膵管腺癌の多能性へのリプログラミング
Summary
本プロトコルは、膵管腺癌(PDAC)および正常な膵管上皮細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)に再プログラミングすることを記述する。レンチウイルスの調製から安定なiPS細胞株の樹立まで、最適化された詳細な手順を段階的に提供します。
Abstract
転写因子を用いた人工多能性幹細胞(iPS細胞)の作製は、ほぼすべての分化細胞種から達成されており、研究や臨床応用に高い価値があることが証明されています。興味深いことに、膵管腺がん(PDAC)などのがん細胞のiPS細胞のリプログラミングは、浸潤性PDAC表現型を逆転させ、がんエピゲノムを上書きすることが示されています。PDAC由来iPS細胞の分化は、初期の膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体からのPDACの進行を再現し、PDACの進行の初期に起こる分子的および細胞的変化を明らかにすることができます。したがって、PDAC由来のiPS細胞は、早期発見診断マーカーの発見のためのPDACの初期段階をモデル化するために使用できます。これは、初期のPanIN期の信頼できるバイオマーカーがないため、通常、転移後期で診断されるPDAC患者にとって特に重要です。しかし、PDACを含むがん細胞株を多能性にリプログラミングすることは、依然として困難で労働集約的であり、異なる細胞株間で大きなばらつきがあります。ここでは、ビシストロニックレンチウイルスベクターを用いて、様々なヒトPDAC細胞株からiPS細胞を作製するための、より一貫性のあるプロトコルについて述べる。得られたiPS細胞株は安定しており、リプログラミング因子や誘導性薬物の外因性発現に依存しないことを示しています。全体として、このプロトコルは、PDAC症例のより特異的で代表的な早期バイオマーカーの発見に不可欠な、幅広いPDAC由来iPS細胞の作製を容易にします。
Introduction
膵管腺がん(PDAC)は最も致命的な悪性腫瘍の1つであり、この疾患の無症候性の性質のために早期診断は依然として困難です。PDAC患者の大多数は、治療の選択肢が非常に限られている進行性転移段階で診断されます1,2。これは主に、血流に放出されたタンパク質として便利に検出できるバイオマーカーなど、初期段階の信頼できるバイオマーカーが不足しているためです。
PDACは進行の非常に早い時期に播種する可能性があり、PDACが膵臓に局在している場合、予後が良好になるとがんの早期発見につながることがわかっています3。しかし、予後が良好と診断され、外科的切除が可能となるPDAC患者の10分の1未満である。それにもかかわらず、切除可能な腫瘍を有する少数の患者は、12ヵ月以内に腫瘍が再発する傾向もあります4。
過去50年間で、外科的技術、患者ケア、および治療法において目覚ましい改善が行われました5,6。しかし、外科的に切除されたPDAC患者の5年生存率は17%にかろうじて上昇している。それにもかかわらず、これはほとんど変わらない(0.9%)未切除患者よりもまだましです4,7。化学療法は、PDACの代替療法としては他に唯一の治療法です。しかし、PDAC患者の大多数はゲムシタビン7,8などの化学療法薬に対して強い耐性を示すため、この選択肢は非常に限られています。エルロチニブなどの他の薬剤は、特定の変異を有する少数のPDAC患者にのみ利用可能であり、そのほとんどがエルロチニブ耐性を示す9。ほとんどのPDAC患者における化学療法に関連する有害な副作用は、この治療のさらに別の欠点です10。最近、有望な戦略により、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)と低分子キナーゼ阻害剤(SMKI)がPDACの治療に有効であることが示されていますが、これらの標的療法に対する持続的な反応は少数の患者に限られています11,12。全体として、PDAC特異的な早期バイオマーカーの発見は、早期診断と治療のための新しい道を開く可能性があります。
PDACは、非侵襲性膵管上皮増殖に起因する膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体病変から発症する13,14。PanINの形成はKRASなどのがん遺伝子変異によって開始されますが、PDACへの進行には追加の遺伝的およびエピジェネティックな変化が必要です。PanINがさまざまな段階を経て侵襲性PDACに進行するには、約10年かかると予測されています13、15、16、17。この時間枠は、早期PDAC診断の恩恵を受ける絶好の機会を提供します。したがって、PDACの進行を研究するために、腫瘍異種移植動物モデルとオルガノイド培養を確立するための広範な研究が行われてきました18,19,20,21。これらのモデルは、PDACの侵襲的段階を研究するのに非常に有用であるが、初期のPanIN段階からの移行ではない。したがって、早期発見バイオマーカーの発見を可能にするために、PanINステージの初期の進行を再現できる実験モデルを開発することが重要です。
4つの転写因子OCT4、SOX2、KLF4、およびc-MYC(OSKM)を使用して、体細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)にリプログラミングすると、細胞の可塑性の程度が示されました22。がん細胞の可塑性は十分に立証されており、ヒトがん細胞をiPS細胞にリプログラミングすることで、細胞を元の細胞状態にリセットし、がんの進行中に蓄積したエピジェネティックな損傷の多くを取り除くことに成功しています23,24,25,26,27,28,29.したがって、このリプログラミング戦略を使用してがん細胞の同一性を操作する可能性は、がんの治療に大きな期待が寄せられています30,31。実際、PDAC由来のiPS細胞の分化は、初期のPanINステージ32を通じてPDACの進行を再現できることを以前に示しました。PDACの初期から中期に特異的な遺伝子と経路を特定することにより、PDACの早期診断に臨床的に使用できる候補バイオマーカーが特定されました32,33。しかし、単一のiPS細胞株を用いて発見されたバイオマーカーは、PDAC患者の大多数において限られた範囲しかカバーしていないことが示された32。他のPDAC患者からiPS細胞株を作製するという課題により、より信頼性の高いバイオマーカーを発見する能力が妨げられてきました。これは、ヒト初代PDAC細胞のごく一部のみが4つの因子をすべて含み、リプログラミングに正常に応答したため、OSKM送達の不均一性を含む多くの技術的要因によるものです。ここでは、OSKMのより効率的で一貫性のあるデュアルレンチウイルス送達を使用して初代PDAC細胞をリプログラミングするための詳細なプロトコルを示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
がんの進行を研究するためのiPS細胞リプログラミングの使用を容易にするために、膵臓がん細胞をリプログラミングするための堅牢なプロトコルが確立されています。がん細胞からiPS細胞を作製することに成功した研究はごくわずかであり、がん細胞を多能性にリプログラミングすることは非常に困難であることが証明されています32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S.とJ.K.は、Cancer Research UKとOHSUの資金提供に感謝します(CRUK-OHSUプロジェクト賞C65925 / A26986)。A.S.は、MRCキャリア開発賞(MR/N024028/1)によってサポートされています。A.A.は、キング・アブドゥルアズィーズ・シティ・フォー・サイエンス・アンド・テクノロジーの博士号奨学金(奨学金文献1078107040)によって資金提供されています。JKは、MRF新治験責任医師助成金(GCNCR1042A)およびKnight CEDAR助成金(68182-933-000、68182-939-000)によって資金提供されています。梶圭介教授には、リプログラミングベクターpSIN4-EF1a-O2SとpSIN4-CMV-K2Mを提供していただき、誠にありがとうございます。オープンアクセスの目的で、著者はクリエイティブ・コモンズ表示(CC BY)ライセンスを、この投稿から生じる著者が承認した原稿のバージョンに適用しています。
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
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