Summary
ファージおよびロボット工学支援による近連続進化(PRANCE)は、迅速で頑健なタンパク質進化のための技術です。ロボティクスは、実験の並列化、リアルタイムモニタリング、フィードバック制御を可能にします。
Abstract
ロボティクスアクセラレーテッドエボリューション技術は、フィードバック制御を使用して進化の信頼性と速度を向上させ、タンパク質と生物の進化実験の結果を改善します。本稿では、ファージおよびロボティクス支援による近連続進化(PRANCE)の実装に必要なハードウェアとソフトウェアのセットアップガイドを紹介します。PRANCEは、ファージベースの高速分子進化と、何百もの独立したフィードバック制御進化実験を同時に実行する能力を兼ね備えています。このホワイトペーパーでは、リキッドハンドリング機器、プレートリーダー、補助ポンプ、ヒーター、3Dプリント容器など、PRANCEのハードウェア要件とセットアップについて説明します。Pythonベースのオープンソースソフトウェアと互換性を持つようにリキッドハンドリングロボットを構成する方法について説明します。最後に、新たに構築したPRANCEシステムを用いて、その能力を発揮し、多重進化を行う準備が整ったことを検証する最初の2つの実験について提案する。このガイドは、ロボット工学によって加速された進化の実施に関連する重要な機器のセットアップをナビゲートするためのハンドブックとして役立つことを目的としています。
Introduction
PRANCEは、2つの強力な指向性進化技術を組み合わせたものです。1つ目はPACE1で、遺伝子の多様化と選択をM13バクテリオファージの速いライフサイクルに結びつける分子技術であり、液体ファージ培養において急速な進化のラウンドが連続的に起こることを可能にします。この選択は、進化するタンパク質の機能を、ファージの繁殖に必要なM13のテールコートタンパク質であるpIIIの発現に結合するプラスミドコード遺伝子回路の使用によって推進されます。実験レベルでは、液体ファージ培養物の連続希釈により、連続的な選択が可能になります。したがって、選択の厳格さは、ファージ培養の希釈速度を制御することにより、遺伝子回路のレベルと実験レベルの両方で調節できます。したがって、PACEは、大腸菌の所望の活性を検出してpIII発現を誘導できる分子センサーがあるあらゆる生体分子工学の課題に適用できます。アプリケーションには、タンパク質-タンパク質結合2,3,4、タンパク質-DNA結合5、タンパク質溶解度6、および多数の特定の酵素機能7の進化が含まれます。2つ目は、ロボティクスで加速された進化8,9で、フィードバックコントローラを使用して、指向性進化の2つの一般的な故障モード、つまり、環境が厳しすぎるときに発生する絶滅と、環境が緩すぎるときに発生する進化の欠如を排除します。PANCE(ファージ支援非連続進化)7,10で行われるファージの逐次継代とは異なり、ロボット工学で加速された「ほぼ連続的」進化では、培養を中期に維持する迅速なピペッティングが行われ、集団が感染と増殖の連続的なサイクルを経験することができます。これら2つの技術を併用すると、PHAGEとRobotics-assisted Near-continuous Evolution8の略でPRANCEと呼ばれ、堅牢で多重化された迅速な連続進化が可能になります。PRANCEは、ポリメラーゼ、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素を進化させ、それらの進化中にフィードバック制御を行い、それらの速度と信頼性を向上させるために使用されています8。
PRANCEのハードウェアとソフトウェアのセットアップには、リキッドハンドリングロボットでバクテリオファージを使用できるようにするためのいくつかの詳細があります。ロボットメーカーが提供するデフォルトのソフトウェアを使用する代わりに、Pythonベースのオープンソースソフトウェアパッケージ11を使用しており、高速な同時実行を可能にし、半連続バイオリアクターを中間対数相に維持することができます。研究者のハンズオフ時間は、デッキ上のいくつかのコンポーネントを定期的に自己滅菌することで数日に延長することができ、これはこれらのコンポーネントを漂白およびすすぐことができるポンプの自動制御によって達成されます。ファージのクロスコンタミネーションは、フォースフィットチップを使用しないリキッドハンドリングロボットを使用し、リキッドハンドリング設定を慎重に調整することで排除できます。
Protocol
1. ハードウェアのセットアップ
メモ:PRANCEシステムのハードウェアコンポーネントの概要については 図2 を、物理的に組み立てられたこれらのコンポーネントの写真については 図3 を参照してください。
- リキッドハンドリング機器、プレートリーダー、補助ポンプなど、PRANCEシステムの主要なハードウェアを入手します。
注:これまでのすべてのPRANCEシステムは、8チャンネルの個別アドレス指定可能なピペッティングアーム、シングルピストン96チップピペッティングアーム、プレート移動用のロボットグリッパー、チップ滅菌用の統合洗浄ステーション、吸光度と発光測定が可能な統合プレートリーダーを備えた中型から大型のリキッドハンドリング機器に実装されています。 - リキッドハンドリングロボットのモデルと機能に応じて加熱方法を設定します。加熱プレートキャリアまたはヒーター媒介ロボット温度調節を使用します。
- チップの再利用を可能にするために、チップ洗浄ステーションを設置します。
注:これまで、PRANCEシステムは既製の洗浄ステーションを使用してきましたが、原理的には、このコンポーネントは低コストのコンポーネントから簡単に構築できます。 - ケモスタット/タービドスタットとして37°Cで動作するリアルタイムバイオリアクターをセットアップすることにより、対数相で維持される細菌培養源を確立します。あるいは、37°Cの対数相(OD600 、0.25〜0.45)で、近くの冷蔵庫で4°Cで増殖した少なくとも1 Lの容量の対数相細菌培養を停止します。沈殿を防ぐために、培養物は、冷蔵または温めにかかわらず、シェーカープレートまたは攪拌プレートを使用して定期的に攪拌してください。
- 必要なソフトウェアとドライバーを使用してロボットを統合するために、優先ポンプを構成します。ソフトウェアを実装して、ポンプが10〜100 mLのオーダーで定義された量の液体を供給できるようにします。
メモ: この実装で使用されるポンプについては、 部品表 を、これらのポンプの操作に使用するソフトウェアと、それらの構成方法に関するドキュメントについては、製造元の Web サイトを参照してください。この原稿で示したPRANCEセットアップで使用されるポンプ用のこのようなソフトウェアは、次のGitHubリポジトリでオープンソースで提供されています https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCEには、3つの別々のチャネル(バクテリアをバクテリアリザーバーに送達する、漂白剤をバクテリアリザーバーに送達する、バクテリアリザーバーを廃棄物に排出する)をポンプで送ることができる少なくとも3つのポンプマニホールドが必要であり、それぞれの速度は独立して校正および制御されます。以前、人々は水槽ポンプと水耕栽培ポンプアレイを使用してきましたが、原則として、ニシキヘビが制御できる蠕動ポンプを使用できます。重要な機能には、ロボットグリッパーを使用してプレートをリーダーに出し入れする機能、プレートリーダー測定を開始する機能、測定値にアクセスする機能が含まれます。 - 補足ファイル1(https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link)にあるように、少なくともバクテリアリザーバー/分配マニホールド(「ワッフル」)を含む、PRANCEシステムに必要なカスタムデッキコンポーネントを3Dプリントします。これらの容器をデッキに固定し、標準のリキッドハンドリングロボットソフトウェアを使用して位置を校正します。リザーバーをポンプアレイに接続します。
注意: キャリブレーションの実行方法の詳細はロボットに依存するため、ロボットの製造元のドキュメントを参照してください。樹脂ベースの3Dプリンターが最適です。使用されるプリンタータイプの例は、 材料表に記載されています。標準のClear Resinをデフォルトのプリンタ設定で使用しました。 - 地域のバイオセーフティー勧告に適合するドレンをシステムに装備します。
- リキッドハンドリングロボットのデッキに実験器具を置きます( 図4)。
- 標準的な実験室用個人用保護具(白衣、手袋、目の保護具など)の使用を含む、標準的な安全手順に従ってください。
2. ソフトウェアの準備
- オープンソースのPyHamiltonリポジトリから入手できる、python11でリキッドハンドリングロボットを制御するために使用されるオープンソースソフトウェアをインストールします。https://github.com/dgretton/pyhamilton
- 図 4 に示すように、リキッドハンドリングロボットソフトウェアのデッキレイアウトファイルを修正およびキャリブレーションして、ロボットデッキ上のラボウェアの位置を正確に反映します。
注意: ここで使用されるセットアップは、提供されたドキュメントに従って、液体処理ロボットの製造元から提供されたソフトウェアを使用します。 - PRANCEロボットメソッドプログラムを シミュレーションモードで実行します。
- 次のコマンドを使用してコマンドラインを開きます(Windowsオペレーティングシステムの場合)図 5に示すように。
Windowsキー+ R
「cmd」と入力します。 - 親ディレクトリをロボットメソッドプログラムのディレクトリに変更します。 図5に示すように、正しいパスで以下のコマンドを入力します。
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Pythonでシミュレーションモードフラグを指定してロボットメソッドプログラムを呼び出します( 図5参照)。
py robot_method.py --simulate - プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します (図 5)。
注記 : 先に進む前に、シミュレーションで PRANCE メソッドがエラーなしで実行できることを確認してください。スクリプトがエラーなしでシミュレーションモードで動作できるかどうかは、システムのエラー処理が呼び出されることなくメインプログラムの複数のループを完了し、メインプログラムループを終了するため、明らかになります。
- 次のコマンドを使用してコマンドラインを開きます(Windowsオペレーティングシステムの場合)図 5に示すように。
- シミュレーションモードを無効にして、PRANCEロボットメソッドプログラムを実行します。
- 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます(図5)。
Windowsキー+ R
「cmd」と入力します。
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Pythonでフラグなしでロボットメソッドプログラムを呼び出します。
py robot_method.py - プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します。
- PyHamiltonが計測器を制御し、初期化できることを確認します。
- 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます(図5)。
- リアルタイムのデータ同期を確立します。
注:これまで、PRANCEシステムは、ユーザーがリモートファイル共有ソフトウェアまたはリモートデスクトップを介してログファイルとリアルタイムのプレートリーダー測定グラフを監視できるネットワークコンピュータを使用してきました。 - 自動更新をオフにします。
3. 実行前の準備
- 計画された分析に必要なすべての培養物に対数相の細菌培養源が利用可能であり、沈降を防ぐために積極的に攪拌されていることを確認してください。活性ケモスタット/タービドスタットまたは増殖停止冷蔵増殖済み培養液を使用してください。
- プログラムサイクルごとに、96ウェルラグーンの各ウェルにポンプで送る細菌培養の量(範囲0〜500 μL)の詳細でコントローラーマニフェストファイルを更新します。これにより、ラグーンの有効希釈率を正確に制御できます。これを 図 6 に示します。
- 図 7 に示すように、DilutionCalculator.xlsxスプレッドシート(補足ファイル 2 として提供)を使用してラグーンの希釈率を計算します。
- robot_method.pyファイルを目的のラグーンの高さで更新します。このプロトコルに従うには、プログラム内の変数fixed_lagoon_heightのデフォルト値として 14 (ミリメートル単位) を使用します。これは、システム上のラグーン容量 550 μL に相当しますが、使用する特定の 96 ディープウェルプレートによって異なる場合があります。
- 清潔なフィルターを通したピペットチップをロボットデッキの所定の位置に置き、チップラックをチップホルダーにテープで固定して、分析中の安定性を確保します。
- 清潔な96ウェルプレートをロボットデッキの指定された位置に配置します。
- 清潔な96ウェルリーダープレートをロボットデッキの指定された位置に配置します。
- プレートリーダートレイが既存のプレートで占められていないことを確認します。
- ポンプがコンピュータに接続され、正しいアドレスに割り当てられていることを確認します。
- ポンプを作動させて漂白剤を汲み上げてから水を汲み上げて、ポンプラインを清掃します。
- ポンプラインを適切なソースとアウトプットに接続し、正しいラインが関連する細菌培養物に接続されていることを確認するために細心の注意を払います。
- バクテリアリザーバーとピペットチップ洗浄用の漂白剤/水を含むタンク/バケツを補充します。
- 甲板上のすべてのコンポーネント、特に可動要素が指定された位置で安定していることを確認してください。
- ローカル実装に従って、目標温度(つまり、37°C)までヒーターを作動させます。 図8)。
- UV滅菌プロトコルファイルを10分間実行して、メーカーから提供されたリキッドハンドリングロボットの内蔵UV滅菌ランプを操作します(図9)。
- プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します。
- parametrized オプションを指定してファイルを 600 秒間実行します。
- ロボット実行制御ソフトウェアが閉じていることを確認します。
メモ: ロボットメソッドプログラムは、実行制御ソフトウェアの既存のインスタンスが実行されている場合にクラッシュします。
4. ハードウェアとソフトウェアの統合
- 「ウォーターラン」を実施し、PRANCEロボットメソッドプログラムを、すべての培養物と湿式試薬の代わりに水で一晩中実行します。
注:このテストは室温で実行できます。- 図 5 および図 6 に示すように、ラグーンの有効希釈速度が 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記のように分析前調製を完了します。
- 「バクテリアイン」ラインを水の容器に接続して、給水用の対数相バクテリアを交換します。
注:食品着色料を水源に追加して、実験中の液体の動きを追跡できます。 - 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。
- 新しい実行フラグ (py robot_method.py --new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、 ログ ファイル名 (TestRun)、ラグーン ウェルの数 (16)、 サイクル期間 (30)、 リーダー プレート測定あたりのサイクル数 (4)、 インデューサー ボリューム (インデューサー ボリュームは 0 ) など、要求された引数を入力しますこの試験では、アラビノースで突然変異誘発が誘導される進化の間、この値は10μLである可能性があります)、 図5に示すように。
- [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムが実行されると開きます。
注:PRANCE法は空のラグーンプレートを使用して開始でき、ラグーンの液体量は最初の6サイクルで最終容量に平衡化します。
- バクテリオファージを含まない、目標温度での細菌培養のみでPRANCEプロトコルを一晩実行する「バクテリアのみのラン」を実施します。
- 図 5 および図 6 に示すように、ラグーンの有効希釈速度が 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記のように分析前の前処理を完了します。目標温度が37°Cになるようにヒーターがオンになっていることを確認してください。
- 「バクテリアイン」ラインを、選択した対数相バクテリアの発生源に接続します。
- 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。
- 新しい実行フラグ (py robot_method.py --new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、セクション 4.1.4 で前述したように、要求された引数を入力します。
- [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムの実行時に開きます。
- 進化したタンパク質を持つファージが、そのタンパク質を必要とする細菌で増殖するように挑戦する「感染テスト」を実行します。
注:どのラグーンにファージを接種し、どのラグーンに接種しないかを事前に決定し、クロスコンタミネーションを検出するためのファージコントロールラグーンとして機能します。- 図 5 および図 6 に示すように、有効希釈速度 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記で詳述した分析前調製を完了します。目標温度が37°Cになるようにヒーターがオンになっていることを確認してください。
- 「バクテリアイン」ラインを、選択した対数相バクテリアの発生源に接続します。
- 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。
- 新しい実行フラグ (py robot_method.py --new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、セクション 4.1.4 で前述したように、要求された引数を入力します。
- [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムが実行されると開きます。
- バクテリオファージを添加する前に、この方法を2〜3時間実行して、ラグーンプレート内の体積とバクテリアODを平衡化します。
- プログラムがスリープしているときに、実行サイクルの終わりに106 pfu/mLのバクテリオファージをウィズファージラグーンに接種します(例えば、プラークアッセイまたはqPCRによって決定された108 pfu/mLのファージアリコート5.5 μLを)、550 μLラグーンに接種します。
- プログラムを一晩実行し、プラークアッセイまたはqPCRによってラグーンウェルのファージ力価を確認します。
Representative Results
感染検査結果
このテストでは、細菌培養、ファージクローニングと力価、機器の温度安定性、リキッドハンドリング設定、プレートリーダーの統合に関する問題を明らかにします。巧妙なバクテリオファージの伝染テストはファージと接種された礁湖の明確で、急速なバクテリオファージの伝染を明らかにし、ファージの礁湖の信号無し。 図10 にファージ感染検査の代表的な結果を示します。実験結果は、「ホットPRANCE」(生きた細菌タービドスタットによって供給される)または「クールPRANCE」(冷やされた中対数段階培養によって供給される)構成が実装されているかどうかに応じて、このPRANCE論文8の図1dおよび1cと比較することもできます。このテストでは、いくつかの一般的な問題が明らかになる場合があります。細菌培養の準備に問題があると、感染が弱くなったり、感染がなかったりすることがよくあります。バクテリアは、中対数期で37°Cにある場合にのみ、M13ファージによって最適に感染することができます。 他の温度や成長段階では、毛線毛の発現が弱くなるため、ファージ感染の影響を受けにくくなります12。低力価ファージ、またはバックボーン変異を有するファージを接種すると、シグナルの遅延または欠如が生じる可能性がある。このテストでは、蛍光または発光のプレートリーダーのゲイン設定の問題が明らかになります。
図1:PRANCE装置の感染試験中に作動する遺伝子回路の模式図。 ファージゲノムにコードされたT7 RNAポリメラーゼが宿主である 大腸菌 に感染すると、転写されてT7プロモーターでAPに結合し、pIIIファージタンパク質とluxABタンパク質の転写をもたらし、ファージの増殖と発光の産生を促進します。略語: PRANCE = ファージおよびロボット工学支援の準連続進化;AP = アクセサリープラスミド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:PRANCEシステムの物理コンポーネントの概略図。 攪拌した培養物は冷蔵庫に保管され、ポンプの配列によってロボットデッキに運ばれ、バクテリアの貯蔵庫である「ワッフル」に送られます。リキッドハンドリングロボットは、ピペッティングヘッドを使用して「ワッフル」から保持ウェルに細菌培養物を移動させ、インキュベーション温度まで温め、次にメインインキュベーションが行われるラグーンに移動させるために使用されます。保持井戸とラグーンはどちらも標準的な2 mLディープウェルプレートです。ロボットはサンプルをシングルユースのリーダプレートに取り込み、プレートリーダに移して測定します。略語:PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution(ファージおよびロボット工学支援による準連続進化)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:PRANCEロボット装置。 (A)PRANCEのセットアップ。(I)HEPAフィルターと外部ヒーター。(II)培養冷蔵庫。(III)ロボットのメインエンクロージャー。 (IV) プレートリーダー。 (V) ポンプとタンク。(B)ロボット筐体。 (VI) メイン培養ポンプ。 (VII) 水、廃棄物、漂白剤タンク。 (VIII) ウォッシャーポンプ。(C)ロボット筐体。(IX) ロボットピペッティングアームとグリッパー。(X)ピペットチップ。(XI)ロボット(「ワッフル」)への培養分配を可能にするための3Dプリントされたコンポーネント。(XII)プレートリーダーでサンプリングするためのプレート。(十三) 先端洗浄用バケツ(XIV) 「ラグーン」:進化的培養が行われる培養容器。略語: PRANCE = ファージおよびロボット工学支援の準連続進化;HEPA = 高効率粒子状空気。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:デッキレイアウト。 (A)ロボット制御ソフトウェアでのデッキレイアウトの3D表現。(B)甲板部品の写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:パラメータの例(上)と実行制御ソフトウェア(下)を含むコマンドラインのスクリーンショット。 再生ボタンは左上にあり、ローカルの実装に応じて、マウスでクリックしたり、タッチスクリーンで操作したりできます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 6: テスト実行用に構成されたコントローラー マニフェスト ファイル。 培養物 #0 を含むラグーンは、96 ディープウェルプレートの列 1 と 3 にあります。残りの列は空になります。96-deep-well-plateの列A、B、D、およびEは、ファージによる感染(1)の右側の列にマークされており、他の列(0)はファージなしの対照です。コントローラーマニフェストのこのインスタンスでは、プログラムはサイクルごとに 210 μL の培養液でラグーンを希釈します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:DilutionCalculatorスプレッドシートを使用したラグーンの実効希釈率の計算。DilutionCalculator スプレッドシートの補足ファイル 2 を参照してください。この図に見られるように、550 μLのラグーンを30分サイクルごとに210 μLの新鮮培養液で希釈し、リーダープレート測定用のサンプルを4サイクルごとに採取すると、1.0ラグーン容量/時間の有効希釈率になります(1時間ごとに、時間開始時の元のラグーン液の50%が残ります) これの拡大版を表示するには、ここをクリックしてください像。
図8:ロボットヒーターシステム。 ヒーターは、赤い丸で示されているように電源を差し込むことで作動します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図9:UV除染プロトコルの設定。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図10:PRANCEシステム上で実施した感染試験の測定結果。 分析中にサンプルを採取し、発光と吸光度の測定を行います。各ラグーンについて、発光測定値を対応する吸光度測定値で除算し、時間の関数としてプロットします。ファージに感染したラグーンは緑色で、感染していない対照ラグーンは黒色です。略語:PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution(ファージおよびロボット工学支援による準連続進化)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:少なくともバクテリアリザーバー/分配マニホールド(「ワッフル」)を含む、PRANCEシステムに必要なカスタムデッキコンポーネントを3DプリントするためのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:DilutionCalculatorスプレッドシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
機器の標準化は図られていますが、実際には、機器の供給、ハードウェア、ソフトウェアのバージョン変更により、PRANCEのセットアップは毎回異なります。その結果、各PRANCEセットアップには固有のセットアップの課題があり、効果的なモジュール式トラブルシューティングのためには、各コンポーネントの目的を包括的に理解する必要があります。
この方法では、確立されたPRANCEシステムのセットアップとテストのためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。まず、ハードウェアとソフトウェアの重要な要素に焦点を当て、次に、システムがPRANCEの準備ができていることを確認するための一連のテスト実行の準備と実施に不可欠な手順を詳しく説明します。
ハードウェアの本質的な特徴は、バクテリオファージを使用したマルチプレックス実験中のサンプルのクロスコンタミネーションのリスクを低減するための最適化です。チップの再利用に対応し、チップの強制フィットを回避することで、チップの排出時に発生するエアロゾルを最小限に抑えると考えられているロボットチップ技術を備えた、フィルターのみのチップを使用することをお勧めします。このプロトコルに従った堅牢なチップ洗浄により、チップの再利用が可能になりますが、各システムの感染テストの一環として、この妥当性を検証する必要があります。自己滅菌は、システムへの水と漂白剤の一貫した供給にも依存しています。これらはタンク/バケツに保管され、枯渇すると自己滅菌が損なわれ、急速な二次汚染が発生します。プログラムの実行前と実行後に撮影したタンク/バケツの写真を撮影して、特定のポンプ設定で洗浄装置が水と漂白剤を消費する速度をベンチマークできます。
このシステムのもう一つの重要な要素は、細菌の増殖段階と温度の維持です。PRANCE実験は、S2060大腸菌株(Addgene:#105064)を用いて行われます。これは、バイオフィルムを還元するために最適化されたK12由来のFプラスミド含有株です7。さらに、この菌株のFプラスミドは、プラスミド維持のためのテトラサイクリン耐性カセット、luxABを介した発光モニタリングを補完するluxCDEおよびluxR、およびプラークの比色可視化を可能にするファージショックプロモーター下のlacZを追加して編集されています。FプラスミドにコードされたF線毛は、M13ファージ感染に必要です。したがって、PACEで使用される細菌は、F-pilus12が発現し、M13ファージの感染、増殖、および進化が可能な37°Cおよび中対数期で培養する必要があります。静的温度調節には、既製の加熱プレートキャリアを使用できます。別の方法としては、安価なヒーターを使用してHEPAフィルターに入る空気を加熱するだけですが、これはハードウェアの摩耗や損傷を加速する可能性があるため、お勧めしません。さらに、これにより、漂白剤/水バケツやインデューサーなどの甲板上の補助液の蒸発が促進されます。
ソフトウェアパッケージのキャリブレーションも、システムが適切に機能するために不可欠です。ソフトウェアデッキのレイアウトと実際のロボットデッキの相違は、動作中のシステム障害の最も一般的な原因です。バクテリア培養、漂白剤、排水を供給する補助ポンプは、チューブの摩耗や液量の変化につながる可能性があるため、システムの定期的な校正が不可欠です。
水圧試験では、不適切なリキッドハンドリング設定、流路系の漏れ/接続不良、ソフトウェアの不安定性など、多くの一般的なセットアップの問題が迅速に明らかになります。水がうまく使えば、予期せぬ液漏れがなく、一晩中エラーなく安定して稼働します。特定の液体処理ステップの実行の失敗、ピペットからの滴下、実行の途中でのプロトコルの停止など、水やり中に発生する可能性のある一般的な問題が多数あります。特定の液体処理手順の実行に失敗した場合は、すべての液体クラスがインストールされていることを確認してください。これらには、適切な粘度とピペッティング速度が記載されており、メーカーが提供するロボット制御ソフトウェアで調整されます。ピペットから滴り落ちる場合は、ロボットのピペッティングアームの設定を正しくして、クリーンなピペッティングを可能にし、ファージのクロスコンタミネーションを排除することが重要です。ロボットピペッティングを成功させるには、正しい液体クラスに加えて、すべての実験器具の正しいデッキレイアウトの高さ、およびPRANCEロボットメソッドプログラムで指定された適切なピペッティング高さオフセットが必要です。これらの高さオフセットは、直接調整が必要な場合があります。プロトコルが実行の途中で停止した場合、多くの場合、デッキ レイアウト ファイルが実際のデッキ構成と一致しない可能性があることを示すさまざまなエラーによって生成されます。
バクテリアのみのランテストでは、プレートリーダーの設定とリアルタイムのデータ視覚化の問題、漂白剤の濃度が高すぎるかすすぎが不十分である問題、および温度安定性が明らかになります。バクテリアのみの分析が成功すると、最初の3サイクルでラグーンの吸光度の平衡が示され、その後、分析期間中は安定した吸光度が続きます。さらに、いくつかの一般的な問題が明らかになる場合があります。これは、プレートリーダーによって生成されたデータがプロットされる最初のステップです。プレートリーダーデータベース内のデータが正しく保存されていないか、正しくプロットされていない可能性があります。バクテリアが吸光度で平衡化できない場合、これは漂白剤の濃度が高すぎることを示している可能性があります。漂白剤が多すぎたり、洗浄が不十分だったりすると、実験器具だけでなく、実験全体が滅菌されてしまう可能性があります。これが疑われる場合は、漂白剤検出ストリップを使用してラグーンをテストできます。培養液の温度の安定性は、温度計ガンで確認することができます。
感染テストが成功すると、システムが PRANCE を実行する準備ができていることを示します。感染試験は、細菌培養物を含むラグーンのサブセットに接種することによって実施することができる。これらの細菌は、pIIIの遺伝子(ΔgIII)を欠く適切なファージに感染するとpIIIを発現し、ファージの増殖を可能にします。試験の可能な組み合わせの1つは、任意のΔgIIIファージのファージショックプロモーターの下でpIIIを発現するプラスミドで形質転換されたS2060細菌を使用することです。図1に示すように、pIIIとluxABがT7プロモーター(プラスミドpJC173b13)によって駆動されるS2060細菌をアクセサリープラスミドで形質転換した野生型T7 RNAポリメラーゼを有するΔgIIIファージの使用を推奨します。これにより、テストラン中の感染のプレートリーダーを介したモニタリングも可能になります。感染試験の成功と交差汚染の欠如の決定的な証拠は、試験および対照ラグーンのファージ力価から得られます。ルシフェラーゼレポーターを使用する場合、図3に見られるように、試験ウェルのみで発光が増加することも、ファージの感染と増殖が成功したことを示す指標となります。ファージ力価定量のゴールドスタンダードはプラークアッセイです7。また、qPCR7によるM13定量プロトコルもありますが、これは感染性ファージ粒子と非感染性ファージ粒子を区別しないため、力価を過大評価する可能性があります。
メインプログラムはマニフェストファイルを参照し、これはプレーンテキストのデータベースファイルであり、各増殖培養のサイクルあたりの希釈量と、選択の厳密さが異なる可能性のある潜在的な細菌培養原料の任意の数の選択を決定します。このようにして、マニフェスト ファイルは PRANCE 実行のパラメーターの多くを定義します。このファイルは、オペレーターまたはシステムのいずれかが実行中に編集できるため、手動または自動のフィードバック制御が可能であることに注意する必要があります。
完全に機能するPRANCEセットアップの有用性は、注意深く監視および制御された環境で大規模な個体群を急速に進化させる能力にあります。プレートベースのフォーマットは、PRANCEを、より小型の既製のタービドスタットベースのシステムを使用するような他の技術とは区別します14,15。プレートベースのセットアップにより、追加のロボット処理ステップとの統合が容易になるだけでなく、遠心分離機などの他の実験装置との互換性も容易になります。さらに、複数のインスタンスで加速進化を同時に行うことができるため、実験に新たな次元が加わり、多様で堅牢な結果が得られる可能性が高まります。PRANCEに不可欠なきめ細かな制御とフィードバックシステムは、実験の予測可能性と信頼性をさらに強化し、指向性進化技術の分野で大きな進歩を遂げました。ただし、この手法では、実行できる並列実験の数が制限されます。構成にもよりますが、PRANCEのセットアップは、通常、ロボットのピペッティング速度または利用可能なデッキスペースによって制限されます。
PRANCEに用いるのと同じハードウェアとソフトウェアを、バクテリオファージを使わない進化法にも適用できます。多濁水槽法11で実証されたように、この同じ装置を細菌のみに用いることができ、全ゲノム適応進化実験を可能にする。この適応性は、この装置の範囲を広げ、ロボット工学で加速された進化の新しい形への道を開きます。
Disclosures
著者らに開示すべき矛盾はない。
Acknowledgments
Emma Chory と Kevin Esvelt には、ハードウェアとソフトウェアのセットアップに関する支援とアドバイスをいただいたことに感謝します。Samir Aoudjane、Osaid Ather、Erika DeBenedictis は、Steel Perlot Early Investigator Grant の支援を受けています。この研究は、Cancer Research UK(CC2239)、UK Medical Research Council(CC2239)、Wellcome Trust(CC2239)から中核的な資金提供を受けているFrancis Crick Instituteの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
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- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
