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Recherche en cancérologie

췌관 선암을 다능성으로 재프로그래밍

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/65811
, , , , , ,
1Centre for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Repair, Institute of Stem Cell Research,The University of Edinburgh, 2King Abdulaziz City for Science and Technology Health Sector (KACST), 3Cancer Early Detection Advanced Research Center, Knight Cancer Institute,Oregon Health & Science University, 4Brenden-Colson Canter for Pancreatic Care,Oregon Health & Science University, 5Department of Surgery,Oregon Health & Science University, 6Department of Molecular & Medical Genetics,Oregon Health & Science University

Summary

본 프로토콜은 췌관 선암종(PDAC)과 정상 췌관 상피세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 당사는 렌티바이러스 준비부터 안정적인 iPSC 라인 구축에 이르기까지 최적화되고 상세한 단계별 절차를 제공합니다.

Abstract

전사 인자를 사용한 유도만능줄기세포(iPSC)의 생성은 거의 모든 분화된 세포 유형에서 이루어졌으며 연구 및 임상 응용 분야에서 매우 가치 있는 것으로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 췌관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)과 같은 암세포의 iPSC 재프로그래밍은 침습성 PDAC 표현형을 되돌리고 암 후성유전체를 무시하는 것으로 나타났습니다. PDAC 유래 iPSC의 분화는 초기 췌장 상피내 종양(PanIN) 전구체에서 PDAC 진행을 재현하여 PDAC 진행 초기에 발생하는 분자 및 세포 변화를 밝힐 수 있습니다. 따라서 PDAC에서 파생된 iPSC는 조기 검출 진단 마커를 발견하기 위해 PDAC의 초기 단계를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 초기 PanIN 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문에 일반적으로 후기 전이성 단계에서 진단되는 PDAC 환자에게 특히 중요합니다. 그러나 PDAC를 포함한 암 세포주를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 여전히 어렵고 노동 집약적이며 서로 다른 세포 주 간에 매우 가변적입니다. 여기서는 bicistronic 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다양한 인간 PDAC 세포주에서 iPSC를 생성하기 위한 보다 일관된 프로토콜에 대해 설명합니다. 그 결과 iPSC 라인은 안정적이며, 재프로그래밍 인자 또는 유도성 약물의 외인성 발현에 의존하지 않습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 광범위한 PDAC 유래 iPSC의 생성을 용이하게 하며, 이는 PDAC 사례를 보다 구체적이고 대표하는 초기 바이오마커를 발견하는 데 필수적입니다.

Introduction

췌관 선암(PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 중 하나이며, 질병의 무증상 특성으로 인해 조기 진단이 여전히 어렵습니다. PDAC 환자의 대다수는 매우 제한된 치료 옵션을 이용할 수 있는 진행성 전이성 단계에서 진단됩니다 1,2. 이는 주로 혈류로 방출되는 단백질로 편리하게 검출될 수 있는 것과 같은 초기 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문입니다.

PDAC는 진행 중 매우 초기에 퍼질 수 있으며, PDAC가 췌장에 국한되어 있을 때 더 나은 예후가 암 조기 발견과 관련이 있다3. 그러나 PDAC 환자의 10분의 1 미만이 예후가 양호하여 외과적 절제가 가능하다는 진단을 받습니다. 그럼에도 불구하고 절제 가능한 종양이 있는 소수의 종양은 12개월 이내에 재발하기 쉽다4.

지난 50년 동안 수술 기법, 환자 치료 및 치료 방식에서 괄목할 만한 개선이 이루어졌다 5,6. 그러나 수술로 절제된 PDAC 환자의 5년 생존율은 17%로 거의 증가하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 이는 거의 변하지 않은 비절제 환자(0.9%)보다 여전히 양호합니다4,7. 화학 요법은 유일한 대체 PDAC 치료법입니다. 그러나 대다수의 PDAC 환자가 젬시타빈 7,8과 같은 화학요법 약물에 강한 내성을 보이기 때문에 이 옵션은 매우 제한적입니다. 엘로티닙(Erlotinib)과 같은 다른 약물은 특정 돌연변이를 가진 소수의 PDAC 환자에게만 제공되며, 이들 중 대부분은 엘로티닙 내성을 보인다9. 대부분의 PDAC 환자에서 화학요법과 관련된 부작용은 이 치료법의 또 다른 단점이다10. 최근에는 면역관문억제제(ICI)와 저분자 키나아제 억제제(SMKI)가 PDAC 치료에 효과적일 수 있다는 유망한 전략이 제시되었지만, 이러한 표적 치료제에 대한 지속적인 반응은 여전히 소수의 환자로 제한되어 있다11,12. 전반적으로, PDAC 특이적 초기 바이오마커의 발견은 조기 진단 및 치료를 위한 새로운 길을 열 수 있습니다.

PDAC는 비침습적 췌관 상피 증식(non-invasive pancreatic tulatial epithelial proliferations)으로 인한 췌장 상피내 신생물(panIN) 전구체 병변에서 발생한다13,14. PanIN의 형성은 KRAS와 같은 종양유전자 돌연변이에 의해 시작되지만, PDAC로 진행되기 위해서는 추가적인 유전적 및 후성유전학적 변형이 필요합니다. PanIN이 여러 단계를 거쳐 침습적 PDAC로 진행되는 데는 약 10년이 걸릴 것으로 예상됩니다 13,15,16,17. 이 기간은 조기 PDAC 진단의 이점을 누릴 수 있는 좋은 기회를 제공합니다. 따라서 PDAC 진행을 연구하기 위해 종양 이종이식 동물 모델 및 오가노이드 배양을 확립하기 위한 광범위한 연구가 수행되었습니다 18,19,20,21. 이러한 모델은 PDAC의 침습 단계를 연구하는 데 매우 유용하지만 초기 PanIN 단계로부터의 전환은 아닙니다. 따라서 조기 검출 바이오마커를 발견할 수 있도록 PanIN 단계의 초기 진행을 재현할 수 있는 실험 모델을 개발하는 것이 중요합니다.

4개의 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC(OSKM)를 사용하여 체세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 것은 세포 가소성의 정도를 보여줍니다22. 암세포 가소성은 잘 문서화되어 있으며, 인간 암세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 것은 세포를 원래의 세포 상태로 재설정하는 데 성공적으로 사용되어 암 진행 중에 축적된 많은 후성유전학적 모욕을 제거했습니다 23,24,25,26,27,28,29. 따라서 암세포 정체성을 조작하기 위해 이 재프로그래밍 전략을 사용할 수 있는 가능성은 암 치료에 큰 가능성을 제시했다30,31. 실제로, PDAC에서 유래한 iPSC의 분화가 초기 PanIN 단계(32)를 통해 PDAC 진행을 재현할 수 있음을 이전에 보여주었습니다. PDAC의 초기에서 중간 단계에 특이적인 유전자 및 경로를 식별함으로써 조기 PDAC 진단에 임상적으로 사용할 수 있는 후보 바이오마커를 식별했습니다32,33. 그러나, 단일 iPSC 라인을 사용하여 발견된 바이오마커는 PDAC 환자의 대다수에서 제한된 커버리지를 보였다32. 다른 PDAC 환자로부터 iPSC 세포주를 생성하는 데 따르는 어려움으로 인해 보다 신뢰할 수 있는 바이오마커를 발견하는 능력이 중단되었습니다. 이는 OSKM 전달의 이질성을 포함한 많은 기술적 요인 때문인데, 인간 1차 PDAC 세포의 극히 일부만이 4가지 요인을 모두 포함하고 재프로그래밍에 성공적으로 반응했기 때문입니다. 여기에서는 OSKM의 보다 효율적이고 일관된 이중 렌티바이러스 전달을 사용하여 1차 PDAC 세포를 재프로그래밍하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Protocol

모든 실험 프로토콜은 OHSU Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. PDX 종양에 대한 모든 동물 실험은 OHSU IACUC(Institutional Animal Use and Care Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 프로토콜은 선암이 있는 61세 여성 환자의 췌장 조직에서 분리된 상피 형태를 나타내는 환자 유래 이종이식(PDX)의 일차 PDAC 세포주, 정상 인간 췌관 상피에서 유…

Representative Results

PDAC, BXPc3, H6C7 및 hFib 세포에서 유래한 iPSC 콜로니의 형태를 보여주는 대표적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. PDAC-iPSC 콜로니는 재프로그래밍의 25일째에 형성되기 시작했다. 보다 확립된 ESC 유사 형태를 가진 견고한 iPSC 콜로니는 재프로그래밍 40일째에 확인되었습니다(그림 1). 마찬가지로, BxPc3-iPSC의 형성은 23일째에 시작되…

Discussion

암 진행을 연구하기 위한 iPSC 재프로그래밍의 사용을 용이하게 하기 위해 췌장암 세포를 재프로그래밍하기 위한 강력한 프로토콜이 확립되었습니다. 암세포를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 지금까지 매우 어려운 것으로 입증되었는데, 이는 암세포로부터 iPSC를 성공적으로 생성한 연구가 소수에 불과하기 때문이다 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.S와 J.K는 자금 지원을 해주신 Cancer Research UK와 OHSU에 감사의 뜻을 전합니다(CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S는 MRC 경력 개발 상(MR/N024028/1)의 지원을 받습니다. AA는 박사 장학금(장학금 참조 1078107040)으로 자금을 지원합니다. JK는 MRF New Investigator Grant(GCNCR1042A)와 Knight CEDAR Grant(68182-933-000, 68182-939-000)의 자금 지원을 받습니다. 재프로그래밍 벡터 pSIN4-EF1a-O2S 및 pSIN4-CMV-K2M을 제공해 주신 Keisuke Kaji 교수님께 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다.

Materials

2-Mercaptoethanol (50 mM) Thermo Fisher 31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R BioLegend 330613
Bovine Pituitary Extract (BPE) Thermo Fisher 13028014
BxPc3 ATCC CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Merck  C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail Merck  C3867
Completed Defined K-SFM Thermo Fisher  10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates Merck  CLS3516
Corning syringe filters Merck  CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes Merck  CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets Thermo Fisher 12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) Merck  D8537
Fetal Calf Serum (FCS)  Thermo Fisher 10270-106
Fugene HD Transfection Reagent  Promega   E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O Merck  G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) Merck  G5154
Human EGF Recombinant Protein Thermo Fisher PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech Thermo Fisher 100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) Kerafast ECA001-FP
iMEF feeder cells  iXcells Biotechnologies 10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)  Thermo Fisher 17005-042
KnockOut DMEM  Thermo Fisher 10829018
KnockOut serum Replacement  Thermo Fisher 10828028
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) Merck  SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium  Thermo Fisher 31985062
pMDG  AddGene 187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)  Merck  H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M  AddGene 21164
pSIN4-EF2-O2S  AddGene 21162
psPAX2 AddGene 12260
pWPT-GFP  AddGene 12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification) Thermo Fisher A1049101
Sodym Pyruvate Thermo Fisher 11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)  Thermo Fisher 15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher 12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies 72304
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References

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Keywords: Pancreatic Ductal AdenocarcinomaInduced Pluripotent Stem CellsIPSC ReprogrammingCancer EpigenomePancreatic Intraepithelial NeoplasiaEarly-detection Diagnostic MarkersBicistronic Lentiviral VectorsPDAC-derived IPSCs
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Alshaikh, A., Grygoryev, D., Keith, D., Sheppard, B., Sears, R. C., Kim, J., Soufi, A. Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency. J. Vis. Exp. (204), e65811, doi:10.3791/65811 (2024).
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