Umprogrammierung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zur Pluripotenz
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von duktalen Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse (PDAC) und normalen duktalen Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Wir bieten ein optimiertes und detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, von der Vorbereitung des Lentivirus bis zur Etablierung stabiler iPSC-Linien.
Abstract
Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Transkriptionsfaktoren wurde aus fast jedem differenzierten Zelltyp erreicht und hat sich für Forschung und klinische Anwendungen als sehr wertvoll erwiesen. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die iPSC-Reprogrammierung von Krebszellen, wie z. B. dem duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), den invasiven PDAC-Phänotyp umkehrt und das Krebsepigenom außer Kraft setzt. Die Differenzierung von PDAC-abgeleiteten iPSCs kann die PDAC-Progression von ihrem frühen Pankreas-Intraepithelneoplasie-Vorläufer (PanIN) rekapitulieren und die molekularen und zellulären Veränderungen aufdecken, die früh während der PDAC-Progression auftreten. Daher können PDAC-abgeleitete iPSCs verwendet werden, um die frühesten Stadien von PDAC für die Entdeckung von diagnostischen Markern für die Früherkennung zu modellieren. Dies ist besonders wichtig für PDAC-Patienten, die in der Regel in den späten metastasierenden Stadien diagnostiziert werden, da es an zuverlässigen Biomarkern für die früheren PanIN-Stadien mangelt. Die Reprogrammierung von Krebszelllinien, einschließlich PDAC, in Pluripotenz bleibt jedoch eine Herausforderung, arbeitsintensiv und variiert stark zwischen verschiedenen Linien. Hier beschreiben wir ein konsistenteres Protokoll zur Erzeugung von iPSCs aus verschiedenen humanen PDAC-Zelllinien unter Verwendung von bicistronischen lentiviralen Vektoren. Die resultierenden iPSC-Linien sind stabil und zeigen keine Abhängigkeit von der exogenen Expression von Reprogrammierungsfaktoren oder induzierbaren Medikamenten. Insgesamt erleichtert dieses Protokoll die Generierung einer breiten Palette von PDAC-abgeleiteten iPSCs, was für die Entdeckung früher Biomarker, die spezifischer und repräsentativer für PDAC-Fälle sind, unerlässlich ist.
Introduction
Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der tödlichsten Malignome, und eine frühzeitige Diagnose bleibt aufgrund der asymptomatischen Natur der Krankheit eine Herausforderung. Die Mehrheit der PDAC-Patienten wird im fortgeschrittenen metastasierenden Stadium diagnostiziert, wenn nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen 1,2. Dies ist hauptsächlich auf den Mangel an zuverlässigen Biomarkern für die früheren Stadien zurückzuführen, z. B. solche, die bequem als Proteine nachgewiesen werden könnten, die in den Blutkreislauf freigesetzt werden.
PDAC kann sich sehr früh während seines Fortschreitens ausbreiten, und eine bessere Prognose wurde mit der Krebsfrüherkennung in Verbindung gebracht, wenn PDAC in der Bauchspeicheldrüse lokalisiert ist3. Bei weniger als einem Zehntel der PDAC-Patienten wird jedoch eine günstige Prognose diagnostiziert, die eine chirurgische Resektion ermöglicht. Nichtsdestotrotz sind die wenigen mit resezierbaren Tumoren auch anfällig für ein Wiederauftreten des Tumors innerhalb von 12 Monaten4.
In den letzten fünf Jahrzehnten wurden bemerkenswerte Verbesserungen bei den Operationstechniken, der Patientenversorgung und den Behandlungsmodalitäten erzielt 5,6. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei chirurgisch resezierten PDAC-Patienten ist jedoch kaum auf 17% gestiegen. Dies ist jedoch immer noch besser als bei nicht resezierten Patienten, die nahezu unverändert geblieben sind (0,9 %)4,7. Die Chemotherapie ist die einzige andere alternative PDAC-Behandlung. Diese Option ist jedoch sehr begrenzt, da die große Mehrheit der PDAC-Patienten eine starke Resistenz gegen Chemotherapeutika wie Gemcitabinaufweist 7,8. Andere Medikamente, wie Erlotinib, stehen nur einer kleinen Gruppe von PDAC-Patienten mit spezifischen Mutationen zur Verfügung, von denen die meisten eine Erlotinib-Resistenz aufweisen9. Die unerwünschten Nebenwirkungen, die mit der Chemotherapie bei den meisten PDAC-Patienten verbunden sind, sind ein weiterer Nachteil dieser Behandlung10. In jüngster Zeit haben vielversprechende Strategien gezeigt, dass Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) und niedermolekulare Kinase-Inhibitoren (SMKIs) bei der Behandlung von PDAC wirksam sein können, aber ein dauerhaftes Ansprechen auf diese zielgerichteten Therapien bleibt auf eine Minderheit der Patienten beschränkt11,12. Insgesamt kann die Entdeckung von PDAC-spezifischen frühen Biomarkern neue Wege für eine frühzeitige Diagnose und Behandlung ebnen.
PDAC entwickelt sich aus Vorläuferläsionen von intraepithelialen Pankreasneoplasien (PanIN), die aus nicht-invasiven Epithelproliferationen des Pankreasgangs resultieren13,14. Während die Bildung von PanIN durch Onkogenmutationen wie KRAS initiiert wird, sind für die Progression zu PDAC zusätzliche genetische und epigenetische Veränderungen erforderlich. Es wurde prognostiziert, dass das Fortschreiten von PanIN durch die verschiedenen Stadien in die invasive PDAC etwa 10 Jahre dauert 13,15,16,17. Dieser Zeitrahmen bietet eine großartige Gelegenheit, von einer frühen PDAC-Diagnose zu profitieren. Daher wurden umfangreiche Forschungen durchgeführt, um Tumor-Xenotransplantat-Tiermodelle und Organoidkulturen zur Untersuchung der PDAC-Progression zu etablieren 18,19,20,21. Diese Modelle waren sehr nützlich für die Untersuchung der invasiven Stadien der PDAC, wenn auch nicht für den Übergang von den frühen PanIN-Phasen. Es ist daher wichtig, experimentelle Modelle zu entwickeln, die den frühen Verlauf von PanIN-Stadien rekapitulieren können, um die Entdeckung von Biomarkern zur Früherkennung zu ermöglichen.
Die Reprogrammierung somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung der vier Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC (OSKM) hat das Ausmaß der zellulären Plastizität veranschaulicht22. Die Plastizität von Krebszellen ist gut dokumentiert, und die Reprogrammierung menschlicher Krebszellen in iPSCs wurde erfolgreich eingesetzt, um Zellen in ihren ursprünglichen zellulären Zustand zurückzusetzen und viele der epigenetischen Beleidigungen zu entfernen, die sich während des Fortschreitens der Krebserkrankung angesammelt haben 23,24,25,26,27,28,29. Die Möglichkeit, diese Reprogrammierungsstrategie zur Manipulation der Krebszellidentität zu nutzen, ist daher bei der Behandlung von Krebs vielversprechend30,31. In der Tat haben wir bereits gezeigt, dass die Differenzierung von iPSCs, die von PDACs abgeleitet sind, die PDAC-Progression durch die frühen PanIN-Stadien rekapitulieren kann32. Durch die Identifizierung von Genen und Signalwegen, die für die frühen bis mittleren Stadien der PDAC spezifisch sind, wurden Kandidaten-Biomarker identifiziert, die klinisch für die frühe PDAC-Diagnose verwendet werden können32,33. Die Biomarker, die mit einer einzigen iPSC-Linie entdeckt wurden, zeigten jedoch bei der Mehrheit der PDAC-Patienten eine begrenzte Abdeckung32. Die Herausforderungen bei der Generierung von iPSC-Linien von anderen PDAC-Patienten haben die Entdeckung zuverlässigerer Biomarker verhindert. Dies ist auf viele technische Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Heterogenität der OSKM-Verabreichung, da nur ein kleiner Teil der menschlichen primären PDAC-Zellen alle vier Faktoren enthielt und erfolgreich auf die Reprogrammierung reagierte. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Reprogrammierung primärer PDAC-Zellen unter Verwendung einer effizienteren und konsistenteren dualen lentiviralen Verabreichung von OSKM vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die Verwendung der iPSC-Reprogrammierung zur Untersuchung des Krebsverlaufs zu erleichtern, wurde ein robustes Protokoll für die Reprogrammierung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen entwickelt. Die Reprogrammierung von Krebszellen in Pluripotenz hat sich bisher als sehr schwierig erwiesen, da nur wenige Studien erfolgreich iPSCs aus Krebszellen erzeugt haben 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. und J.K. danken Cancer Research UK und OHSU für die Finanzierung (CRUK-OHSU-Projektpreis C65925/A26986). A.S. wird durch einen MRC-Karriereentwicklungspreis (MR/N024028/1) unterstützt. A.A. wird durch ein Ph.D.-Stipendium (Scholarship Ref. 1078107040) der King Abdulaziz City for Science and Technology finanziert. J.K. wird durch den MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) und den Knight CEDAR Grant (68182-933-000, 68182-939-000) finanziert. Wir danken Prof. Keisuke Kaji für die freundliche Bereitstellung der Reprogrammierungsvektoren pSIN4-EF1a-O2S und pSIN4-CMV-K2M. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
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