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Bioengineering

फेज के लिए एक व्यावहारिक गाइड- और रोबोटिक्स-असिस्टेड निकट-निरंतर विकास

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65974
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1The Francis Crick Institute, 2Massachusetts Institute of Technology, 3Future House

Summary

फेज- और रोबोटिक्स-असिस्टेड नियर-कंटीन्यूअस इवोल्यूशन (PRANCE) तेजी से, मजबूत प्रोटीन विकास के लिए एक तकनीक है। रोबोटिक्स प्रयोगों के समानांतरकरण, वास्तविक समय की निगरानी और प्रतिक्रिया नियंत्रण की अनुमति देता है।

Abstract

रोबोटिक्स-त्वरित विकास तकनीक प्रतिक्रिया नियंत्रण का उपयोग करके विकास की विश्वसनीयता और गति में सुधार करती है, प्रोटीन और जीव विकास प्रयोगों के परिणामों में सुधार करती है। इस लेख में, हम फेज- और रोबोटिक्स-असिस्टेड निकट-निरंतर विकास (PRANCE) को लागू करने के लिए आवश्यक हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर स्थापित करने के लिए एक मार्गदर्शिका प्रस्तुत करते हैं। PRANCE एक साथ सैकड़ों स्वतंत्र, प्रतिक्रिया-नियंत्रित विकास प्रयोगों को चलाने की क्षमता के साथ तेजी से फेज-आधारित आणविक विकास को जोड़ती है। यह पेपर PRANCE के लिए हार्डवेयर आवश्यकताओं और सेटअप का वर्णन करेगा, जिसमें एक तरल-हैंडलिंग उपकरण, एक प्लेट रीडर, सहायक पंप, हीटर और 3D-मुद्रित कंटेनर शामिल हैं। हम वर्णन करते हैं कि पायथन-आधारित ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर के साथ संगत होने के लिए तरल हैंडलिंग रोबोट को कैसे कॉन्फ़िगर किया जाए। अंत में, हम पहले दो प्रयोगों के लिए सुझाव प्रदान करते हैं जो एक नवनिर्मित PRANCE प्रणाली के साथ आयोजित किए जा सकते हैं जो अपनी क्षमताओं का प्रयोग करता है और मान्य करता है कि सिस्टम मल्टीप्लेक्स विकास का संचालन करने के लिए तैयार है। इस गाइड का उद्देश्य रोबोटिक्स-त्वरित विकास के संचालन से जुड़े काफी उपकरण सेटअप को नेविगेट करने के लिए एक पुस्तिका के रूप में सेवा करना है।

Introduction

PRANCE दो शक्तिशाली निर्देशित विकास तकनीकों का एक संयोजन है। पहला पेस1 है, एक आणविक तकनीक जो एम 13 बैक्टीरियोफेज के तेज जीवन चक्र के लिए जीन विविधीकरण और चयन के दौर को जोड़ती है, जिससे तरल फेज संस्कृति में लगातार विकास के तेजी से दौर होते हैं। यह चयन एक प्लास्मिड-एन्कोडेड जीन सर्किट के उपयोग से प्रेरित है जो विकसित प्रोटीन के कार्य को pIII, M13 के टेल कोट प्रोटीन की अभिव्यक्ति से जोड़ता है, जो फेज प्रसार के लिए आवश्यक है, यह चित्र 1में चित्रित किया गया है। प्रयोगात्मक स्तर पर, तरल फेज संस्कृति के निरंतर कमजोर पड़ने निरंतर चयन के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार चयन कठोरता को जीन सर्किट के स्तर पर और साथ ही फेज संस्कृति कमजोर पड़ने की दर को नियंत्रित करके प्रयोगात्मक स्तर पर संशोधित किया जा सकता है। इसलिए पीएसीई को किसी भी बायोमोलेक्यूल इंजीनियरिंग चुनौती पर लागू किया जा सकता है जिसके लिए एक आणविक सेंसर है जो पी III अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए ई कोलाई बैक्टीरिया में वांछित गतिविधि का पता लगा सकता है। अनुप्रयोगों में प्रोटीन-प्रोटीन बाध्यकारी 2,3,4, प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी5, प्रोटीन घुलनशीलता6, और कई विशिष्ट एंजाइमेटिककार्यों 7 का विकास शामिल है। दूसरा रोबोटिक्स-त्वरित विकास 8,9 है, जो निर्देशित विकास के दो सामान्य विफलता मोड को खत्म करने के लिए एक प्रतिक्रिया नियंत्रक का उपयोग करता है: विलुप्त होने, जो तब होता है जब पर्यावरण बहुत कठोर होता है, और विकास की कमी, जो तब होती है जब पर्यावरण बहुत उदार होता है। PANCE (फेज-असिस्टेड नॉन-कंटीन्यूअस इवोल्यूशन)7,10में किए गए फेज के सीरियल पासिंग के विपरीत, रोबोटिक्स-त्वरित "निकट-निरंतर" विकास में तेजी से पाइपिंग शामिल है जो मध्य-लॉग चरण में संस्कृतियों को बनाए रखता है, जिससे आबादी को संक्रमण और प्रसार के निरंतर चक्रों का अनुभव करने की अनुमति मिलती है। जब इन दोनों तकनीकों का एक साथ उपयोग किया जाता है, तो उन्हें फेज और रोबोटिक्स-असिस्टेड निकट-निरंतर विकास8 के लिए PRANCE के रूप में संदर्भित किया जाता है, जो मजबूत, मल्टीप्लेक्स और तेजी से निरंतर विकास को सक्षम बनाता है। PRANCE पोलीमरेज़, tRNAs, और एमिनो-एसाइल tRNA सिंथेटेस विकसित करने के लिए और उनकी गति और विश्वसनीयता 8 में सुधार करने के लिए उन विकासों के दौरान प्रतिक्रिया नियंत्रण करने के लिए इस्तेमाल किया गयाहै.

PRANCE के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर सेटअप के कई विवरण हैं जो तरल-हैंडलिंग रोबोट पर बैक्टीरियोफेज के उपयोग को सक्षम करते हैं। रोबोट निर्माता द्वारा प्रदान किए गए डिफ़ॉल्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के बजाय, हम एक पायथन-आधारित ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर पैकेज11 का उपयोग करते हैं, जो तेज, समवर्ती निष्पादन को सक्षम बनाता है और इस प्रकार, मध्य-लॉग चरण में अर्ध-निरंतर बायोरिएक्टर रखने की क्षमता। शोधकर्ता हैंड्स-ऑफ समय को कई ऑन-डेक घटकों को नियमित रूप से आत्म-बाँझ करके कई दिनों तक बढ़ाया जा सकता है, और यह पंपों के स्वचालित नियंत्रण के साथ प्राप्त किया जाता है जो इन घटकों को ब्लीच और कुल्ला कर सकते हैं। फेज क्रॉस-संदूषण को तरल हैंडलिंग रोबोट के उपयोग से समाप्त किया जा सकता है जो बल-फिट युक्तियों और तरल हैंडलिंग सेटिंग्स के सावधानीपूर्वक समायोजन का उपयोग नहीं करता है।

Protocol

1. हार्डवेयर सेटअप

नोट: PRANCE सिस्टम के हार्डवेयर घटकों के अवलोकन के लिए चित्र 2 और भौतिक रूप से इकट्ठे इन घटकों की तस्वीरों के लिए चित्र 3 देखें।

  1. PRANCE प्रणाली के लिए प्राथमिक हार्डवेयर प्राप्त करें, जिसमें एक तरल हैंडलिंग उपकरण, एक प्लेट रीडर और सहायक पंप शामिल हैं।
    नोट: आज तक के सभी PRANCE सिस्टम को मध्यम से बड़े तरल हैंडलिंग उपकरणों पर लागू किया गया है जो 8-चैनल, व्यक्तिगत रूप से पता करने योग्य पाइपिंग आर्म्स, सिंगल-पिस्टन 96-टिप पाइपिंग आर्म, मूविंग प्लेटों के लिए रोबोटिक ग्रिपर, टिप नसबंदी के लिए एक एकीकृत वॉश स्टेशन, और अवशोषण और ल्यूमिनेसेंस माप में सक्षम एक एकीकृत प्लेट रीडर से लैस हैं।
  2. तरल-हैंडलिंग रोबोट के मॉडल और विशेषताओं के आधार पर हीटिंग रणनीतियों को कॉन्फ़िगर करें। एक गर्म प्लेट वाहक या हीटर-मध्यस्थता रोबोट जलवायु नियंत्रण का उपयोग करें।
  3. टिप पुन: उपयोग की अनुमति देने के लिए एक टिप-वॉश स्टेशन स्थापित करें।
    नोट: आज तक, PRANCE सिस्टम ने ऑफ-द-शेल्फ वॉश स्टेशनों का उपयोग किया है, हालांकि, सिद्धांत रूप में, इस घटक को आसानी से कम लागत वाले घटकों से बनाया जा सकता है।
  4. एक केमोस्टैट/टर्बिडोस्टेट के रूप में 37 डिग्री सेल्सियस पर चलने वाले वास्तविक समय बायोरिएक्टर की स्थापना करके लॉग-चरण में बनाए रखा जीवाणु संस्कृति का एक स्रोत स्थापित करें। वैकल्पिक रूप से, पास के रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर लॉग-चरण (0.25 और 0.45 के बीच आयुध डिपो600 ) में 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 एल मात्रा पूर्व उगाए गए लॉग-चरण जीवाणु संस्कृति को गिरफ्तार करें। सुनिश्चित करें कि संस्कृति, चाहे ठंडा या गर्म, तलछट को रोकने के लिए एक प्रकार के बरतन प्लेट या हलचल प्लेट का उपयोग करके नियमित रूप से उभारा जाता है।
  5. आवश्यक सॉफ्टवेयर और ड्राइवरों के साथ रोबोट एकीकरण के लिए पसंदीदा पंप कॉन्फ़िगर करें। पंपों को 10-100 एमएल के आदेश पर तरल की परिभाषित मात्रा वितरित करने में सक्षम बनाने के लिए सॉफ्टवेयर को लागू करें।
    नोट: इस कार्यान्वयन में उपयोग किए जाने वाले पंपों के लिए सामग्री की तालिका और इन पंपों को संचालित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर के लिए निर्माता की वेबसाइट और उन्हें कॉन्फ़िगर करने के तरीके पर दस्तावेज़ीकरण देखें। इस पांडुलिपि में सचित्र PRANCE सेटअप में उपयोग किए जाने वाले पंपों के लिए इस तरह के सॉफ़्टवेयर को निम्नलिखित GitHub रिपॉजिटरी में खुला स्रोत प्रदान किया गया है https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE को कम से कम तीन-पंप मैनिफोल्ड की आवश्यकता होती है जो तीन अलग-अलग चैनलों को पंप करने में सक्षम होता है (बैक्टीरिया को बैक्टीरिया जलाशय तक पहुंचाते हैं, ब्लीच को बैक्टीरिया जलाशय तक पहुंचाते हैं, और बैक्टीरिया के जलाशय को कचरे में निकालते हैं), प्रत्येक कैलिब्रेटेड और स्वतंत्र रूप से नियंत्रित की गति के साथ। अतीत में, लोगों ने मछली टैंक पंप और हाइड्रोपोनिक्स पंप सरणियों का उपयोग किया है, हालांकि, सिद्धांत रूप में, किसी भी अजगर-नियंत्रणीय क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग किया जा सकता है। आवश्यक कार्यों में रीडर के अंदर या बाहर प्लेटों को स्थानांतरित करने, प्लेट रीडर माप शुरू करने और माप तक पहुंचने के लिए रोबोट ग्रिपर का उपयोग करने की क्षमता शामिल है।
  6. 3D-PRANCE सिस्टम के लिए आवश्यक कस्टम डेक घटकों को प्रिंट करें, जिसमें कम से कम, बैक्टीरियल जलाशय/वितरण कई गुना ("वफ़ल") शामिल है, जैसा कि पूरक फ़ाइल 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link) में पाया गया है। इन कंटेनरों को डेक पर सुरक्षित करें और मानक लिक्विड हैंडलिंग रोबोट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उनकी स्थिति को कैलिब्रेट करें। जलाशय को पंप सरणी से कनेक्ट करें।
    नोट: अंशांकन कैसे करें इसके विवरण के लिए रोबोट निर्माता के दस्तावेज़ से परामर्श करें क्योंकि यह रोबोट-निर्भर होगा। राल-आधारित 3 डी प्रिंटर सबसे उपयुक्त हैं; उपयोग किए गए प्रिंटर प्रकार का एक उदाहरण सामग्री की तालिका में दिया गया है; मानक स्पष्ट राल डिफ़ॉल्ट प्रिंटर सेटिंग्स के साथ प्रयोग किया गया था.
  7. सिस्टम को स्थानीय जैव सुरक्षा सिफारिशों के अनुकूल नाली से लैस करें।
  8. चित्र 4 में उदाहरण के रूप में तरल हैंडलिंग रोबोट के डेक पर लैबवेयर रखें।
  9. मानक प्रयोगशाला व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (यानी, लैब कोट, दस्ताने और आंखों की सुरक्षा) के उपयोग सहित मानक सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें।

2. सॉफ्टवेयर की तैयारी

  1. ओपन-सोर्स PyHamilton रिपॉजिटरी से उपलब्ध पायथन11 के साथ लिक्विड हैंडलिंग रोबोट को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर स्थापित करें। https://github.com/dgretton/pyhamilton
  2. लिक्विड हैंडलिंग रोबोट सॉफ़्टवेयर के लिए डेक लेआउट फ़ाइल को संशोधित और कैलिब्रेट करें ताकि रोबोट डेक पर लैबवेयर की स्थिति को सटीक रूप से प्रतिबिंबित किया जा सके, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है।
    नोट: यहां उपयोग किया जाने वाला सेटअप प्रदान किए गए दस्तावेज के अनुसार, तरल हैंडलिंग रोबोट के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है।
  3. PRANCE रोबोट विधि प्रोग्राम को सिमुलेशन मोड में चलाएँ।
    1. निम्न कमांड (विंडोज ऑपरेटिंग सिस्टम में) के साथ कमांड लाइन खोलें, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है।
      विंडोज कुंजी + आर
      दर्ज करें: cmd
    2. मूल निर्देशिका को रोबोट विधि प्रोग्राम की निर्देशिका में बदलें। सही पथ के साथ नीचे के रूप में एक कमांड दर्ज करें, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है।
      सीडी सी:\Robot_methods_directory\PRANCE
    3. सिमुलेशन मोड ध्वज के साथ पायथन के साथ रोबोट विधि प्रोग्राम को कॉल करें, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है।
      py robot_method.py --अनुकरण करें
    4. रोबोट रन कंट्रोल विंडो के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें जो प्रोग्राम निष्पादित होने पर खुलेगा (चित्र 5)।
      नोट: सुनिश्चित करें कि PRANCE विधि आगे बढ़ने से पहले सिमुलेशन में त्रुटियों के बिना चल सकती है। यह स्पष्ट हो जाता है कि स्क्रिप्ट त्रुटियों के बिना सिमुलेशन मोड में काम करने में सक्षम है, क्योंकि यह सिस्टम की त्रुटि हैंडलिंग के बिना मुख्य प्रोग्राम के कई छोरों को पूरा करेगा, जो मुख्य प्रोग्राम लूप को समाप्त करता है।
  4. PRANCE रोबोट विधि प्रोग्राम को सिमुलेशन मोड अक्षम के साथ चलाएँ।
    1. उपयुक्त निर्देशिका (चित्रा 5) में कमांड लाइन खोलें।
      विंडोज कुंजी + आर
      दर्ज करें: cmd
      सीडी सी:\Robot_methods_directory\PRANCE
    2. झंडे के बिना पायथन के साथ रोबोट विधि कार्यक्रम को कॉल करें:
      पीवाई robot_method.py
    3. रोबोट रन कंट्रोल विंडो के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें जो प्रोग्राम निष्पादित होने पर खुलेगा।
    4. पुष्टि करें कि PyHamilton उपकरण को नियंत्रित कर सकता है और इसे प्रारंभ करने का कारण बन सकता है।
  5. रीयल-टाइम डेटा सिंक्रनाइज़ेशन स्थापित करें।
    नोट: आज तक, PRANCE सिस्टम ने नेटवर्क वाले कंप्यूटरों का उपयोग किया है जो उपयोगकर्ताओं को दूरस्थ फ़ाइल-साझाकरण सॉफ़्टवेयर के माध्यम से या दूरस्थ डेस्कटॉप के माध्यम से लॉग फ़ाइलों और रीयल-टाइम प्लेट रीडर माप ग्राफ़ की निगरानी करने की अनुमति देता है।
  6. स्वचालित अपडेट बंद करें.

3. रन से पहले की तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि लॉग-चरण जीवाणु संस्कृति स्रोत नियोजित रन के लिए आवश्यक सभी संस्कृतियों के लिए उपलब्ध हैं और अवसादन को रोकने के लिए उन्हें सक्रिय रूप से उभारा जा रहा है। एक सक्रिय केमोस्टैट/टर्बिडोस्टेट या एक विकास-गिरफ्तार प्रशीतित पूर्ववर्धित संस्कृति का उपयोग करें।
  2. किस मात्रा (रेंज 0-500 माइक्रोन) के विवरण के साथ नियंत्रक मैनिफेस्ट फ़ाइल को अपडेट करें, जिसमें बैक्टीरियल कल्चर को 96-वेल लैगून प्रति प्रोग्राम चक्र के प्रत्येक कुएं में पंप किया जाना है। यह प्रभावी लैगून कमजोर पड़ने की दर के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है। यह चित्रा 6 में देखा जा सकता है.
    1. चित्रा 7 में देखा के रूप में DilutionCalculator.xlsx स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल 2 के रूप में प्रदान की गई) का उपयोग लैगून की कमजोर पड़ने दर की गणना.
  3. इच्छित लैगून ऊंचाई के साथ robot_method.py फ़ाइल को अपडेट करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, प्रोग्राम में चर fixed_lagoon_height के लिए डिफ़ॉल्ट मान के रूप में 14 (मिलीमीटर इकाइयों में) का उपयोग करें। यह सिस्टम पर 550 माइक्रोन की लैगून मात्रा से मेल खाती है, लेकिन उपयोग की जाने वाली विशेष 96-गहरी-अच्छी प्लेट के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  4. उनके निर्दिष्ट पदों में रोबोट डेक पर साफ फ़िल्टर्ड विंदुक युक्तियाँ रखें और टिप धारकों को टिप रैक टेप चलाने के दौरान स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए.
  5. रोबोट डेक पर साफ 96-गहरी-अच्छी प्लेटें उनके निर्दिष्ट पदों पर रखें।
  6. उनके निर्दिष्ट पदों में रोबोट डेक पर साफ 96 अच्छी तरह से पाठक प्लेटें रखें.
  7. सुनिश्चित करें कि प्लेट रीडर ट्रे पर पहले से मौजूद प्लेट का कब्जा नहीं है।
  8. सुनिश्चित करें कि पंप कंप्यूटर से जुड़े हैं और सही पते पर सौंपे गए हैं।
  9. पंप को सक्रिय करके पंप लाइनों को साफ करें ताकि पंप को ब्लीच और फिर पानी पंप किया जा सके।
  10. पंप लाइनों को उपयुक्त स्रोतों और आउटपुट से कनेक्ट करें, यह सुनिश्चित करने के लिए पूरा ध्यान दें कि सही लाइनें प्रासंगिक जीवाणु संस्कृतियों से जुड़ी हैं।
  11. बैक्टीरियल जलाशय और विंदुक टिप धोने के लिए ब्लीच/पानी युक्त रिफिल टैंक/बाल्टी।
  12. सुनिश्चित करें कि सभी ऑन-डेक घटक, विशेष रूप से मोबाइल तत्व, अपने निर्दिष्ट पदों में स्थिर हैं।
  13. तापमान को लक्षित करने के लिए स्थानीय कार्यान्वयन के अनुसार हीटर सक्रिय करें (यानी 37 डिग्री सेल्सियस; चित्रा 8)।
  14. निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए तरल-हैंडलिंग रोबोट में अंतर्निहित यूवी नसबंदी दीपक को संचालित करने के लिए 10 मिनट के लिए यूवी नसबंदी प्रोटोकॉल फ़ाइल चलाएं (चित्र 9)।
    1. रोबोट रन कंट्रोल विंडो के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें जो प्रोग्राम निष्पादित होने पर खुलेगा।
    2. 600 s के लिए पैरामेट्रिज्ड विकल्प के साथ फ़ाइल चलाएँ।
  15. सुनिश्चित करें कि रोबोट रन कंट्रोल सॉफ्टवेयर बंद है।
    नोट: रोबोट विधि प्रोग्राम क्रैश हो जाएगा यदि रन कंट्रोल सॉफ़्टवेयर के कोई मौजूदा इंस्टेंस चल रहे हैं।

4. हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर एकीकरण

  1. एक 'वाटर रन' का संचालन करें, जहां PRANCE रोबोट विधि कार्यक्रम सभी संस्कृतियों और गीले अभिकर्मकों के लिए पानी के प्रतिस्थापन के साथ रात भर चलाया जाता है।
    नोट: यह परीक्षण कमरे के तापमान पर चलाया जा सकता है।
    1. controller_manifest के साथ ऊपर दिए गए अनुसार प्री-रन तैयारी पूरी करें और 1 वॉल्यूम/घंटा की प्रभावी लैगून कमजोर पड़ने की दर के लिए स्थापित robot_method जैसा कि चित्र 5 और चित्रा 6में दिखाया गया है।
    2. पानी चलाने के लिए लॉग-फेज बैक्टीरिया को बदलने के लिए 'बैक्टीरिया इन' लाइन को पानी के कंटेनर से कनेक्ट करें।
      नोट: प्रयोग के माध्यम से तरल आंदोलन को ट्रैक करने के लिए खाद्य रंग जल स्रोतों में जोड़ा जा सकता है।
    3. उपयुक्त निर्देशिका में कमांड लाइन खोलें।
    4. नए रन फ्लैग (py robot_method.py --new) के साथ पायथन के साथ रोबोट विधि प्रोग्राम को कॉल करें और लॉग फ़ाइल नाम (टेस्टरन), लैगून कुओं की संख्या (16), चक्र अवधि (30), प्रति पाठक प्लेट माप (4) चक्रों की संख्या, और इंड्यूसर वॉल्यूम (इंड्यूसर वॉल्यूम 0 है) सहित अनुरोधित तर्कों को इनपुट करेंइस परीक्षण चलाने के लिए μL, एक विकास के दौरान जहां उत्परिवर्तन अरबी के साथ प्रेरित होता है, यह मान 10 μL हो सकता है), जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है।
    5. रोबोट रन कंट्रोल विंडो के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें जो तर्क प्रदान किए जाने के बाद प्रोग्राम निष्पादित होने पर खुल जाएगा।
      नोट: PRANCE विधि को एक खाली लैगून प्लेट का उपयोग करके शुरू किया जा सकता है, और लैगून की तरल मात्रा पहले छह चक्रों में अंतिम मात्रा में संतुलित हो जाएगी।
  2. एक 'बैक्टीरिया-ओनली रन' का संचालन करें, जहां PRANCE प्रोटोकॉल केवल लक्ष्य तापमान पर बैक्टीरिया संस्कृति के साथ रात भर चलाया जाता है, लेकिन बिना बैक्टीरियोफेज के।
    1. controller_manifest के साथ ऊपर दिए गए अनुसार प्री-रन तैयारी को पूरा करें और 1 वॉल्यूम/घंटा की प्रभावी लैगून कमजोर पड़ने की दर के लिए सेट अप करें, जैसा robot_method कि चित्र 5 और चित्र 6में दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि हीटर 37 डिग्री सेल्सियस के लक्ष्य तापमान के लिए चालू हैं।
    2. लॉग-चरण बैक्टीरिया के चयनित स्रोत के लिए 'बैक्टीरिया इन' लाइन कनेक्ट करें।
    3. उपयुक्त निर्देशिका में कमांड लाइन खोलें।
    4. नए रन फ्लैग (py robot_method.py --new) के साथ पायथन के साथ रोबोट विधि प्रोग्राम को कॉल करें और अनुरोधित तर्कों को इनपुट करें, जैसा कि पहले खंड 4.1.4 में विस्तृत है।
    5. रोबोट रन कंट्रोल विंडो के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें जो तर्क प्रदान किए जाने के बाद प्रोग्राम निष्पादित होने पर खुल जाएगा।
  3. एक 'संक्रमण परीक्षण' चलाएं, जहां एक विकसित प्रोटीन वाले फेज को उस प्रोटीन की आवश्यकता वाले बैक्टीरिया पर प्रचार करने के लिए चुनौती दी जाती है।
    नोट: अग्रिम में तय करें कि कौन से लैगून को फेज के साथ टीका लगाया जाएगा और कौन से लैगून को टीका नहीं लगाया जाएगा और इस प्रकार क्रॉस-संदूषण का पता लगाने के लिए नो-फेज कंट्रोल लैगून के रूप में काम करें।
    1. controller_manifest के साथ ऊपर दिए गए विवरण के अनुसार प्री-रन तैयारी पूरी करें और 1 वॉल्यूम/घंटा की प्रभावी कमजोर पड़ने की दर के लिए सेट अप robot_method, जैसा कि चित्र 5 और चित्र 6में दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि हीटर 37 डिग्री सेल्सियस के लक्ष्य तापमान के लिए चालू हैं।
    2. लॉग-चरण बैक्टीरिया के चयनित स्रोत के लिए 'बैक्टीरिया इन' लाइन कनेक्ट करें।
    3. उपयुक्त निर्देशिका में कमांड लाइन खोलें।
    4. नए रन फ्लैग (py robot_method.py --new) के साथ पायथन के साथ रोबोट विधि प्रोग्राम को कॉल करें और अनुरोधित तर्कों को इनपुट करें जैसा कि पहले खंड 4.1.4 में विस्तृत है।
    5. रोबोट रन कंट्रोल विंडो के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें जो तर्क प्रदान किए जाने के बाद प्रोग्राम निष्पादित होने पर खुल जाएगा।
    6. बैक्टीरियोफेज जोड़ने से पहले, लैगून प्लेटों में मात्रा और बैक्टीरिया आयुध डिपो को संतुलित करने के लिए 2-3 घंटे के लिए विधि चलाएं।
    7. एक रन चक्र के अंत में बैक्टीरियोफेज के 106 पीएफयू /एमएल के साथ फेज लैगून को टीका लगाएं जब कार्यक्रम सो रहा हो (उदाहरण के लिए, 108 पीएफयू/एमएल पर फेज विभाज्य का 5.5 माइक्रोन, जैसा कि पट्टिका परख या क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया है), 550 माइक्रोन लैगून में।
    8. रात भर कार्यक्रम चलाने के लिए और फिर पट्टिका परख या qPCR द्वारा लैगून कुओं में फेज अनुमापांक की जाँच करें.

Representative Results

संक्रमण परीक्षण के परिणाम
यह परीक्षण बैक्टीरिया संस्कृति, फेज क्लोनिंग और टिटर, उपकरण की तापमान स्थिरता, तरल हैंडलिंग सेटिंग्स और प्लेट रीडर एकीकरण के साथ समस्याओं को प्रकट करेगा। एक सफल फेज संक्रमण परीक्षण फेज के साथ टीका लैगून में स्पष्ट और तेजी से फेज संक्रमण प्रकट करेगा, और नो-फेज लैगून में कोई संकेत नहीं होगा। चित्रा 10 एक फेज संक्रमण परीक्षण के कुछ प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। प्रायोगिक परिणामों की तुलना इस PRANCE पेपर8 के आंकड़े 1d और 1c से भी की जा सकती है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि "हॉट PRANCE" (एक लाइव बैक्टीरियल टर्बिडोस्टेट द्वारा खिलाया गया) या "कूल PRANCE" (ठंडा मिड-लॉग चरण संस्कृति द्वारा खिलाया गया) कॉन्फ़िगरेशन लागू किया जा रहा है। यह परीक्षण कई सामान्य मुद्दों को प्रकट कर सकता है। बैक्टीरियल कल्चर की तैयारी के मुद्दों के परिणामस्वरूप अक्सर कमजोर या अनुपस्थित संक्रमण हो सकता है। बैक्टीरिया केवल एम 13 फेज द्वारा बेहतर रूप से संक्रमित हो सकते हैं जब वे मध्य-लॉग चरण में होते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर होते हैं। अन्य तापमान और विकास के चरणों में, वे कमजोर पायलस अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं और इस प्रकार फेज संक्रमण12 के लिए कम संवेदनशील होते हैं। कम-टिटर फेज के साथ टीका लगाना, या रीढ़ की हड्डी के उत्परिवर्तन के साथ फेज के परिणामस्वरूप विलंबित या अनुपस्थित संकेत हो सकता है। प्रतिदीप्ति या luminescence के लिए प्लेट रीडर लाभ सेटिंग्स के साथ मुद्दों इस परीक्षण से पता चला जाएगा.

Figure 1
चित्रा 1: पीआरएएनएस तंत्र के संक्रमण परीक्षण चलाने के दौरान काम करने वाले आनुवंशिक सर्किट का योजनाबद्ध। जब T7 RNA पोलीमरेज़, फेज जीनोम पर एन्कोडेड होता है, तो Escherichia कोलाई होस्ट को संक्रमित करता है, इसे ट्रांसक्राइब किया जाता है और T7 प्रमोटर पर AP पर बांधता है, जिससे pIII फेज प्रोटीन और luxAB प्रोटीन का प्रतिलेखन होता है, जो बदले में, फेज प्रसार और ल्यूमिनेसेंस के उत्पादन की सुविधा प्रदान करता है। संक्षिप्ताक्षर: PRANCE = फेज- और रोबोटिक्स-असिस्टेड निकट-निरंतर विकास; एपी = गौण प्लाज्मिड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: PRANCE प्रणाली के भौतिक घटकों का एक योजनाबद्ध। एक फ्रिज हड़कंप मचाने वाली संस्कृतियों को संग्रहीत करता है, जिसे बाद में पंपों की एक सरणी द्वारा रोबोट डेक पर बैक्टीरिया के जलाशय, "वफ़ल" में ले जाया जाता है। तरल-हैंडलिंग रोबोट का उपयोग बैक्टीरिया संस्कृतियों को "वफ़ल" से पाइपिंग हेड का उपयोग करके होल्डिंग कुओं तक इनक्यूबेशन तापमान तक गर्म करने के लिए किया जाता है, और फिर लैगून में जहां मुख्य इनक्यूबेशन होता है। दोनों होल्डिंग कुओं और लैगून मानक 2 एमएल गहरी अच्छी तरह से प्लेटें हैं। रोबोट एकल-उपयोग रीडर प्लेटों में नमूने लेता है, जो बदले में माप के लिए प्लेट रीडर में ले जाया जाता है। संक्षिप्तीकरण: PRANCE = फेज- और रोबोटिक्स-असिस्टेड निकट-निरंतर विकास। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: PRANCE रोबोट उपकरण। (ए) प्रेंस सेटअप। (I) HEPA फिल्टर और बाहरी हीटर। (II) कल्चर रेफ्रिजरेटर। (III) मुख्य रोबोट संलग्नक। (IV) प्लेट रीडर (v) पंप और टैंक। (बी) रोबोट संलग्नक। (VI) मुख्य कल्चर पंप। (VII) पानी, अपशिष्ट और ब्लीच टैंक। (VIII) वॉशर पंप। (सी) रोबोट संलग्नक। (IX) रोबोट पाइपिंग आर्म और ग्रिपर। (एक्स) पिपेट टिप्स। (XI) रोबोट ("वफ़ल") पर संस्कृति वितरण की अनुमति देने के लिए 3 डी-मुद्रित घटक। (XII) प्लेट रीडर में नमूने के लिए प्लेटें। (XIII) टिप धोने के लिए बाल्टी। (XIV) "लैगून": संस्कृति के बर्तन जहां विकासवादी संवर्धन होता है। संक्षिप्ताक्षर: PRANCE = फेज- और रोबोटिक्स-असिस्टेड निकट-निरंतर विकास; HEPA = उच्च दक्षता वाली कण हवा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: डेक लेआउट। (ए) रोबोट नियंत्रण सॉफ्टवेयर में डेक लेआउट का 3 डी प्रतिनिधित्व। (बी) डेक घटकों की तस्वीर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: उदाहरण पैरामीटर (ऊपर) के साथ कमांड लाइन का स्क्रीनशॉट और नियंत्रण सॉफ्टवेयर चलाएं (नीचे)। प्ले बटन ऊपर बाईं ओर स्थित है और इसे माउस से क्लिक किया जा सकता है या स्थानीय कार्यान्वयन के आधार पर टचस्क्रीन के साथ सक्रिय किया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: परीक्षण रन के लिए कॉन्फ़िगर किए गए नियंत्रक मैनिफेस्ट फ़ाइल। संस्कृति # 0 वाले लैगून 96-गहरी-अच्छी प्लेट के कॉलम 1 और 3 में होंगे। शेष कॉलम खाली होंगे। 96-गहरी-अच्छी तरह से प्लेट की पंक्तियाँ ए, बी, डी और ई फेज (1) द्वारा संक्रमण के लिए सही कॉलम पर चिह्नित हैं, अन्य पंक्तियाँ (0) नो-फेज नियंत्रण हैं। नियंत्रक प्रकट के इस उदाहरण के परिणामस्वरूप कार्यक्रम हर चक्र में 210 माइक्रोन संस्कृति के साथ लैगून को पतला कर देगा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: कमजोर पड़ने कैलकुलेटर स्प्रेडशीट का उपयोग कर प्रभावी लैगून कमजोर पड़ने दर की गणना. कमजोर पड़ने कैलकुलेटर स्प्रेडशीट के लिए पूरक फ़ाइल 2 देखें। जैसा कि इस आंकड़े में देखा गया है, एक 550 माइक्रोन लैगून जो हर 30 मिनट चक्र में ताजा संस्कृति के 210 माइक्रोन द्वारा पतला होता है, पाठक प्लेट माप के लिए 150 माइक्रोन नमूनों के साथ हर चार चक्रों में लिया जा रहा है, 1.0 लैगून वॉल्यूम / एच की प्रभावी कमजोर पड़ने की दर के अनुरूप होगा (प्रत्येक 1 घंटे के बाद, घंटे की शुरुआत में मूल लैगून तरल का 50% रहेगा) कृपया इसका एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आकृति।

Figure 8
चित्र 8: रोबोट हीटर सिस्टम। हीटर को लाल घेरे द्वारा इंगित बिजली की आपूर्ति में प्लग करके सक्रिय किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: यूवी परिशोधन प्रोटोकॉल की सेटिंग्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्र 10: PRANCE प्रणाली पर चलने वाले संक्रमण परीक्षण का माप। रन के दौरान नमूने लिए जाते हैं और ल्यूमिनेसेंस और अवशोषण के माप किए जाते हैं। प्रत्येक लैगून के लिए, ल्यूमिनेसेंस माप को संबंधित अवशोषण माप से विभाजित किया जाता है और समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया जाता है। फेज से संक्रमित लैगून हरे रंग में रंगे होते हैं, जबकि असंक्रमित नियंत्रण लैगून काले रंग में रंगे होते हैं। संक्षिप्तीकरण: PRANCE = फेज- और रोबोटिक्स-असिस्टेड निकट-निरंतर विकास। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: 3D-प्रिंटिंग के लिए STL फ़ाइल PRANCE सिस्टम के लिए आवश्यक कस्टम डेक घटक, जिसमें कम से कम, बैक्टीरियल जलाशय/वितरण कई गुना ("वफ़ल") शामिल है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: कमजोर पड़नेकैलकुलेटर स्प्रेडशीट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

उपकरणों को मानकीकृत करने के प्रयासों के बावजूद, व्यावहारिक रूप से बोलते हुए, उपकरण आपूर्ति, हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर संस्करण में परिवर्तन के कारण प्रत्येक PRANCE सेटअप अलग होगा। नतीजतन, प्रत्येक PRANCE सेटअप अद्वितीय सेटअप चुनौतियों को प्रकट करता है, प्रभावी मॉड्यूलर समस्या निवारण के लिए प्रत्येक घटक के उद्देश्य की व्यापक समझ की मांग करता है।

यह विधि एक स्थापित PRANCE प्रणाली के सेटअप और परीक्षण के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल को चित्रित करती है। हम पहले हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के महत्वपूर्ण तत्वों पर ध्यान केंद्रित करते हैं और फिर परीक्षण रन की एक श्रृंखला तैयार करने और संचालित करने के लिए आवश्यक चरणों का विस्तार करते हैं, जो स्थापित करते हैं कि सिस्टम PRANCE के लिए तैयार है।

हार्डवेयर की एक अनिवार्य विशेषता बैक्टीरियोफेज का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स प्रयोगों के दौरान नमूना क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए अनुकूलन है। रोबोट टिप तकनीक के साथ विशेष रूप से फ़िल्टर किए गए सुझावों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो टिप पुन: उपयोग के साथ संगत है और बल-फिट युक्तियों से बचने के द्वारा टिप इजेक्शन के दौरान उत्पादित एरोसोल को कम करने के लिए सोचा जाता है। इस प्रोटोकॉल के अनुसार मजबूत टिप धुलाई टिप पुन: उपयोग के लिए अनुमति देता है, हालांकि इस की पर्याप्तता प्रत्येक प्रणाली पर संक्रमण परीक्षण के हिस्से के रूप में मान्य किया जाना चाहिए. स्व-नसबंदी भी सिस्टम के लिए पानी और ब्लीच की लगातार आपूर्ति पर निर्भर है। इन्हें टैंक/बाल्टियों में संग्रहित किया जाता है और यदि इनका उपयोग कम हो जाता है तो इसके परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ स्व-बंध्याकरण और तेजी से क्रॉस-संदूषण होगा। कार्यक्रम के चलने से पहले और बाद में ली गई टंकियों/बाल्टियों की तस्वीरें ली जा सकती हैं ताकि उस दर को बेंचमार्क किया जा सके जिस पर वाशिंग उपकरण पानी और ब्लीच की खपत करता है, एक विशेष पंप सेटअप दिया गया है।

प्रणाली का एक अन्य प्रमुख तत्व बैक्टीरिया के विकास चरण और तापमान का रखरखाव है। PRANCE प्रयोग S2060 E. कोलाई बैक्टीरियल स्ट्रेन (Addgene: #105064) का उपयोग करके किए जाते हैं। यह एक K12-व्युत्पन्न एफ-प्लास्मिड युक्त तनाव है जो बायोफिल्म7 को कम करने के लिए अनुकूलित है। इसके अलावा, इस तनाव में एफ प्लाज्मिड प्लाज्मिड प्लाज्मिड रखरखाव के लिए एक tetracycline प्रतिरोध कैसेट के अलावा के साथ संपादित किया गया है, luxCDE और luxR लक्सएबी मध्यस्थता luminescence निगरानी के पूरक के रूप में, साथ ही साथ फेज सदमे प्रमोटर के तहत lacZ सजीले टुकड़े के वर्णमिति दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए. एफ-प्लाज्मिड-एन्कोडेड एफ-पाइलस एम 13 फेज संक्रमण के लिए आवश्यक है। इसलिए पीएसीई में उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया को 37 डिग्री सेल्सियस और मध्य-लॉग चरण में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए जब एफ-पाइलस12 व्यक्त किया जाता है और एम 13 फेज संक्रमण, प्रसार और विकास संभव होता है। स्थैतिक तापमान विनियमन के लिए, एक ऑफ-द-शेल्फ गर्म प्लेट वाहक नियोजित किया जा सकता है। एक विकल्प बस सस्ती हीटर का उपयोग करके HEPA फ़िल्टर में जाने वाली हवा को गर्म कर रहा है, हालांकि इसकी अनुशंसा नहीं की जाती है क्योंकि इससे हार्डवेयर पर त्वरित टूट-फूट हो सकती है। इसके अलावा, यह सहायक ऑन-डेक तरल पदार्थों के वाष्पीकरण को तेज करता है, जैसे कि ब्लीच /

उचित सिस्टम फ़ंक्शन के लिए सॉफ्टवेयर पैकेजों का अंशांकन भी आवश्यक है। सॉफ्टवेयर डेक लेआउट और वास्तविक रोबोट डेक के बीच विचलन ऑपरेशन के दौरान सिस्टम विफलता का सबसे आम कारण है। सहायक पंपों का नियमित अंशांकन जो बैक्टीरियल कल्चर, ब्लीच और ड्रेन सिस्टम की आपूर्ति करते हैं, महत्वपूर्ण है क्योंकि पेरिस्टाल्टिक पंप के उपयोग से टयूबिंग पहनने और द्रव मात्रा में परिवर्तन हो सकता है।

वाटर रन टेस्ट तेजी से कई सामान्य सेटअप समस्याओं को प्रकट करेगा, जिसमें गलत तरल हैंडलिंग सेटिंग्स, फ्लुइडिक्स लीक / दोषपूर्ण कनेक्शन और सॉफ्टवेयर अस्थिरता शामिल हैं। एक सफल वाटर रन कोई अप्रत्याशित तरल रिसाव प्रदर्शित नहीं करेगा और रात भर त्रुटियों के बिना स्थिर रूप से चलेगा। ऐसे कुछ तरल हैंडलिंग कदम निष्पादित करने के लिए विफलता के रूप में पानी चलाने के दौरान उत्पन्न हो सकता है के एक नंबर के सामान्य मुद्दों रहे हैं, पिपेट से टपकता है, और प्रोटोकॉल मध्य रन रोक. कुछ तरल हैंडलिंग चरणों को निष्पादित करने में विफलता के मामले में, पुष्टि करें कि सभी तरल वर्ग स्थापित किए गए हैं। ये उपयुक्त चिपचिपाहट और पाइपिंग गति को सूचीबद्ध करते हैं और निर्माता द्वारा प्रदान किए गए रोबोट नियंत्रण सॉफ्टवेयर में समायोजित किए जाते हैं। यदि पिपेट से टपकता है, तो रोबोट पाइपिंग आर्म सेटिंग्स के लिए स्वच्छ पाइपिंग को सक्षम करने और फेज क्रॉस-संदूषण को खत्म करने के लिए सही होना महत्वपूर्ण है। सफल रोबोटिक पाइपिंग के लिए, सही तरल वर्गों के अलावा, सभी लैबवेयर की सही डेक लेआउट ऊंचाई, और PRANCE रोबोट विधि कार्यक्रम में निर्दिष्ट उपयुक्त पाइपिंग ऊंचाई ऑफसेट की आवश्यकता होती है। इन ऊंचाई ऑफसेट को सीधे समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। यदि प्रोटोकॉल मध्य-रन बंद हो जाता है, तो अक्सर यह त्रुटियों की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा उत्पन्न किया जाएगा जो इंगित करता है कि डेक लेआउट फ़ाइल वास्तविक डेक कॉन्फ़िगरेशन से मेल नहीं खा सकती है।

बैक्टीरिया-केवल रन टेस्ट प्लेट रीडर सेटिंग्स और रीयल-टाइम डेटा विज़ुअलाइज़ेशन, अत्यधिक ब्लीच एकाग्रता या अपर्याप्त रिंसिंग और तापमान स्थिरता के साथ समस्याओं को प्रकट करेगा। एक सफल बैक्टीरिया-केवल रन पहले तीन चक्रों में लैगून अवशोषण के संतुलन को प्रदर्शित करेगा, इसके बाद रन की अवधि के लिए स्थिर अवशोषण होगा। इसके अलावा, यह कई सामान्य मुद्दों को प्रकट कर सकता है। यह पहला चरण है जहां प्लेट रीडर द्वारा उत्पन्न डेटा प्लॉट किया जाता है। प्लेट रीडर डेटाबेस में डेटा ठीक से सहेजा नहीं जा सकता है या ठीक से प्लॉट नहीं किया जा सकता है। यदि बैक्टीरिया अपने अवशोषण में संतुलन बनाने में विफल रहते हैं, तो यह संकेत दे सकता है कि ब्लीच एकाग्रता बहुत अधिक है। अत्यधिक ब्लीच या अपर्याप्त धुलाई केवल लैबवेयर के टुकड़े के बजाय पूरे प्रयोग को निष्फल कर सकती है। यदि यह संदेह है, तो लैगून का परीक्षण करने के लिए ब्लीच-डिटेक्टिंग स्ट्रिप्स का उपयोग किया जा सकता है। संस्कृति के तापमान की स्थिरता को थर्मामीटर बंदूक से जांचा जा सकता है।

एक सफल संक्रमण परीक्षण इंगित करता है कि सिस्टम PRANCE रन के लिए तैयार है। बैक्टीरिया संस्कृति युक्त लैगून के एक सबसेट को टीका लगाकर एक संक्रमण परीक्षण किया जा सकता है। ये बैक्टीरिया pIII को तब व्यक्त करेंगे जब उपयुक्त फेज से संक्रमित होंगे जिसमें pIII (ΔgIII) के लिए जीन की कमी होती है, जिससे फेज प्रसार की अनुमति मिलती है। परीक्षण के लिए एक संभावित संयोजन किसी भी ΔgIII फेज के साथ फेज शॉक प्रमोटर के तहत pIII व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ रूपांतरित S2060 बैक्टीरिया का उपयोग करना है। हम S2060 बैक्टीरिया के साथ जंगली प्रकार T7 शाही सेना पोलीमरेज़ असर ΔgIII फेज का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जिसमें pIII और luxAB T7 प्रमोटर (प्लाज्मिड pJC173b13) द्वारा संचालित होते हैं, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। यह परीक्षण चलाने के दौरान संक्रमण की प्लेट-रीडर-मध्यस्थता निगरानी की भी अनुमति देता है। संक्रमण परीक्षण की सफलता और क्रॉस-संदूषण की कमी के निश्चित प्रमाण परीक्षण और नियंत्रण लैगून के फेज टाइटरिंग से आएंगे। जहां एक लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर का उपयोग किया जाता है, केवल परीक्षण कुओं में ल्यूमिनेसेंस में वृद्धि, जैसा कि चित्र 3में देखा गया है, सफल फेज संक्रमण और प्रसार का एक संकेतक भी है। फेज टिटर परिमाणीकरण के लिए स्वर्ण मानक पट्टिका परख7 है। qPCR7 द्वारा M13 परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल भी है जो तेज हो सकता है, हालांकि यह संक्रामक और गैर-संक्रामक फेज कणों के बीच भेदभाव नहीं करता है और इस प्रकार टाइटर्स को अधिक महत्व दे सकता है।

मुख्य कार्यक्रम एक प्रकट फ़ाइल का संदर्भ देता है, यह एक सादा पाठ डेटाबेस फ़ाइल है, जो प्रत्येक प्रचार संस्कृति के प्रति चक्र कमजोर पड़ने की मात्रा के साथ-साथ किसी भी संभावित जीवाणु संस्कृति फीडस्टॉक्स के चयन को निर्धारित करता है, जो चयन कठोरता में भिन्न हो सकता है। इस तरह, मैनिफेस्ट फ़ाइल PRANCE रन के कई मापदंडों को परिभाषित करती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस फ़ाइल को ऑपरेटर या सिस्टम द्वारा चलाने के दौरान संपादित किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि मैन्युअल या स्वचालित प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रभावित किया जा सकता है।

पूरी तरह से कार्यशील PRANCE सेटअप की उपयोगिता सावधानीपूर्वक निगरानी और नियंत्रित वातावरण में बड़ी आबादी को तेजी से विकसित करने की क्षमता में निहित है। प्लेट-आधारित प्रारूप PRANCE को अन्य तकनीकों से अलग करता है, जैसे छोटे ऑफ-द-शेल्फ टर्बिडोस्टेट-आधारित सिस्टम 14,15का उपयोग करना। प्लेट-आधारित सेटअप न केवल अतिरिक्त रोबोट प्रसंस्करण चरणों के साथ आसान एकीकरण की सुविधा प्रदान करता है, बल्कि सेंट्रीफ्यूज जैसे अन्य प्रयोगशाला उपकरणों के साथ संगतता भी प्रदान करता है। इसके अलावा, कई उदाहरणों में समवर्ती रूप से त्वरित विकास का संचालन करने की क्षमता प्रयोग के लिए एक अतिरिक्त आयाम का परिचय देती है, जिससे विविध और मजबूत परिणाम प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है। PRANCE के अभिन्न अंग दानेदार नियंत्रण और प्रतिक्रिया प्रणाली आगे प्रयोग की पूर्वानुमेयता और विश्वसनीयता को बढ़ाती है, जो निर्देशित विकास तकनीकों के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रगति को चिह्नित करती है। हालांकि, यह तकनीक समानांतर प्रयोगों की संख्या में सीमित है जो इसे संचालित कर सकती है। कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर, PRANCE सेटअप आमतौर पर रोबोट पाइपिंग गति या उपलब्ध डेक स्थान द्वारा सीमित होते हैं।

PRANCE के लिए उपयोग किए जाने वाले समान हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर को उन विकास विधियों पर भी लागू किया जा सकता है जिनमें बैक्टीरियोफेज शामिल नहीं है। जैसा कि कई-टर्बिडोस्टैट्स विधि11 में दिखाया गया है, यह वही उपकरण विशेष रूप से बैक्टीरिया के साथ नियोजित किया जा सकता है, जिससे पूरे जीनोम अनुकूली विकास प्रयोगों को सक्षम किया जा सकता है। यह अनुकूलनशीलता इस उपकरण के दायरे को चौड़ा करती है, रोबोटिक्स-त्वरित विकास के नए रूपों का मार्ग प्रशस्त करती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम एम्मा चोरी और केविन एस्वेल्ट को हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर सेटअप के साथ उनकी मदद और सलाह के लिए धन्यवाद देते हैं। समीर औडजेन, ओसैड एथर और एरिका डेबेनेडिक्टिस को स्टील पेर्लोट अर्ली इन्वेस्टिगेटर ग्रांट द्वारा समर्थित किया जाता है। इस काम को फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया था जो कैंसर रिसर्च यूके (CC2239), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (CC2239), और वेलकम ट्रस्ट (CC2239) से अपनी मुख्य फंडिंग प्राप्त करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printed bacterial reservoir "waffle" - - https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck
3D printer FormLabs Form 3B+ 3D printer components
3D printer resin (clear) FormLabs RS-F2-GPCL-04 consumable for 3D printer
8-1,000 µL head Hamilton 10140943 For Liquid handling robot
96-1,000 µL pipetting head Hamilton 10120001 For Liquid handling robot
Black polystyrene plate reader microplates Millipore Sigma CLS3603 For Robot deck
BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega BMG Labtech 10086700 For Liquid handling robot
Cleaning solution Fluorochem Limited F545154-1L used to clean the liquid handling parts of the robot
Deep Well plates Appleton Woods ACP006 these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot
encolsure heater Stego 13060.0-01 heats inside robot enclosure
Hamilton STAR Hamilton 870101 For Liquid handling robot
Heater Erbauer BGP2108-25 For Liquid handling robot
HIG Bionex centrifuge Hamilton 10086700 For Liquid handling robot
iSWAP plate gripper Hamilton 190220 For Liquid handling robot
laboratory tubing Merck Z280356 to construct liquid handling manifold
luer to barb connector AIEX B13193/B13246 for connectorizing tubing
Magnetic stir plate Camlab SKU - 1189930 For Auxiliary Fridge
Molcular pipetting arm Hamilton 173051 For Liquid handling robot
Omega BMG labtech 5.7 plate reader control software
One way Check Valves Masterflex MFLX30505-91 to one way sections of liquid handling manifold
pyhamilton MIT/Open source https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE open source python robot control software
pymodbus opensource 3.5.2 python pump software interface
Refrigetator Tefcold FSC175H allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat
S2060 Bacterial strain Addgene Addgene: #105064 E. coli
temperature controller Digiten DTC102UK Used to control heaters thermostatically
Thermostat switch controller WILLHI WH1436A WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot
Venus Hamilton 4.6 proprietary robot control software
Wash Station for MPH 96/384 Hamilton 190248 For Liquid handling robot
Suggested pump manufacturers
Company Catalog number Notes Documentation
Agrowtek AD6i Hexa Pump https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf
Amazon INTLLAB 12V DC
Cole-Parmer EW-07522-3 Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf
Cole-Parmer EW-07554-80 Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf

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References

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Aoudjane, S., Golas, S., Ather, O.,… More

Aoudjane, S., Golas, S., Ather, O., Hammerling, M. J., DeBenedictis, E. A Practical Guide to Phage- and Robotics-Assisted Near-Continuous Evolution. J. Vis. Exp. (203), e65974, doi:10.3791/65974 (2024).

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