Summary
Почти непрерывная эволюция с помощью фагов и роботов (PRANCE) — это метод быстрой и устойчивой эволюции белков. Робототехника позволяет распараллеливать эксперименты, осуществлять мониторинг в режиме реального времени и управлять обратной связью.
Abstract
Методы эволюции с ускорением робототехники повышают надежность и скорость эволюции с помощью управления обратной связью, улучшая результаты экспериментов по эволюции белков и организмов. В этой статье мы представляем руководство по настройке аппаратного и программного обеспечения, необходимого для реализации почти непрерывной эволюции с помощью фагов и робототехники (PRANCE). PRANCE сочетает в себе быструю молекулярную эволюцию на основе фагов с возможностью одновременного проведения сотен независимых эволюционных экспериментов с обратной связью. В этом документе будут описаны требования к аппаратному обеспечению и настройка PRANCE, включая прибор для работы с жидкостями, считыватель пластин, вспомогательные насосы, нагреватели и контейнеры, напечатанные на 3D-принтере. Мы опишем, как настроить робота для работы с жидкостями так, чтобы он был совместим с программным обеспечением с открытым исходным кодом на основе Python. Наконец, мы даем предложения по первым двум экспериментам, которые могут быть проведены с помощью недавно построенной системы PRANCE, которая использует свои возможности и подтверждает, что система готова к мультиплексной эволюции. Это руководство предназначено для того, чтобы служить настольной книгой для навигации по значительной настройке оборудования, связанной с проведением ускоренной эволюции робототехники.
Introduction
PRANCE представляет собой комбинацию двух мощных методов направленной эволюции. Во-первых, это PACE1, молекулярный метод, который связывает раунды диверсификации и отбора генов с быстрым жизненным циклом бактериофага M13, позволяя непрерывно происходить быстрым циклам эволюции в культуре жидких фагов. Этот отбор обусловлен использованием генной цепи, кодируемой плазмидой, которая связывает функцию эволюционирующего белка с экспрессией pIII, белка хвостового покрова M13, который необходим для размножения фагов, это проиллюстрировано на рисунке 1. На экспериментальном уровне непрерывное разведение жидкой фаговой культуры позволяет проводить непрерывную селекцию. Таким образом, строгость отбора может быть скорректирована как на уровне генной цепи, так и на экспериментальном уровне, контролируя скорость разведения фаговой культуры. Таким образом, PACE может быть применен к любой задаче биомолекулярной инженерии, для которой существует молекулярный сенсор, способный обнаруживать желаемую активность бактерий E. coli для индуцирования экспрессии pIII. Области применения включают эволюцию связывания белкас белком 2,3,4, связывания белка с ДНК5, растворимости белка6 и многочисленных специфических ферментативных функций7. Во-вторых, это Robotics-accelerated Evolution 8,9, которая использует контроллер обратной связи для устранения двух распространенных видов сбоев направленной эволюции: вымирания, которое происходит, когда окружающая среда слишком строга, и отсутствия эволюции, которое происходит, когда окружающая среда слишком мягкая. В отличие от серийного пассажа фага, как это делается в PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, «почти непрерывная» эволюция с ускорением робототехники включает в себя быстрое пипетирование, которое поддерживает культуры в средней логарифмической фазе, позволяя популяциям испытывать непрерывные циклы инфекции и размножения. Когда эти две технологии используются вместе, они называются PRANCE, что означает «почти непрерывная эволюция8 с помощью фагов и робототехники», которая обеспечивает надежную, мультиплексированную и быструю непрерывную эволюцию. PRANCE используется для эволюции полимераз, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз, а также для управления обратной связью во время этих эволюций с целью повышения их скорости и надежности8.
Существует несколько деталей аппаратной и программной настройки PRANCE, которые позволяют использовать бактериофаг на роботе для работы с жидкостями. Вместо использования программного обеспечения по умолчанию, предоставляемого производителем робота, мы используем программный пакет с открытым исходным кодом на основе Python11, который обеспечивает быстрое, параллельное выполнение и, таким образом, возможность поддерживать полунепрерывные биореакторы в середине логарифмической фазы. Время невмешательства исследователя может быть увеличено до нескольких дней, если несколько компонентов на палубе регулярно проходят самостерилизацию, и это достигается автоматическим управлением насосами, которые могут отбеливать и промывать эти компоненты. Перекрестное загрязнение фагами может быть устранено с помощью робота для работы с жидкостями, который не использует наконечники с принудительной посадкой и тщательной регулировкой параметров работы с жидкостью.
Protocol
1. Настройка оборудования
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен обзор аппаратных компонентов системы PRANCE, а на рисунке 3 приведены фотографии этих компонентов в собранном виде.
- Приобретите основное оборудование для системы PRANCE, включая прибор для работы с жидкостями, считыватель пластин и вспомогательные насосы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все системы PRANCE на сегодняшний день были внедрены на средних и крупных приборах для работы с жидкостями, оснащенных 8-канальными индивидуально адресуемыми манипуляторами дозатора, однопоршневым рычагом дозирования с 96 наконечниками, роботизированным захватом для перемещения пластин, встроенной моечной станцией для стерилизации наконечников и встроенным считывателем пластин, способным измерять поглощение и люминесценцию. - Сконфигурируйте стратегии нагрева в зависимости от модели и характеристик робота-манипулятора для работы с жидкостями. Используйте плитоноску с подогревом или робот-климат-контроль, опосредованный нагревателем.
- Установите станцию промывки наконечников, чтобы обеспечить повторное использование наконечников.
ПРИМЕЧАНИЕ: На сегодняшний день в системах PRANCE используются готовые моечные станции, хотя, в принципе, этот компонент может быть легко сконструирован из недорогих компонентов. - Установите источник бактериальной культуры, поддерживаемый в фазе каротажа, установив биореактор реального времени, работающий при температуре 37 °C, в качестве хемостата/турбидостата. В качестве альтернативы можно остановить логарифмическую бактериальную культуру объемом не менее 1 л, предварительно выращенную при 37 °C в логарифмической фазе (наружный диаметр600 от 0,25 до 0,45) при 4 °C в ближайшем холодильнике. Убедитесь, что культура, охлажденная или теплая, регулярно перемешивается с помощью шейкера или пластины для перемешивания, чтобы предотвратить осаждение.
- Сконфигурируйте предпочтительные насосы для роботизированной интеграции с необходимым программным обеспечением и драйверами. Внедрите программное обеспечение, позволяющее насосам подавать определенное количество жидкости порядка 10-100 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для насосов, используемых в этой реализации, и веб-сайт производителя для программного обеспечения, используемого для работы с этими насосами, и документацию по их настройке. Такое программное обеспечение для насосов, используемых в настройке PRANCE, проиллюстрированной в этой рукописи, предоставляется с открытым исходным кодом в следующем репозитории GitHub https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE требует, по крайней мере, коллектора с тремя насосами, способного перекачивать три отдельных канала (доставлять бактерии в бактериальный резервуар, доставлять отбеливатель в бактериальный резервуар и сливать бактериальный резервуар в отходы), при этом скорость каждого из них калибруется и контролируется независимо. В прошлом люди использовали насосы для аквариумов и массивы насосов для гидропоники, хотя, в принципе, можно использовать любой перистальтический насос, управляемый питоном. Основные функции включают в себя возможность использования роботизированного захвата для перемещения пластин в считыватель или из него, для инициирования измерений с помощью считывателя пластин и доступа к измерениям. - Напечатайте на 3D-принтере необходимые компоненты деки для системы PRANCE, включая, как минимум, бактериальный резервуар/распределительный коллектор («»), как указано в Дополнительном файле 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Закрепите эти контейнеры на платформе и откалибруйте их положение с помощью стандартного программного обеспечения Liquid Handling Robot. Подключите резервуар к насосной блоку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к документации производителя робота для получения подробной информации о том, как выполнить калибровку, так как она будет зависеть от робота. Наиболее подходящими являются 3D-принтеры на основе смолы; пример используемого типа принтера приведен в Таблице материалов; Стандартная прозрачная смола использовалась с настройками принтера по умолчанию. - Оборудуйте систему сливом, совместимым с местными рекомендациями по биобезопасности.
- Разместите лабораторную посуду на деке робота для работы с жидкостями, как показано на рисунке 4.
- Соблюдайте стандартные процедуры безопасности, включая использование стандартных лабораторных средств индивидуальной защиты (например, лабораторного халата, перчаток и средств защиты глаз).
2. Подготовка программного обеспечения
- Установите программное обеспечение с открытым исходным кодом, используемое для управления роботами для работы с жидкостями с помощью python11, доступное в репозитории PyHamilton с открытым исходным кодом. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- Измените и откалибруйте файл компоновки платформы для программного обеспечения робота Liquid Handling, чтобы точно отразить положение лабораторного оборудования на деке робота, как показано на рисунке 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь настройка использует программное обеспечение, предоставленное производителем робота для работы с жидкостями в соответствии с предоставленной документацией. - Запустите программу PRANCE robot method в режиме моделирования.
- Откройте командную строку с помощью следующих команд (в операционной системе Windows), как показано на рисунке 5.
Клавиша Windows + R
Введите: cmd - Измените родительский каталог на каталог программы robot method. Введите команду, как показано ниже, с правильным путем, как показано на рисунке 5.
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Вызовите программу метода робота с помощью Python с флагом режима симуляции, как показано на рисунке 5.
py robot_method.py --simulate - Нажмите кнопку PLAY в левом верхнем углу окна Robot Run Control , которое откроется при выполнении программы (рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем двигаться дальше, убедитесь, что метод PRANCE может работать без ошибок при моделировании. Становится очевидным, способен ли скрипт работать в режиме симуляции без ошибок, так как он выполнит несколько циклов основной программы без вызова системной обработки ошибок, что завершает основной цикл программы.
- Откройте командную строку с помощью следующих команд (в операционной системе Windows), как показано на рисунке 5.
- Запустите программу PRANCE robot method с отключенным режимом моделирования.
- Откройте командную строку в соответствующем каталоге (рисунок 5).
Клавиша Windows + R
Введите: cmd
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Вызовем программу метода robot с помощью Python без флагов:
py robot_method.py - Нажмите кнопку PLAY в левом верхнем углу окна Robot Run Control , которое откроется при выполнении программы.
- Убедитесь, что PyHamilton может управлять прибором и инициировать его инициализацию.
- Откройте командную строку в соответствующем каталоге (рисунок 5).
- Обеспечьте синхронизацию данных в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: На сегодняшний день в системах PRANCE используются сетевые компьютеры, которые позволяют пользователям отслеживать файлы журналов и графики измерений считывателей пластин в режиме реального времени с помощью программного обеспечения для удаленного обмена файлами или через удаленный рабочий стол. - Отключите автоматические обновления.
3. Предстартовая подготовка
- Убедитесь в том, что для всех культур, необходимых для запланированного прогона, имеются источники бактериальных культур в логарифмической фазе и что они активно перемешиваются для предотвращения осаждения. Используйте активный хемостат/турбидостат или охлажденную предварительно выращенную культуру с задержкой роста.
- Обновите файл манифеста контроллера, добавив подробную информацию о том, какой объем (диапазон 0-500 мкл) какой бактериальной культуры должен быть закачан в каждую лунку 96-луночной лагуны за цикл программы. Это позволяет точно контролировать эффективную скорость разбавления в лагуне. Это видно на рисунке 6.
- Рассчитайте скорость разбавления лагуны, используя электронную таблицу DilutionCalculator.xlsx (предоставленную в виде дополнительного файла 2), как показано на рисунке 7.
- Обновите файл robot_method.py, указав предполагаемую высоту лагуны. Чтобы следовать этому протоколу, используйте 14 (в миллиметрических единицах) в качестве значения по умолчанию для переменной fixed_lagoon_height в программе. Это соответствует объему лагуны в 550 мкл системы, но может отличаться в зависимости от конкретной используемой пластины на 96 лунок.
- Поместите чистые фильтруемые наконечники дозаторов на деку робота в отведенных для них местах и прикрепите штативы для наконечников к держателям наконечников, чтобы обеспечить устойчивость во время работы.
- Поместите чистые пластины глубиной 96 лунок на деку робота в отведенных для них местах.
- Установите чистые 96-луночные считывающие пластины на деку робота в отведенных для них местах.
- Убедитесь, что лоток считывателя пластин не занят ранее существовавшей пластиной.
- Убедитесь, что насосы подключены к компьютеру и назначены по правильному адресу.
- Очистите насосные линии, активировав насосы для перекачивания отбеливателя, а затем воды.
- Подсоедините насосные линии к соответствующим источникам и выходам, уделяя особое внимание тому, чтобы правильные линии были подключены к соответствующим бактериальным культурам.
- Наполните резервуары/ведра с отбеливателем/водой для промывки резервуара для бактерий и наконечника пипетки.
- Убедитесь, что все компоненты на палубе, особенно подвижные элементы, стабилизированы в отведенных для них положениях.
- Активируйте нагреватели в соответствии с местной реализацией до целевой температуры (т.е. 37 °C; Рисунок 8).
- Запустите файл протокола УФ-стерилизации в течение 10 минут, чтобы включить встроенную УФ-стерилизационную лампу в роботах для работы с жидкостями, поставляемых производителем (Рисунок 9).
- Нажмите кнопку PLAY в левом верхнем углу окна Robot Run Control , которое откроется при выполнении программы.
- Запустите файл с параметризованной опцией в течение 600 секунд.
- Убедитесь, что программное обеспечение Robot Run Control закрыто.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа метода робота завершит работу, если запущены какие-либо существующие экземпляры программного обеспечения Run Control.
4. Интеграция аппаратного и программного обеспечения
- Проведите «водный прогон», в ходе которого программа метода робота PRANCE запускается в течение ночи с заменой воды для всех культур и влажных реагентов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест можно проводить при комнатной температуре.- Завершите предварительную подготовку, как описано выше, с controller_manifest и robot_method настроены на эффективную скорость разбавления в лагуне 1 объем/ч, как показано на рисунке 5 и рисунке 6.
- Подсоедините линию «бактерии на входе» к емкости с водой, чтобы заменить бактерии логарифмической фазы для потока воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пищевой краситель может быть добавлен в источники воды, чтобы отслеживать движение жидкости во время эксперимента. - Откройте командную строку в соответствующем каталоге.
- Вызовите программу метода робота с помощью Python с новым флагом запуска (py robot_method.py --new) и введите запрошенные аргументы, включая имя файла журнала (TestRun), количество скважин в лагуне (16), продолжительность цикла (30), количество циклов на измерение пластины считывателя (4) и объем индуктора (объем индуктора равен 0 мкл для этого тестового прогона, во время эволюции, где мутагенез индуцируется арабинозой, это значение может составлять 10 мкл), как показано на рисунке 5.
- Нажмите кнопку PLAY в левом верхнем углу окна Robot Run Control , которая откроется при выполнении программы после предоставления аргументов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод PRANCE может быть запущен с использованием пустой пластины лагуны, и объем жидкости в лагунах уравновесится до конечного объема в течение первых шести циклов.
- Проведите «бактериальный прогон», при котором протокол PRANCE запускается в течение ночи только с бактериальной культурой при целевой температуре, но без бактериофага.
- Завершите предварительную подготовку, как описано выше, с controller_manifest и robot_method настройте эффективную скорость разбавления в лагуне 1 объем/ч, как показано на рисунке 5 и рисунке 6. Убедитесь, что нагреватели включены до целевой температуры 37 °C.
- Подключите линию «bacteria in» к выбранному источнику бактерий логарифмической фазы.
- Откройте командную строку в соответствующем каталоге.
- Вызовите программу метода robot на Python с новым флагом run (py robot_method.py --new) и введите запрошенные аргументы, как описано ранее в разделе 4.1.4.
- Нажмите кнопку PLAY в левом верхнем углу окна Robot Run Control , которая откроется при выполнении программы после предоставления аргументов.
- Проведите «тест на инфекцию», в ходе которого фаги, несущие эволюционировавший белок, должны размножаться на бактериях, нуждающихся в этом белке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее решите, какие лагуны будут засеяны фагами, а какие нет, и, таким образом, послужите в качестве лагун без фагов для обнаружения перекрестного загрязнения.- Завершите предварительную подготовку, как описано выше, с controller_manifest и robot_method настроен на эффективную скорость разбавления 1 объем/ч, как показано на рисунке 5 и рисунке 6. Убедитесь, что нагреватели включены до целевой температуры 37 °C.
- Подключите линию «bacteria in» к выбранному источнику бактерий логарифмической фазы.
- Откройте командную строку в соответствующем каталоге.
- Вызовите программу robot method на Python с новым флагом run (py robot_method.py --new) и введите запрошенные аргументы, как описано ранее в разделе 4.1.4.
- Нажмите кнопку PLAY в левом верхнем углу окна Robot Run Control , которая откроется при выполнении программы после предоставления аргументов.
- Перед добавлением бактериофага выполните метод в течение 2-3 ч, чтобы сбалансировать объем и наружный диаметр бактерий в лагунных пластинах.
- Инокулируют лагуны с фагами 106 БОЕ/мл бактериофага в конце цикла выполнения, когда программа находится в спящем режиме (например, 5,5 мкл аликвоты фага при 108 КОЕ/мл, как определено методом бляшечного анализа или кПЦР) в лагуну объемом 550 мкл.
- Запустите программу в течение ночи, а затем проверьте титр фагов в лунках лагуны с помощью бляшечного анализа или кПЦР.
Representative Results
Результаты теста на инфекцию
Этот тест выявит проблемы с бактериальным культивированием, клонированием и титрованием фагов, температурной стабильностью оборудования, настройками работы с жидкостями и интеграцией планшетного считывателя. Успешный тест на фаговую инфекцию выявит явную и быструю фаговую инфекцию в лагунах, инокулированных фагами, и отсутствие сигнала в лагунах без фагов. На рисунке 10 показаны некоторые репрезентативные результаты теста на фаговую инфекцию. Результаты экспериментов также могут быть сопоставлены с рисунками 1d и 1c данного документа PRANCE8, в зависимости от того, реализуется ли конфигурация «горячего PRANCE» (питаемого живым бактериальным турбидостатом) или «холодного PRANCE» (питаемого охлажденной культурой средней фазы). Этот тест может выявить несколько распространенных проблем. Проблемы с подготовкой бактериальной культуры часто могут привести к слабой или отсутствующей инфекции. Бактерии могут быть оптимально инфицированы фагом M13 только тогда, когда они находятся в средней логарифмической фазе и при температуре 37 °C. При других температурах и стадиях роста они демонстрируют более слабую экспрессию пилуса и, таким образом, менее восприимчивы к фаговой инфекции12. Инокуляция фагом с низким титром или фагом с мутациями в позвоночнике может привести к запаздыванию или отсутствию сигнала. В ходе этого теста будут выявлены проблемы с настройками усиления флуоресценции или люминесценции на пластинчатом считывателе.
Рисунок 1: Схема генетической цепи, работающей во время тестового запуска аппарата PRANCE. Когда РНК-полимераза Т7, кодируемая на геноме фага, инфицирует хозяина Escherichia coli , она транскрибируется и связывается с АР на промоторе Т7, что приводит к транскрипции белка фага pIII и белка luxAB, что, в свою очередь, способствует размножению фагов и получению люминесценции. Сокращения: PRANCE = Почти непрерывная эволюция с помощью фагов и робототехники; AP = вспомогательная плазмида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема физических компонентов системы PRANCE. В холодильнике хранятся перемешанные культуры, которые затем перемещаются на платформу робота с помощью множества насосов, в резервуар для бактерий, «». Робот для работы с жидкостями используется для перемещения бактериальных культур из «» с помощью дозаторной головки в колодцы для прогрева до температуры инкубации, а затем в лагуны, где происходит основная инкубация. Как накопительные колодцы, так и лагуны представляют собой стандартные глубоколуночные планшеты объемом 2 мл. Робот отбирает образцы в одноразовые пластины-считыватели, которые, в свою очередь, перемещаются в считыватель пластин для измерения. Аббревиатура: PRANCE = Почти непрерывная эволюция с помощью фагов и робототехники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Роботизированный аппарат PRANCE. (A) Настройка PRANCE. (I) HEPA-фильтр и внешний нагреватель. (II) Культуральный холодильник. (III) Основной корпус робота. (IV) Считыватель пластин. (V) Насосы и резервуары. (B) Корпус робота. (VI) Насосы для основной культуры. (VII) Резервуары для воды, отходов и отбеливателя. (VIII) Насосы омывателя. (C) Корпус робота. (IX) Манипулятор и захват робота-дозатора. (X) Наконечники для пипеток. (XI) Компонент, напечатанный на 3D-принтере, позволяет распределять культуру на роботе («вафля»). (XII) Планшеты для отбора проб в считывателе пластин. (XIII) Ведра для мытья наконечников. (XIV) «Лагуны»: культурные сосуды, на которых происходит эволюционное культивирование. Сокращения: PRANCE = Почти непрерывная эволюция с помощью фагов и робототехники; HEPA = высокоэффективный воздух с твердыми частицами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Макет палубы. (A) 3D-представление макета деки в программном обеспечении для управления роботом. (Б) Фотография компонентов палубы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Скриншот командной строки с примерами параметров (вверху) и управляющим программным обеспечением (внизу). Кнопка воспроизведения расположена в левом верхнем углу и может быть нажата мышью или нажата с помощью сенсорного экрана в зависимости от локальной реализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Файл манифеста контроллера, настроенный для тестовых запусков. Лагуны, содержащие культуру #0, будут находиться в колонках 1 и 3 96-луночной плиты. Остальные столбцы будут пустыми. Ряды A, B, D и E 96-луночной пластины отмечены в правом столбце для заражения фагом (1), остальные строки (0) являются контролем без фагов. Этот экземпляр манифеста контроллера приведет к тому, что программа будет разбавлять лагуну 210 мкл культуры каждый цикл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Расчет эффективной скорости разбавления лагуны с помощью электронной таблицы BlurionCalculator. Электронную таблицу DilutionCalculator см. в дополнительном файле 2. Как видно на этом рисунке, лагуна объемом 550 мкл, которая разбавляется 210 мкл свежей культуры каждые 30 минут цикла, с отбором 150 мкл проб для измерения считывающей пластины каждые четыре цикла, будет соответствовать эффективной скорости разбавления 1,0 объема лагуны/ч (после каждого 1 ч остается 50% исходной жидкости из лагуны в начале часа) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию цифра.
Рисунок 8: Роботизированная система нагрева. Нагреватель активируется при подключении источника питания, как показано красным кружком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Настройки протокола УФ-обеззараживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Измерение теста на инфекцию, запущенного в системе PRANCE. Во время прогона отбираются пробы и проводятся измерения люминесценции и поглощения. Для каждой лагуны измерения люминесценции делятся на соответствующие измерения поглощения и строятся в зависимости от времени. Лагуны, которые были заражены фагом, окрашены в зеленый цвет, в то время как неинфицированные контрольные лагуны окрашены в черный цвет. Аббревиатура: PRANCE = Почти непрерывная эволюция с помощью фагов и робототехники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: STL-файл для 3D-печати необходимых компонентов деки для системы PRANCE, включая, как минимум, бактериальный резервуар/распределительный коллектор («»). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2: Электронная таблица DilutionCalculator. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Discussion
Несмотря на усилия по стандартизации оборудования, с практической точки зрения, каждая конфигурация PRANCE будет отличаться из-за изменений в поставках оборудования, аппаратном обеспечении и версиях программного обеспечения. В результате, каждая конфигурация PRANCE имеет уникальные проблемы с настройкой, требующие всестороннего понимания назначения каждого компонента для эффективного модульного поиска и устранения неисправностей.
Этот метод описывает пошаговый протокол настройки и тестирования установленной системы PRANCE. Сначала мы сосредоточимся на критических элементах аппаратного и программного обеспечения, а затем подробно опишем основные шаги по подготовке и проведению серии тестовых запусков, которые определят, что система готова к PRANCE.
Существенной особенностью аппаратного обеспечения является оптимизация для снижения риска перекрестного загрязнения образцов при мультиплексированных экспериментах с использованием бактериофагов. Рекомендуется использовать исключительно фильтрованные наконечники с технологией роботизированных наконечников, которая совместима с повторным использованием наконечников и, как считается, сводит к минимуму аэрозоли, образующиеся при выбросе наконечника, избегая принудительной посадки наконечников. Надежная промывка наконечников в соответствии с этим протоколом допускает повторное использование наконечников, хотя адекватность этого должна быть подтверждена в рамках теста на заражение каждой системы. Самостерилизация также зависит от постоянной подачи воды и отбеливателя в систему. Они хранятся в резервуарах/ведрах, и если они истощаются, это приведет к нарушению самостерилизации и быстрому перекрестному загрязнению. Можно сделать фотографии резервуаров/ведер, сделанные до и после запуска программы, чтобы оценить скорость, с которой моечное оборудование потребляет воду и отбеливатель при определенной настройке насоса.
Еще одним ключевым элементом системы является поддержание фазы роста бактерий и температуры. Эксперименты PRANCE проводятся с использованием штамма бактерий E. coli S2060 (Addgene: #105064). Это штамм, содержащий F-плазмиду на основе K12, оптимизированный для уменьшения биопленок7. Кроме того, F-плазмида в этом штамме была отредактирована с добавлением кассеты резистентности к тетрациклину для поддержания плазмиды, luxCDE и luxR в дополнение к luxAB-опосредованному мониторингу люминесценции, а также lacZ под промотором фагового шока, чтобы обеспечить колориметрическую визуализацию бляшек. F-пилус, кодируемый F-плазмидой, необходим для фаговой инфекции M13. Таким образом, бактерии, используемые в PACE, должны культивироваться при 37 °C и в середине логарифмической фазы, когда экспрессируется F-pilus12 и возможно заражение, размножение и эволюция фагами M13. Для статического регулирования температуры можно использовать готовый плитонос с подогревом. Альтернативой является простой нагрев воздуха, поступающего в фильтр HEPA, с помощью недорогих нагревателей, хотя это не рекомендуется, так как это может привести к ускоренному износу оборудования. Кроме того, это ускоряет испарение вспомогательных жидкостей на палубе, таких как ведра для отбеливателя/воды и индуктор при использовании.
Калибровка пакетов программного обеспечения также важна для правильного функционирования системы. Расхождения между компоновкой программной платформы и фактической декой робота являются наиболее распространенной причиной сбоев системы во время работы. Регулярная калибровка вспомогательных насосов, которые подают бактериальные культуры, отбеливают и сливают в систему, имеет жизненно важное значение, поскольку использование перистальтических насосов может привести к износу трубок и изменению объема жидкости.
Тест на прогон воды быстро выявит ряд распространенных проблем с настройкой, включая неправильные настройки работы с жидкостями, утечки жидкости/неисправные соединения и нестабильность программного обеспечения. Успешный прогон воды не покажет неожиданных утечек жидкости и будет работать стабильно без ошибок в течение ночи. Существует ряд распространенных проблем, которые могут возникнуть во время прогона водой, такие как невыполнение определенных этапов работы с жидкостью, капание из пипеток и остановка протокола в середине прогона. В случае невыполнения определенных действий по работе с жидкостями убедитесь, что установлены все классы жидкостей. В них указаны соответствующие скорости вязкости и пипетирования, которые настраиваются в программном обеспечении для управления роботом, предоставляемом производителем. Если пипетки капают, важно, чтобы роботизированный манипулятор был настроен правильно, чтобы обеспечить чистое пипетирование и исключить перекрестное загрязнение фагами. Для успешного роботизированного пипетирования требуется, помимо правильных классов жидкостей, правильная высота расположения деки всего лабораторного оборудования и соответствующие смещения высоты пипетирования, указанные в программе метода робота PRANCE. Эти смещения высоты могут потребовать прямой регулировки. Если протокол останавливается на полпути, часто это будет вызвано широким спектром ошибок, которые указывают на то, что файл макета колоды может не соответствовать фактической конфигурации колоды.
Тест только на бактерии выявит проблемы с настройками считывателя пластин и визуализацией данных в режиме реального времени, проблемы с чрезмерной концентрацией отбеливателя или недостаточным ополаскиванием, а также стабильностью температуры. Успешный прогон только с бактериями будет демонстрировать равновесие поглощения лагуны в течение первых трех циклов, за которым последует стабильная абсорбция в течение всего прогона. Кроме того, он может выявить несколько распространенных проблем. Это первый шаг, на котором наносятся данные, сгенерированные считывателем пластин. Данные в базе данных считывателя пластин могут быть неправильно сохранены или неправильно отображены на графике. Если бактерии не могут уравновесить свою абсорбцию, это может указывать на то, что концентрация отбеливателя слишком высока. Чрезмерное количество отбеливателя или недостаточное мытье может стерилизовать весь эксперимент, а не только лабораторную посуду. При подозрении на это можно использовать полоски для обнаружения отбеливателя для проверки лагуны. Стабильность температуры культуры можно проверить с помощью термометрического пистолета.
Успешный тест на заражение указывает на то, что система готова к запуску PRANCE. Тест на инфекцию может быть проведен путем инокуляции подгруппы лагун, содержащих бактериальную культуру. Эти бактерии будут экспрессировать pIII при заражении соответствующим фагом, у которого отсутствует ген pIII (ΔgIII), что позволяет размножаться фагам. Одной из возможных комбинаций для тестирования является использование бактерий S2060, трансформированных плазмидой, экспрессирующей pIII, под промотором фагового шока с любым фагом ΔgIII. Мы рекомендуем использовать фаг ΔgIII, несущий РНК-полимеразу Т7 дикого типа, с бактериями S2060, трансформированными с помощью дополнительной плазмиды, в которой pIII и luxAB управляются промотором Т7 (плазмидой pJC173b13), как показано на рисунке 1. Это также позволяет контролировать инфекцию с помощью считывателя пластин во время тестового запуска. Окончательным доказательством успешности теста на инфекцию и отсутствия перекрестного загрязнения будет титрование фагов тестовых и контрольных лагун. При использовании репортера люциферазы увеличение люминесценции только в тестовых лунках, как показано на рисунке 3, также является показателем успешной фаговой инфекции и размножения. Золотым стандартом количественного определения титра фагов является анализ бляшек7. Существует также протокол количественного определения М13 с помощью кПЦР7 , который может быть более быстрым, хотя он не делает различий между инфекционными и неинфекционными фаговыми частицами и, таким образом, может завышать титры.
Основная программа ссылается на файл манифеста, это обычный текстовый файл базы данных, который диктует объем разведения за цикл каждой размножающейся культуры, а также выбор любого количества потенциального сырья для бактериальной культуры, которое может отличаться строгостью отбора. Таким образом, файл манифеста определяет многие параметры выполнения PRANCE. Следует отметить, что этот файл может быть отредактирован во время работы как оператором, так и системой, что означает, что может быть осуществлено ручное или автоматическое управление с обратной связью.
Полезность полностью функционирующей системы PRANCE заключается в ее способности быстро эволюционировать большие популяции в тщательно контролируемой и контролируемой среде. Формат на основе пластин отличает PRANCE от других методов, таких как использование небольших готовых систем на основе турбидостата14,15. Установка на основе планшета не только облегчает интеграцию с дополнительными роботизированными этапами обработки, но и совместима с другими лабораторными приборами, такими как центрифуги. Более того, возможность проводить ускоренную эволюцию одновременно в нескольких экземплярах привносит в эксперимент дополнительное измерение, повышая перспективу получения разнообразных и надежных результатов. Детальная система управления и обратной связи, неотъемлемая часть PRANCE, еще больше повышает предсказуемость и надежность эксперимента, отмечая значительный прогресс в области методов направленной эволюции. Однако этот метод ограничен в количестве параллельных экспериментов, которые он может проводить. В зависимости от конфигурации настройки PRANCE обычно ограничены либо скоростью роботизированного дозатора, либо доступным пространством на деке.
То же самое аппаратное и программное обеспечение, используемое для PRANCE, может быть применено и к методам эволюции, не использующим бактериофаг. Как было продемонстрировано в методе11 многих турбин, этот же инструмент может быть использован исключительно для бактерий, что позволяет проводить эксперименты по адаптивной эволюции всего генома. Эта адаптивность расширяет область применения этого инструмента, прокладывая путь для новых форм эволюции с ускорением робототехники.
Disclosures
У авторов нет конфликтов, которые можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Благодарим Эмму Чори и Кевина Эсвельта за помощь и советы по настройке аппаратного и программного обеспечения. Самир Ауджан, Осаид Атер и Эрика ДеБенедиктис получают грант Steel Perlot Early Investigator Grant. Эта работа была поддержана Институтом Фрэнсиса Крика, который получает основное финансирование от Cancer Research UK (CC2239), Совета по медицинским исследованиям Великобритании (CC2239) и Wellcome Trust (CC2239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
