Перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в плюрипотентность
Summary
Настоящий протокол описывает перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и нормальных эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Мы предлагаем оптимизированную и подробную, пошаговую процедуру, от подготовки лентивируса до создания стабильных линий ИПСК.
Abstract
Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием транскрипционных факторов была достигнута практически из любого типа дифференцированных клеток и оказалась очень ценной для исследований и клинического применения. Интересно, что ИПСК перепрограммирования раковых клеток, таких как протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), как было показано, обращает вспять инвазивный фенотип PDAC и переопределяет эпигеном рака. Дифференцировка ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC по сравнению с его ранним предшественником интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN), выявляя молекулярные и клеточные изменения, которые происходят на ранних стадиях прогрессирования PDAC. Таким образом, ИПСК, полученные на основе PDAC, могут быть использованы для моделирования самых ранних стадий PDAC для выявления диагностических маркеров раннего обнаружения. Это особенно важно для пациентов с PDAC, которые обычно диагностируются на поздних метастатических стадиях из-за отсутствия надежных биомаркеров для более ранних стадий PanIN. Тем не менее, перепрограммирование линий раковых клеток, включая PDAC, в плюрипотентность остается сложным, трудоемким и сильно варьирующим между различными линиями. В данной статье мы опишем более последовательный протокол генерации ИПСК из различных клеточных линий PDAC человека с использованием лентивирусных векторов бицистроника. Полученные линии ИПСК стабильны и не зависят от экзогенной экспрессии перепрограммирующих факторов или индуцируемых препаратов. В целом, этот протокол способствует генерации широкого спектра ИПСК, полученных из PDAC, что имеет важное значение для обнаружения ранних биомаркеров, которые являются более специфичными и репрезентативными для случаев PDAC.
Introduction
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертельных злокачественных новообразований, и ранняя диагностика остается сложной задачей из-за бессимптомного характера заболевания. У большинства пациентов с ОАПК диагноз ставится на поздней метастатической стадии, когда возможности лечения очень ограничены 1,2. В основном это связано с отсутствием надежных биомаркеров для ранних стадий, таких как те, которые могут быть легко обнаружены в виде белков, высвобождаемых в кровоток.
PDAC может распространяться очень рано во время его прогрессирования, и лучший прогноз связан с ранним выявлением рака, когда PDAC локализуется в поджелудочной железе3. Тем не менее, менее чем у десятой части пациентов с PDAC диагностируется благоприятный прогноз, позволяющий провести хирургическую резекцию. Тем не менее, те немногие, у которых есть операбельные опухоли, также склонны к рецидиву опухоли в течение 12месяцев.
За последние пятьдесят лет были достигнуты значительные улучшения в хирургических методах, уходе за пациентами и методах лечения 5,6. Тем не менее, 5-летняя выживаемость у пациентов с хирургически резецированным ППАК едва ли возросла до 17%. Тем не менее, это все еще лучше, чем у нерезецированных пациентов, которое осталось почти неизменным (0,9%)4,7. Химиотерапия является единственным альтернативным методом лечения PDAC. Тем не менее, этот вариант очень ограничен, так как подавляющее большинство пациентов с PDAC демонстрируют сильную резистентность к химиотерапевтическим препаратам, таким как гемцитабин 7,8. Другие препараты, такие как Эрлотиниб, доступны только для небольшой группы пациентов с PDAC со специфическими мутациями, большинство из которых демонстрируют резистентность к Эрлотинибу9. Неблагоприятные побочные эффекты, связанные с химиотерапией у большинства пациентов с PDAC, являются еще одним недостатком этого лечения10. В последнее время многообещающие стратегии показали, что ингибиторы контрольных точек иммунного ответа (ICI) и ингибиторы низкомолекулярных киназ (SMKI) могут быть эффективными в лечении PDAC, но устойчивый ответ на эти таргетные методы лечения остается ограниченным меньшинством пациентов11,12. В целом, открытие ранних биомаркеров, специфичных для PDAC, может проложить новые пути для ранней диагностики и лечения.
PDAC развивается из поражений-предшественников интраэпителиальных новообразований поджелудочной железы (PanIN), которые возникают в результате неинвазивной пролиферации эпителия протоков поджелудочной железы 13,14. В то время как образование PanIN инициируется онкогенными мутациями, такими как KRAS, для прогрессирования PDAC требуются дополнительные генетические и эпигенетические изменения. Было подсчитано, что прогрессирование PanIN через различные стадии в инвазивный PDAC занимает около 10 лет 13,15,16,17. Этот период времени дает прекрасную возможность извлечь выгоду из ранней диагностики PDAC. В связи с этим были проведены обширные исследования по созданию моделей опухолевого ксенотрансплантата на животных и органоидных культур для изучения прогрессирования PDAC 18,19,20,21. Эти модели были очень полезны для изучения инвазивных стадий PDAC, но не перехода от ранних фаз PanIN. Поэтому важно разработать экспериментальные модели, которые могут повторить раннюю прогрессию стадий PanIN, чтобы позволить обнаружить биомаркеры раннего обнаружения.
Перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) с использованием четырех транскрипционных факторов OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC (OSKM) проиллюстрировало степень клеточной пластичности22. Пластичность раковых клеток была хорошо задокументирована, и перепрограммирование раковых клеток человека в ИПСК было успешно использовано для восстановления клеток до их первоначального клеточного состояния, устраняя многие эпигенетические повреждения, которые накапливались во время прогрессирования рака 23,24,25,26,27,28,29. Таким образом, возможность использования этой стратегии перепрограммирования для манипулирования идентификацией раковых клеток представляет большие перспективы в лечении рака30,31. Действительно, ранее мы показали, что дифференциация ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC до ранних стадий PanIN32. Путем идентификации генов и путей, специфичных для ранних и промежуточных стадий PDAC, были идентифицированы биомаркеры-кандидаты, которые могут быть клинически использованы для ранней диагностики PDAC32,33. Тем не менее, биомаркеры, обнаруженные с помощью одной линии ИПСК, показали ограниченный охват у большинства пациентов с PDAC32. Трудности с получением линий ИПСК от других пациентов с ОАПК остановили возможность обнаружения более надежных биомаркеров. Это связано со многими техническими факторами, в том числе с гетерогенностью доставки OSKM, так как только небольшая часть первичных клеток PDAC человека содержала все четыре фактора и успешно реагировала на перепрограммирование. Здесь представлен подробный протокол перепрограммирования первичных клеток PDAC с использованием более эффективной и последовательной двойной лентивирусной доставки OSKM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы облегчить использование ИПСК для изучения прогрессирования рака, был разработан надежный протокол перепрограммирования раковых клеток поджелудочной железы. Перепрограммирование раковых клеток в плюрипотентность до сих пор оказалось очень сложной задачей, поскольку только в ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
А.С. и Дж.К. благодарят Cancer Research UK и OHSU за финансирование (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S получает награду MRC за развитие карьеры (MR/N024028/1). Программа A.A финансируется за счет стипендии доктора философии (стипендия 1078107040) от Города науки и технологий имени короля Абдул-Азиза. J.K финансируется грантом MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) и грантом Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Мы благодарим профессора Кэйсукэ Кадзи за любезное предоставление векторов перепрограммирования pSIN4-EF1a-O2S и pSIN4-CMV-K2M. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором, возникшей в результате этой заявки.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Recherche en cancérologie. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Recherche en cancérologie. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Recherche en cancérologie. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors’ initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
