisk analys
- Datainsamling: Utför infektions- och luciferasanalyser i tre exemplar enligt anvisningarna (figur 1). Kvantifiera luciferasuttryck med luciferasanalysavläsningar. Medelvärdet är medelvärdet av de tre luciferasanalysavläsningarna. Bakgrundssignalavläsningar från icke-infekterade brunnar subtraheras från detta medelvärde. Standardavvikelsen (SD) bestäms utifrån medelvärdet av luciferasanalysavläsningarna.
- Dataanalys: Plotta antikroppsneutraliseringsaktivitet och beräkna ID50-värdena (50% hämningsdos) med hjälp av kommersiell grafprogramvara. ID50-värdet definieras som de antikroppshämmande utspädningar vid vilka en 50-procentig minskning av infektionen av HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler (baserat på luciferasanalysavläsningar) uppnås.
Representative Results
Ha-CoV-2-partiklar sattes samman med hjälp av fem olika DNA-vektorer som uttrycker Ha-CoV-2 RNA-genomet och de strukturella proteinerna (M, N, E och S) från SARS-CoV-2 i HEK293T celler. S-proteinvektorn varierar beroende på S-varianten. S-proteinet från den ursprungliga Ha-CoV-2 Wuhan-stammen (Wild-type, Wt) användes som en positiv kontroll, och det sattes ihop tillsammans med S-proteinet från var och en av de andra två varianterna: Delta (B.1.617.2) eller Omicron (B.1.1.529). Samma M, N, E användes i alla varianter. Ha-CoV-2(Wt) och variantpartiklar samlades in 48 timmar efter kotransfektion och användes sedan för att infektera HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler. Infektiviteten mättes genom uttryck av luciferas 18 timmar efter infektion. I detta system återspeglar högre uttrycksnivåer av luciferassignal en högre infektion av celler av Ha-CoV-2. Luciferassignalen normaliserades med genomiska RNA-kopior med RT-qPCR för varje variant. Som framgår av figur 1 genererade Omicron-varianten Ha-CoV-2 4 till 10 gånger högre signal än den ursprungliga Ha-CoV-2(Wt), vilket tyder på en högre smittsamhet.
Dessutom kvantifierades kapaciteten hos 27BV att neutralisera HaCoV-2(Wt), Delta och Omicron-varianter. 27BV är en monoklonal antikropp hos kanin som utvecklades mot RBD-domänen av SARS-COV-2 S1-proteinet. För neutralisationsanalyser utfördes seriespädningar av 27BV i en 96-hålsplatta, förinkuberad med Ha-CoV-2 och tillsattes sedan till HEK293T(ACE2/TMPRSS2) målceller. Resultaten visade att 27BV hade neutraliserande aktivitet mot alla testade varianter (Figur 2). Intressant nog var ID50 för 27VB för Omicron ungefär 10 gånger mindre potent än ID50 för Ha-CoV-2(WT) och Ha-CoV-2(Delta; Figur 2). Dessa resultat visar att Ha-COV-2-plattformen kan användas som en snabb metod för att kvantifiera vaccininducerade neutraliserande antikroppar i nya varianter.
Figur 1. Montering och kvantifiering av Ha-CoV-2-varianter. (A) Illustration av sammansättningen av Ha-CoV-2 och variantpartiklar. Vektorerna som uttrycker Ha-CoV-2-reportergenomet och strukturella proteiner (M, S, N och E) är kotransfekterade i HEK293T celler. Partiklar skördades 48 timmar efter kotransfektion (avbildning av virionpartiklar och HEK293T celler skapades med Biorender.com). (B) Kvantifiering av infektionsförmågan hos Ha-CoV-2-varianter. Den relativa smittsamheten hos de två varianterna (Delta och Omicron) kvantifieras och normaliseras med hjälp av genomiska RNA-kopior av enskilda Ha-CoV-2-varianter (Luc). Wild-type är Ha-COV-2 (Wt), som används som en kontroll för jämförelse. Infektions- och luciferasanalyser utfördes 3x. RU, relativ enhet. Medelvärdet och standardavvikelsen (SD) visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Kvantifiering av 27BV-neutraliseringsaktivitet mot Ha-CoV-2(Luc)-varianter Neutraliseringsaktivitet av 27BV analyserades 18 timmar efter infektion av HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler. ID50 beräknades med hjälp av relativ infektionsfrekvens (luciferasaktivitet) kontra 27BV-koncentration. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Infektion av HEK293T(ACE2/TMPRSS2) med Ha-CoV-2(GFP). Ha-CoV-2(GFP)-partiklar sattes ihop och användes sedan för att infektera HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-celler. GFP-uttryck observerades 48 timmar efter infektion med hjälp av fluorescensmikroskopi. Det vita fältet med infekterade celler visas till vänster och GFP-avbildning visas till höger. Den vita stapeln representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1. Grafiskt abstrakt. Ha-CoV-2 pseudovirusets struktur och tillämpning. Bild skapad med Biorender.com. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1. Proteinsekvenser. Lista över sekvenserna av SARS-CoV-2 S-, M-, N- och E-proteiner. S-proteinsekvenserna inkluderar även SARS-CoV-2-varianterna Omicron (B.1.1.529) och Delta (B.1.617.2). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Ha-CoV-2-plattformen ger ett snabbt, robust och enkelt arbetsflöde för att kvantifiera virusvarianter och neutralisera antikroppar. Det finns dock några kritiska steg som behöver uppmärksammas. Produktionen av pseudoviruset Ha-CoV-2 bör utföras med hjälp av HEK293T celler med hög viabilitet. Kotransfektionseffektiviteten kan övervakas 24 timmar efter transfektionen med hjälp av GFP-reportergenen från Ha-CoV-2-genomet. Ha-CoV-2-genomet kan innehålla två rapportörer (GFP och Luc), och GFP kan uttryckas under kotransfektion och efter Ha-CoV-2-infektion av målceller12. GFP+-cellerna från infektion har normalt en låg andel (1 % till 5 %), men varje infekterad cell uttrycker starka GFP-signaler (figur 3). Denna låga GFP-andel kan begränsa användningen av GFP som en robust avläsning för att kvantifiera antikroppsneutralisering, jämfört med Luc-reportern, som kvantifierar hela populationen av infekterade celler.
När neutraliseringsanalysen utförs är det viktigt att byta pipettspetsar mellan brunnsöverföringar och att säkerställa att antikroppen och det serumfria mediet blandas noggrant för att ge korrekta resultat. Dessutom, vid utförande av luciferasanalysprotokollet, måste cellerna lyseras fullständigt i minst 3 minuter för att säkerställa fullständig lys av celler och frisättning av luciferasenzymet. Detta kommer att säkerställa analysens noggrannhet. Dessutom, när Fireflys luciferasanalyslösning har tillsatts till de optiska vitväggiga 96-brunnsplattorna, måste plattan analyseras inom 10 minuter eftersom den initiala ljusemissionen är hög men minskar med tiden när ATP är utarmad21.
I takt med att fler SARS-CoV-2-varianter fortsätter att utvecklas finns det ett ökat behov av plattformar som Ha-CoV-2 för att snabbt screena för variantinfektionsförmåga och variantkänslighet för vaccininducerade neutraliserande antikroppar. Ha-CoV-2-plattformen erbjuder snabbare hastighet, ett högre signal-brusförhållande och ett enkelt protokoll jämfört med befintliga pseudovirusbaserade neutraliseringsanalyser 8,9,10,11. Ha-CoV-2-plattformen har också fördelen att den kan användas i BSL-2-laboratorier och inte kräver användning av BSL-3-anläggningar. Detta gör att SARS-CoV-2 kan bedrivas i gemensamma forsknings- och kliniska laboratorier. Dessutom ger Ha-CoV-2-plattformen snabba resultat i jämförelse med andra system. Till exempel använder studier av neutraliserande antikroppar mot infektiöst SARS-CoV-2-virus ofta plackreduceringsneutralisationstestet (PRINT)22. Även om PRINT ger tillförlitliga resultat är manuell räkning av plackbildande enheter (PFU) långsam och kräver 3-5 dagar för att få resultat23,24. Andra pseudotypsystem, såsom lentivirus-pseudovirus, behöver 24-72 timmar för att producera en detekterbar rapportsignal12. Som jämförelse kan Ha-CoV-2-neutraliseringsanalysen generera resultat inom 18 timmar. Ha-CoV-2 är ett bekvämt verktyg för snabb screening och kvantifiering av virusvarianter och neutraliserande antikroppar för pandemiövervakning.
Det är viktigt att övervaka smittsamheten hos SARS-CoV-2 eftersom fler oroande varianter (VOC) fortsätter att dyka upp. Fördelen med Ha-CoV-2 är att den snabbt kan bestämma smittsamheten hos flyktiga organiska föreningar. Tidigare studier har använt artificiell intelligens (AI)-baserad modellering för att kvantitativt analysera smittsamheten hos omikron-undervarianten och de andra SARS-CoV-2-varianterna, såsom deltavarianten25. Dessa studier har visat att omikronvarianten är mer smittsam än det ursprungliga viruset och har större sannolikhet att undkomma neutraliserandeantikroppar. I dessa studier, med användning av Ha-CoV-2, observerades liknande fenotyper. Dessutom, i antikroppsneutraliseringsanalyserna, är det tio gånger mindre sannolikt att Omicron-varianten neutraliseras av 27BV än Wuhan- och Delta-stammarna. Dessa resultat överensstämmer också med den rapporterade högre överförbarheten av omikronvarianten, som har minst 15 mutationer på sin receptorbindande domän (RBD), vilket sannolikt ökar virusbindningsaffiniteten till ACE2-receptorn för högre överförbarhet och större immunflykt26.
Disclosures
Ett patent har lämnats in av George Mason University och licensierats till Virongy Biosciences Inc. för produktutveckling. Y.W. är grundare och medlem i den rådgivande styrelsen för Virongy Biosciences. B. H är för närvarande VD och Chief Scientific Officer för Virongy Biosciences. Författarna har inga andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av George Mason Universitys interna forskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody | Virongy Biosciences | 27VBI-01 | |
| 500 mL - US Origin FBS | Neuromics | FBS001 | |
| AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit | Genesee Scientific | Cat# 24-300 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman Coulter | 2043-30-1158 | |
| DMEM (1x) | ThermoFisher | 11995-073 | |
| GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit | Genesee Scientfic | 25-209 | |
| GlowMax Discover Microplate reader | Promega | GM3000 | |
| Ha-CoV-2 E Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_E | |
| Ha-CoV-2 M Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_M | |
| Ha-CoV-2 N Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_N | |
| Ha-CoV-2 WT S Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_WT S | |
| Hek293T cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays | Gold Bio | I-930-1000 | |
| Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) | VWR | Cat# 82050-758 | |
| pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector | In house | ||
| PEI-based Transfection Reagent | Virongy Biosciences | Transfectin | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Invitrogen | 10378016 | |
| Polyethylenimine, branched | Millipore Sigma | 408727-100ML | |
| QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System | ThermoFisher | A43163 | |
| Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells | Virongy Biosciences | Ready-To-Use-Cells | |
| SARS-CoV-2 S Omicron (B.1.1.529) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2-B.1.1.529 | |
| SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2- B.1.617.2 | |
| Syringe Filters, PES, 0.22µm | Genesee Scientfic | 25-244 | |
| TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | ThermoFisher | 4444432 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 |
References
- World Health Organization. Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
- Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
- Dhama, K., et al.
- El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
- CDC. Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).
- Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
- Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
- Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
- Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
- Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
- Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
- Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
- Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
- Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
- Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
- Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
- Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
- Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
- Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
- Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).
