Reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique à la pluripotence
Summary
Le présent protocole décrit la reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) et des cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales en cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Nous fournissons une procédure optimisée et détaillée, étape par étape, de la préparation du lentivirus à l’établissement de lignées iPSC stables.
Abstract
La génération de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à l’aide de facteurs de transcription a été réalisée à partir de presque tous les types de cellules différenciées et s’est avérée très précieuse pour la recherche et les applications cliniques. Il est intéressant de noter que la reprogrammation des cellules cancéreuses par iPSC, comme l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), inverse le phénotype invasif du PDAC et remplace l’épigénome du cancer. La différenciation des iPSC dérivées du PDAC peut récapituler la progression du PDAC à partir de son précurseur précoce de la néoplasie intra-épithéliale pancréatique (PanIN), révélant les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent tôt au cours de la progression du PDAC. Par conséquent, les iPSC dérivées du PDAC peuvent être utilisées pour modéliser les premiers stades du PDAC pour la découverte de marqueurs diagnostiques de détection précoce. Ceci est particulièrement important pour les patients atteints de PDAC, qui sont généralement diagnostiqués aux stades métastatiques tardifs en raison d’un manque de biomarqueurs fiables pour les stades antérieurs de PanIN. Cependant, la reprogrammation des lignées cellulaires cancéreuses, y compris le PDAC, en pluripotence reste difficile, laborieuse et très variable entre les différentes lignées. Ici, nous décrivons un protocole plus cohérent pour générer des iPSC à partir de diverses lignées cellulaires PDAC humaines à l’aide de vecteurs lentiviraux bicistroniques. Les lignées iPSC résultantes sont stables, ne montrant aucune dépendance à l’expression exogène de facteurs de reprogrammation ou de médicaments inductibles. Dans l’ensemble, ce protocole facilite la génération d’un large éventail d’iPSC dérivées du PDAC, ce qui est essentiel pour découvrir des biomarqueurs précoces plus spécifiques et représentatifs des cas de PDAC.
Introduction
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’une des tumeurs malignes les plus mortelles, et le diagnostic précoce reste difficile en raison de la nature asymptomatique de la maladie. La majorité des patients atteints de PDAC sont diagnostiqués au stade métastatique avancé lorsque les options de traitement disponibles sont très limitées 1,2. Cela est principalement dû au manque de biomarqueurs fiables pour les stades précoces, tels que ceux qui pourraient être facilement détectés comme des protéines libérées dans la circulation sanguine.
Le PDAC peut se disséminer très tôt au cours de sa progression, et un meilleur pronostic a été associé à la détection précoce du cancer lorsque le PDAC est localisé dans le pancréas3. Cependant, moins d’un dixième des patients atteints de PDAC reçoivent un diagnostic de pronostic favorable, ce qui permet une résection chirurgicale. Néanmoins, les quelques personnes atteintes de tumeurs résécables sont également sujettes à une récidive tumorale dans les 12 mois4.
Au cours des cinq dernières décennies, des améliorations remarquables ont été apportées aux techniques chirurgicales, aux soins aux patients et aux modalités de traitement 5,6. Cependant, le taux de survie à 5 ans chez les patients PDAC réséqués chirurgicalement a à peine atteint 17 %. Néanmoins, cela reste meilleur que celui des patients non réséqués, qui est resté pratiquement inchangé (0,9 %)4,7. La chimiothérapie est le seul autre traitement alternatif du PDAC. Cependant, cette option est très limitée car la grande majorité des patients atteints de PDAC présentent une forte résistance aux médicaments de chimiothérapie tels que la gemcitabine 7,8. D’autres médicaments, comme l’erlotinib, ne sont disponibles que pour un petit groupe de patients atteints de PDAC présentant des mutations spécifiques, dont la plupart présentent une résistance à l’erlotinib9. Les effets secondaires indésirables associés à la chimiothérapie chez la plupart des patients PDAC sont un autre inconvénient de ce traitement10. Récemment, des stratégies prometteuses ont montré que les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) et les inhibiteurs de kinases à petites molécules (SMKI) peuvent être efficaces dans le traitement du PDAC, mais les réponses durables à ces thérapies ciblées restent limitées à une minorité de patients11,12. Dans l’ensemble, la découverte de biomarqueurs précoces spécifiques au PDAC peut ouvrir de nouvelles voies pour un diagnostic et un traitement précoces.
Le PDAC se développe à partir de lésions précurseurs de néoplasmes intra-épithéliales pancréatiques (PanIN) qui résultent de proliférations épithéliales non invasives du canal pancréatique13,14. Bien que la formation de PanIN soit initiée par des mutations oncogènes telles que KRAS, des altérations génétiques et épigénétiques supplémentaires sont nécessaires pour la progression vers le PDAC. Il a été prévu que la progression du PanIN à travers les différentes étapes vers le PDAC invasif prend environ 10 ans 13,15,16,17. Ce délai offre une excellente occasion de bénéficier d’un diagnostic précoce de l’ACPE. Par conséquent, des recherches approfondies ont été menées pour établir des modèles animaux de xénogreffes tumorales et des cultures d’organoïdes afin d’étudier la progression du PDAC 18,19,20,21. Ces modèles ont été très utiles pour étudier les stades invasifs du PDAC, mais pas la transition des premières phases de PanIN. Il est donc important de développer des modèles expérimentaux capables de récapituler la progression précoce des stades PanIN pour permettre la découverte de biomarqueurs de détection précoce.
La reprogrammation des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à l’aide des quatre facteurs de transcription OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC (OSKM) a illustré l’étendue de la plasticité cellulaire22. La plasticité des cellules cancéreuses a été bien documentée, et la reprogrammation des cellules cancéreuses humaines en iPSC a été utilisée avec succès pour réinitialiser les cellules à leur état cellulaire d’origine, éliminant ainsi de nombreuses agressions épigénétiques qui se sont accumulées au cours de la progression du cancer 23,24,25,26,27,28,29. La possibilité d’utiliser cette stratégie de reprogrammation pour manipuler l’identité des cellules cancéreuses s’est donc révélée très prometteuse dans le traitement du cancer30,31. En effet, nous avons précédemment montré que la différenciation des iPSC dérivées des PDAC peut récapituler la progression du PDAC à travers les premiers stades PanIN32. En identifiant les gènes et les voies spécifiques aux stades précoces et intermédiaires du PDAC, des biomarqueurs candidats ont été identifiés qui peuvent être utilisés cliniquement pour le diagnostic précoce du PDAC32,33. Cependant, les biomarqueurs découverts à l’aide d’une seule lignée d’iPSC ont montré une couverture limitée chez la majorité des patients atteints de PDAC32. Les défis liés à la génération de lignées iPSC à partir d’autres patients PDAC ont mis fin à la capacité de découvrir des biomarqueurs plus fiables. Cela est dû à de nombreux facteurs techniques, notamment l’hétérogénéité de l’administration d’OSKM, car seule une petite partie des cellules primaires humaines du PDAC contenait les quatre facteurs et répondait avec succès à la reprogrammation. Ici, un protocole détaillé est présenté pour reprogrammer les cellules primaires PDAC en utilisant une double administration lentivirale plus efficace et cohérente d’OSKM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour faciliter l’utilisation de la reprogrammation des iPSC pour étudier la progression du cancer, un protocole robuste a été établi pour la reprogrammation des cellules cancéreuses du pancréas. La reprogrammation des cellules cancéreuses en pluripotence s’est avérée très difficile jusqu’à présent, car seules quelques études ont réussi à générer des iPSC à partir de cellules cancéreuses 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S et J.K tiennent à remercier Cancer Research UK et OHSU pour leur financement (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S est soutenu par une bourse de développement de carrière du CMR (MR/N024028/1). Les AA sont financés par une bourse de doctorat (bourse réf. 1078107040) de la Cité du roi Abdulaziz pour la science et la technologie. J.K est financé par la subvention de nouveau chercheur MRF (GCNCR1042A) et la subvention Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Nous remercions le professeur Keisuke Kaji d’avoir aimablement fourni les vecteurs de reprogrammation pSIN4-EF1a-O2S et pSIN4-CMV-K2M. Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Commons Attribution (CC BY) à toute version du manuscrit accepté par l’auteur découlant de cette soumission.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
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