Summary
Dit artikel belicht de werkzaamheid van de optische coherentie-elastografie (OCE)-techniek bij het snel en niet-destructief karakteriseren van elastische eigenschappen van biofilm. We verduidelijken kritische OCE-implementatieprocedures voor nauwkeurige metingen en presenteren Young's moduluswaarden voor twee granulaire biofilms.
Abstract
Biofilms zijn complexe biomaterialen die bestaan uit een goed georganiseerd netwerk van microbiële cellen die zijn ingekapseld in zelfgeproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS). Dit artikel geeft een gedetailleerd overzicht van de implementatie van optische coherentie-elastografie (OCE)-metingen op maat voor de elastische karakterisering van biofilms. OCE is een niet-destructieve optische techniek die het mogelijk maakt om de microstructuur, morfologie en visco-elastische eigenschappen van gedeeltelijk transparante zachte materialen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie lokaal in kaart te brengen. We bieden een uitgebreide gids met details over de essentiële procedures voor de juiste implementatie van deze techniek, samen met een methodologie om de bulk Young's modulus van granulaire biofilms te schatten op basis van de verzamelde metingen. Deze bestaan uit de systeemconfiguratie, data-acquisitie en nabewerking. In de discussie verdiepen we ons in de onderliggende fysica van de sensoren die in OCE worden gebruikt en verkennen we de fundamentele beperkingen met betrekking tot de ruimtelijke en temporele schalen van OCE-metingen. We sluiten af met mogelijke toekomstige richtingen voor het bevorderen van de OCE-techniek om elastische metingen van omgevingsbiofilms mogelijk te maken.
Introduction
Bij afvalwaterzuivering en terugwinning van watervoorraden worden steeds vaker nuttige biofilms in aangehechte groeireactoren gebruikt om microben in staat te stellen ongewenste verontreinigende stoffen, zoals organisch materiaal, stikstof en fosfaat, om te zetten in gestabiliseerde vormen die gemakkelijk uit het water kunnen worden verwijderd. In deze systemen hangt de emergente functie van de biofilm, namelijk biochemische transformaties, nauw samen met de diversiteit van de microben die erin verblijven en de voedingsstoffen die deze microben ontvangen2. Dienovereenkomstig kan de voortdurende groei van biofilm een uitdaging vormen voor het handhaven van een consistente reactorfunctionaliteit, omdat de nieuwe biofilmgroei de algehele metabolische processen, massaoverdrachtskenmerken en samenstelling van de gemeenschap van de biofilm kan veranderen. Het zoveel mogelijk stabiliseren van de biofilmomgeving kan bescherming bieden tegen dergelijke veranderingen3. Dit omvat het zorgen voor een consistente stroom van voedingsstoffen en het stabiel houden van de structuur van de biofilm met een constante dikte4. Door de stijfheid en fysieke structuur van de biofilm te monitoren, kunnen onderzoekers inzicht krijgen in de algehele gezondheid en het functioneren van de biofilm.
Biofilms vertonen visco-elastische eigenschappen 5,6,7. Deze visco-elastische aard resulteert in een combinatie van een onmiddellijke en langzame, tijdsafhankelijke vervorming als reactie op externe mechanische krachten. Een uniek aspect van biofilms is dat ze, wanneer ze worden blootgesteld aan substantiële vervorming, reageren als stroperige vloeistoffen. Omgekeerd is hun respons bij lichte vervorming vergelijkbaar met vaste stoffen5. Bovendien is er binnen dit kleine vervormingsgebied een vervormingsbereik waaronder biofilms een lineaire kracht-verplaatsingsrelatie vertonen 5,6,7. Vervormingen binnen dit lineaire bereik zijn optimaal voor het beoordelen van de mechanische eigenschappen van biofilm, omdat deze reproduceerbare metingen opleveren. Verschillende technieken kunnen de elastische respons binnen dit bereik kwantificeren. Optische coherentie-elastografie (OCE) is een opkomende techniek die wordt aangepast voor het analyseren van biofilms in dit lineaire bereik (spanningen in de orde van grootte van 10-4-10-5)8,9.
De meest gevestigde toepassing van OCE tot nu toe is op biomedisch gebied, waar de techniek is toegepast om biologische weefsels te karakteriseren die alleen oppervlakkige optische toegang nodig hebben. Li et al. gebruikten bijvoorbeeld OCE om de elastische eigenschappen van huidweefsel te karakteriseren10. Andere auteurs karakteriseerden de anisotrope elastische eigenschappen van varkens- en menselijke hoornvliesweefsels en hoe ze worden beïnvloed door intraoculaire druk 11,12,13,14,15,16. Enkele voordelen van de OCE-methode voor het bestuderen van biofilms zijn dat deze niet-destructief is en een ruimtelijke resolutie op mesoschaal biedt, dat er geen monstervoorbereiding nodig is en dat de methode zelf snel is; Het biedt co-geregistreerde metingen van fysieke structuur en elastische eigenschappen (bijv. porositeit, oppervlakteruwheid en morfologie)8,9,17,18.
De OCE-methode meet de lokale verplaatsing van voortplantende elastische golven in een monster met behulp van fasegevoelige optische coherentietomografie (OCT). OCT is een optische interferometer met lage coherentie die lokale veranderingen in de verplaatsing van het monster omzet in een intensiteitsverandering die wordt geregistreerd met een optische spectrometer. De OCT-techniek is ook gebruikt in biofilmonderzoek voor de karakterisering van de structuur op mesoschaal, de porositeitsverdeling in drie dimensies en de vervorming van de biofilm 17,19,20,21. Bovendien schatten Picioreanu et al. de mechanische eigenschappen van biofilm met behulp van vloeistof-structuurinteractie inverse modellering van OCT-dwarsdoorsnedevervormingsbeelden22.
Aan de andere kant leveren OCE-metingen, in combinatie met inverse elastodynamische golfmodellering, de golfsnelheid van elastische golven in het monster op, wat de karakterisering van de elastische en visco-elastische eigenschappen van het monster mogelijk maakt. Onze groep paste de OCE-techniek aan voor kwantitatieve meting van biofilmelastische en visco-elastische eigenschappen 8,9,18 en valideerde de techniek tegen afschuifreometriemetingen in agarosegelplaatmonsters18. De OCE-benadering biedt nauwkeurige en betrouwbare schattingen van de biofilmeigenschappen, aangezien de gemeten elastische golfsnelheid gecorreleerd is met de elastische eigenschappen van het monster. Bovendien kan het ruimtelijke verval van de elastische golfamplitude direct worden gecorreleerd met de visco-elastische eigenschappen als gevolg van viskeuze effecten in het materiaal. We hebben OCE-metingen gerapporteerd van visco-elastische eigenschappen van bacteriële biofilms in gemengde cultuur gekweekt op coupons in een roterende ringvormige reactor (RAR) en granulaire biofilms met complexe geometrieën met behulp van elastodynamische golfmodellen18.
De OCE-techniek is ook een krachtig alternatief voor traditionele reometrie18die wordt gebruikt voor visco-elastische karakterisering. Reometriemethoden zijn het meest geschikt voor monsters met vlakke geometrie. Als zodanig kunnen granulaire biofilms, die willekeurige vormen en oppervlaktemorfologieën hebben, niet nauwkeurig worden gekarakteriseerd op een reometer 8,23. Bovendien kunnen reometriemethoden, in tegenstelling tot OCE, een uitdaging zijn om aan te passen voor real-time metingen, bijvoorbeeld tijdens biofilmgroei in flowcellen24,25.
In dit artikel laten we zien dat OCE-metingen van de frequentie-onafhankelijke golfsnelheid van oppervlaktegolven kunnen worden gebruikt om de elastische eigenschappen van biofilm te karakteriseren zonder dat er ingewikkelde modellen nodig zijn. Deze ontwikkeling zal de OCE-benadering toegankelijker maken voor de bredere biofilmgemeenschap voor het bestuderen van de mechanische eigenschappen van biofilm.
Figuur 1 toont een schematische weergave van het LGO-systeem dat in dit onderzoek is gebruikt. Het systeem bevat verschillende instrumenten, waaronder een commercieel spectraal-domein fasegevoelig OCT-systeem, een vertragingsgenerator, een functiegenerator en een piëzo-elektrische transducer. Het OCT-systeem werkt volgens het principe van interferometrie door gebruik te maken van een breedbandlichtbron met een middengolflengte van 930 nm. De verzamelde lichtintensiteit, die gecorreleerd is met ingewikkelde structurele details in het monster, wordt geanalyseerd in de nabewerkingseenheid en vervolgens omgezet in een dwarsdoorsnedebeeld van het monster - gewoonlijk een OCT-beeld genoemd. De OCT-beeldvormingsdiepte hangt af van de ernst van de optische verstrooiing in het monster die het gevolg is van lokale variatie in de brekingsindex en is beperkt tot 1-3 mm in biologische weefsels en biofilms. Aangezien de optische fase in het monster en de interferentie-intensiteit worden gemoduleerd door beweging, kan de OCT worden gebruikt om de lokale verplaatsing van het monster te detecteren. We maken gebruik van de verplaatsingsgevoeligheid van de OCT in de OCE-methode om het steady-state verplaatsingsveld van elastische golven in het monster te volgen. In het bijzonder geeft de functiegenerator een sinusvormige spanning af om de piëzo-elektrische transducer aan te drijven. De transducer rekt op zijn beurt uit en trekt samen met een oscillerende tijdgeschiedenis. De oscillerende verplaatsing van de transducer geeft een sinusvormige kracht op het monsteroppervlak door een 3D-geprinte wigpunt aan de top van de transducer, wat leidt tot het genereren van harmonische elastische golven in het monster. De wigpunt maakt licht contact met het monster, zodat het monster intact blijft nadat de actuator van het monsteroppervlak is teruggetrokken. Om de lokale verplaatsing in het monster vast te leggen, worden bij elke pixel in het monster aangrenzende dieptescans gemaakt, gescheiden door een vaste tijdsvertraging. Het optische faseverschil tussen opeenvolgende scans op elk pixelpunt is evenredig met de lokale verticale verplaatsing op hetzelfde punt. Synchronisatie tussen de verplaatsing van de transducer en de scanoptiek in het OCT-systeem wordt bereikt door een triggerpuls die afkomstig is van de functiegenerator en wordt vertraagd in de vertragingsgenerator. Deze synchronisatiestap vergemakkelijkt het verkrijgen van consistente dwarsdoorsnedebeelden van de lokale optische faseverdeling in het monster. Deze beelden zijn recht evenredig met de lokale verticale harmonische verplaatsing in het monster en staan bekend als het OCE-beeld. OCE-beelden worden verkregen bij verschillende activeringsfrequenties van de transducer om de elastische golflengte en golfsnelheid als functie van de frequentie te verkrijgen. De gemeten golfsnelheden worden geanalyseerd met een elastodynamisch model om de elastische eigenschappen van het monster te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Installatie van het systeem
- Verzamel de systeemcomponenten, waaronder het commerciële OCT-systeem (basiseenheid, standaard, beeldvormingskop en computer), golfvormgenerator, transducer, vertragings-/pulsgenerator, een schakelaar met BNC-aansluitingen, BNC-kabels en -adapters, optische palen en klemmen.
- Sluit het synchronisatiesignaal van de functiegenerator aan op een schakelaar. Sluit de andere poort van de switch aan op de vertragingsgenerator.
- Sluit de uitgang van de functiegenerator aan op de transducerkabels.
- Sluit de uitgangen van de vertragingsgenerator aan op het triggerkanaal aan de achterkant van de OCT-basiseenheid. Het uitgangssignaal van de vertragingsgenerator is een triggerpuls om de beweging van de scanoptiek in het OCT-systeem op gang te brengen.
- Schakel de systeemcomponenten in (OCT-basiseenheid, computer, functiegenerator en vertragingsgenerator) en start de OCT-software.
- Configureer de vertragingsgenerator om een transistor-transistor logisch triggersignaal naar de OCT-basiseenheid te sturen. Raadpleeg de handleiding van het OCT-systeem voor de vereisten voor het triggersignaal.
- Plaats de transducer onder de OCT-lens. De transducer heeft een 3D-geprinte wigpunt die op een van de uiteinden is gelijmd en die dient als lijnbron voor elastische golven.
2. Beeldacquisitie
- Selecteer in de OCT-software de Doppler-acquisitiemodus en schakel de externe trigger in.
- Plaats de korrelige biofilm onder de lens in een monsterhouder en beweeg deze met behulp van een transducerfase naar de punt van de transducer. Zorg ervoor dat de transducer voorzichtig contact maakt met het monsteroppervlak, zoals weergegeven in afbeelding 2. We gebruikten twee granulaire biofilms (ook wel granulair slib genoemd) met verschillende nominale diameters (4,3 mm en 3,3 mm). Deze selectie is gemaakt om de impact van de grootte van biofilm op de mechanische eigenschappen ervan te onderzoeken. Deze werden commercieel verkregen.
OPMERKING: De monsterhouder die in dit onderzoek wordt gebruikt, bestaat uit een 3D-geprinte plastic plaat met meerdere halfronde inkepingen. Deze houder staat geen metingen onder inheemse omstandigheden toe. Daarom hebben we tijdens de metingen water uit de natuurlijke omgeving ingebracht om te voorkomen dat het monster uitdroogt. - Geef het scangebied op door te klikken op het begin- en eindpunt van de interesselijn (golfvoortplantingspad) in het voorbeeldmonitorvenster. Centreer deze lijn ten opzichte van de transducertip en zorg ervoor dat deze loodrecht op de rand van de tip staat.
- Specificeer het aantal pixels langs het scangebied en de diepte van de steekproef en verhoog het aantal B-scans (2D-dwarsdoorsnedebeelden) dat moet worden opgenomen om de signaal-ruisverhouding van de OCE-beelden te verbeteren. De gepresenteerde resultaten zijn verkregen met behulp van 1523 pixels langs het scanpad en 1024 pixels langs de diepte. In totaal zijn er 50 B-scans gemaakt.
- Klik op de knop Scannen en zet de schakelaar AAN. De OCT- en OCE-afbeeldingen zouden op het scherm moeten verschijnen. Activeer de schakelaar binnen de triggertime-outtijd en de voorbereidingstijd van de scan.
- Zorg ervoor dat de referentie-intensiteit binnen het optimale bereik ligt en plaats het monster binnen het brandpuntsgebied van het OCT-microscoopobjectief. Bij een goed scherpgesteld monster moet de bovenrand dicht bij de bovenkant van de afbeelding liggen.
- Pas de fasecontour in de OCE-afbeelding op de werkbalk van het beeldscherm aan door de hogere waarde van de kleurenbalk aan de linkerkant te verhogen en de lagere waarde van de kleurenbalk aan de rechterkant te verlagen. Dit verhoogt het randcontrast.
- Configureer de functiegenerator om een sinusvormige spanning met één frequentie te produceren door op de sinusknop in het voorpaneel te drukken en specificeer de startexcitatiefrequentie voor de metingen. De metingen in dit onderzoek beginnen bij 4 kHz en eindigen bij 9,6 kHz. Schakel de Output-connector in door op de Output-toets te drukken.
- Stel een acceptabele spanning in voor de meting. Deze waarde moet de zichtbaarheid van de rand maximaliseren, maar ook fase-omwikkeling voorkomen. Voor de biofilms in dit onderzoek en het frequentiebereik van de metingen resulteert een spanning tussen 5 en 10 V doorgaans in een fasekaart met een goed contrast.
- Verkrijg de OCT- en OCE-afbeeldingen door op de knop Opnemen te klikken.
- Herhaal de metingen op verschillende frequenties om dwarsdoorsnedebeelden te verkrijgen van het elastische golfveld met verschillende golflengten (of randperioden).
3. Beeldanalyse
- Verkrijg de fysieke grootte van de pixels. De fysieke pixelgrootte in x wordt verkregen door het gezichtsveld in de x-richting te delen door de beeldgrootte in de x-richting en vervolgens te vermenigvuldigen met een factor twee. De fysieke pixelgrootte in z wordt verkregen door het gezichtsveld in de z-richting te delen door de beeldgrootte in de z-richting. Het gezichtsveld en de waarden voor de afbeeldingsgrootte worden opgeslagen in de structuurarray met de afbeeldingsinformatie die toegankelijk is met de OCTFileOpen-functie in de MATLAB SDK in het ThorImageOCT-pakket.
- Verkrijg de OCT- en OCE-matrices met behulp van respectievelijk de functies OCTFileGetIntensity en OCTFileGetPhase en neem het gemiddelde van de opgenomen frames. Deze functies zijn beschikbaar in de MATLAB SDK in het ThorImageOCT-pakket.
- Verkrijg de pixellocaties van de bovenrand van het voorbeeld door de afbeelding te binariseren en de witte pixels van boven naar beneden voor elke kolom te detecteren.
- Extraheer de faseverdeling van het OCE-beeld langs deze rand met behulp van de improfile-functie en bereken de cumulatieve booglengte in reële afmetingen. Bereken de booglengte door de cumulatieve som te nemen van de norm van geschaalde verschillen tussen opeenvolgende punten in de x- en z-richting.
- Bereken de ruimtelijke snelle Fouriertransformatie van de gemeten OCT-faseverdeling (d.w.z. op basis van de OCE-afbeeldingen) met betrekking tot de cumulatieve booglengte met behulp van de plombfunctie.
- Bepaal de locatie van de piek in het spectrum. Deze locatie vertegenwoordigt de ruimtelijke frequentie van de golf. Bereken de golfsnelheid (of fasesnelheid) uit de verhouding tussen de excitatiefrequentie van de transducer (eenheden van Hz) en de ruimtelijke frequentie (eenheid van inverse lengte).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit onderzoek hebben we gebruik gemaakt van granulaire biofilms (ook bekend als granulair slib), die commercieel werden verkregen. Korrels zijn bolvormige biofilms die worden gevormd door zelfaggregatie, wat betekent dat ze geen drager of oppervlak nodig hebben om op te groeien26. Figuur 3A toont een representatief cross-sectioneel OCT-beeld dat ontstaat door de ruimtelijke variatie van de lokale brekingsindex in een granulaire biofilm. De biofilm heeft een nominale diameter van 3 mm. Sommige van de interne kenmerken, waaronder poriën en holtes die zich dicht bij het oppervlak van het monster bevinden, zijn te zien in de afbeelding. Verhoogde optische verstrooiing over de diepte van het monster voorkomt dat de OCT-lichtbron het midden van het monster bereikt, waardoor het centrale gebied verstoken blijft van waarneembare informatie. Figuur 3B toont het dwarsdoorsnede OCE-beeld van het monster voor een transducer-excitatiefrequentie van 5,1 kHz. Het lokale contrast in het beeld is gecorreleerd met de lokale verticale verplaatsing die wordt veroorzaakt door de zich voortplantende elastische golf in het monster. De fysieke afstand van de randen langs het voortplantingspad komt overeen met de golflengte van de elastische oppervlaktegolf. De oppervlaktegolf plant zich voort in de buurt van het monsteroppervlak en heeft een penetratiediepte die dicht bij de golflengte ligt. De ruimtelijke omvang van de verplaatsing van de oppervlaktegolven is niet te zien in het beeld vanwege de beperkte optische penetratie van de OCT-lichtbron in het monster. De optische faseverdeling langs het voortplantingspad van elastische golven (figuur 4A) wordt gebruikt om de ruimtelijke frequentie van de oppervlaktegolf te bepalen. De ruimtelijke frequentie wordt verkregen door de snelle Fouriertransformatie (FFT; Figuur 4B) van de gegevens en het selecteren van de frequentie waarbij de grootte van het FFT-spectrum het grootst is.
Het is van cruciaal belang om een functiegeneratorspanning van voldoende grootte te selecteren om een randpatroon te produceren dat een optimaal contrast in het OCE-beeld vertoont. Te hoge spanningen moeten echter worden vermeden, omdat dit kan leiden tot fase-omwikkeling in het OCE-beeld, zoals geïllustreerd in figuur 5A. Fasewikkeling ontstaat doordat het optische faseverschil in de meting beperkt is tot het interval tussen -π en π. Wanneer de fase een van deze limieten overschrijdt, wordt deze gevouwen tot de tegenovergestelde limiet, waardoor een discontinue faseverdeling ontstaat. Bijgevolg ontstaat de noodzaak van gefaseerd uitpakken, wat uitdagingen met zich meebrengt en mogelijke onnauwkeurigheden kan introduceren. Een andere factor waarmee rekening moet worden gehouden voor nauwkeurige golfmetingen is het aantal randen dat aanwezig is in het OCE-beeld. Bij lage transducerfrequenties, weergegeven in figuur 5B, wordt een volledige oscillatiecyclus van de oppervlaktegolf mogelijk niet volledig opgevangen vanwege de kleine omvang van de korrel, en het FFT-spectrum kan foutieve schattingen opleveren voor de ruimtelijke frequentie (of inverse golflengte). Een andere bron van fouten in de schatting van de ruimtelijke frequentie is de aanwezigheid van ruimtelijk overlappende elastische golfmodi, zoals oppervlaktegolven en bulkschuifgolven, in het OCT-beeld. Deze golfmodi vermengen zich, waardoor gecompliceerde interferentiepatronen ontstaan die misschien moeilijk te analyseren zijn. De aanwezigheid van verschillende golfmodi buiten oppervlaktegolven kan interferentie-effecten in de buurt van de transducer veroorzaken, afhankelijk van het specifieke monster, de excitatiefrequentie en de amplitude. Figuur 6 is een voorbeeld van een OCE-beeld verkregen met een excitatiefrequentie van 5,5 kHz, waarbij een bulkschuifgolf nabij het lokale excitatiepunt interfereert met het oppervlaktegolfveld. Figuur 7A toont een faseverdeling die afwijkt van het vervallende sinusgolfpatroon dat wordt waargenomen in figuur 4A, toegeschreven aan de combinatie van golfmodi. Bijgevolg vertoont de resulterende FFT een bredere piek, zoals weergegeven in figuur 7B. Hetzelfde fenomeen kan zich voordoen in de buurt van defecten zoals holtes of regio's met duidelijke variaties in elastische/visco-elastische eigenschappen. In deze gebieden wordt het lokale verplaatsingsveld gewijzigd als gevolg van interferentie van de invallende of oppervlaktegolf en de verstrooide golven van het defect.
We berekenden de golfsnelheid voor de oppervlaktegolf bij frequenties tussen 4,0 en 9,6 kHz voor twee granulaire biofilms met verschillende nominale diameters (4,3 mm en 3,3 mm). De golfsnelheidsgrafieken worden dispersiecurven genoemd. Voor de gebruikte instellingen duurde elke dispersiemeting ongeveer 15 minuten. Binnen het geselecteerde frequentie-interval zijn meerdere cycli van het sinusvormige verplaatsingsprofiel aanwezig in de OCE-beelden, waardoor een nauwkeurige bepaling van de ruimtelijke frequentie naast een opmerkelijk fasecontrast mogelijk is. Figuur 8 illustreert de verkregen dispersiecurves. Deze curven vertegenwoordigen de gemiddelde dispersiecurven voor drie locaties binnen elk monster. De oppervlaktegolfsnelheden benaderen een constante waarde, de Rayleigh-golfsnelheid genoemd, cR, die gerelateerd is aan de schuifmodulus van het monster door de relatie,
cR = ((0,862 + 1,14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
waarin G de afschuifmodulus is, r de massadichtheid en ν de Poisson-verhouding27,28. Het is constant omdat de penetratiediepte van de elastische golf korter is dan de diameter van het monster. In wezen reist de elastische golf dicht bij het oppervlak van het monster met een golfsnelheid die recht evenredig is met het kwadraat van de Young's modulus28. Door meetruis is de golfsnelheid echter niet helemaal constant in dit frequentiebereik. We nemen het gemiddelde van de golfsnelheden voor frequenties tussen 6,0 en 9,6 kHz voor de kleinere steekproef en tussen 4,0 en 9,6 kHz voor de grotere steekproef. Deze gemiddelde golfsnelheid wordt vervolgens gebruikt voor het schatten van de Young-modulus van de steekproef.
We gaan ervan uit dat het monster niet samendrukbaar is vanwege het hoge watergehalte. Als zodanig is ν = 0,5. CR is dus direct gerelateerd aan E = 3G voor een onsamendrukbare vaste stof, waarbij E de Young-modulus van het monster27,28 is. De stippellijnen in figuur 8 geven de Rayleigh-golfsnelheden voor de verschillende monsters weer. We gaan uit van een biofilmsamenstelling die voornamelijk uit water bestaat, wat een dichtheid van 1000 kg/m3 oplevert. Bijgevolg is de berekende Young's modulus van de granulaire biofilms 85 kPa en 205 kPa voor de granulaire biofilms met nominale diameters van respectievelijk 4,3 mm en 3,3 mm. Deze meting bevestigt het vermogen van de techniek om mechanische verschillen in eigenschappen tussen de biofilms te onderscheiden.
Figuur 1: Opstelling van optische coherentie-elastografie. Het schema van het hier gebruikte systeem is weergegeven in de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gemonteerd monster. De korrelige biofilm wordt op de monsterhouder geplaatst terwijl de transducer er voorzichtig contact mee maakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afbeeldingen van de LGO en de LGO van de granulaire biofilm. (A) Afbeelding van de LGO. (B) OCE-beeld voor een oppervlaktegolf die zich voortplant bij 5,1 kHz met een goed randcontrast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Faseverdeling en FFT. Voor de afbeelding in figuur 3B, (A) de verdeling van het faseverschil langs de bovenrand van het monster en (B) FFT van de verdeling van het faseverschil met een smalle piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: OCT- en OCT-beelden van granulaire biofilm. (A) OCE-beeld voor een oppervlaktegolf die zich voortplant bij 5,1 kHz en faseomwikkeling vertoont. (B) OCE-beeld voor een oppervlaktegolf die zich voortplant bij 1,3 kHz zonder een volledige cyclus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: OCE-afbeelding met een combinatie van modi. Deze afbeelding is van een andere locatie van het monster en illustreert de combinatie van modi voor een golf die zich voortplant op 5,5 kHz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Faseverdeling en FFT. Voor de afbeelding in figuur 6, (A) de verdeling van het faseverschil langs de bovenrand van het monster en (B) FFT van de verdeling van het faseverschil met een bredere piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Dispersiecurves. De golfsnelheid in twee monsters met verschillende groottes wordt weergegeven op verschillende frequenties met standaarddeviatiebalken. De corresponderende Rayleigh-golfsnelheid voor het vlakke deel van de bochten is bovenaan uitgezet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De haalbare beelddiepte in het OCT-systeem wordt bepaald door de mate van lichtpenetratie van de lichtbron, die afhankelijk is van de golflengte van de bron. Bovendien bepaalt de golflengte de axiale resolutie. Langere golflengten kunnen dieper in het monster doordringen, maar dit gaat ten koste van een verminderde axiale resolutie in vergelijking met kortere golflengten. Transversale resolutie daarentegen is afhankelijk van zowel de numerieke apertuur van het systeem als de golflengte, waarbij kortere golflengten een hogere resolutie opleveren. Het vergroten van de numerieke apertuur introduceert een compromis door de scherptediepte te beperken29. De ruimtelijke resolutie is beperkt tot de kortste elastische golflengte die met een voldoende signaal-ruisverhouding kan worden gedetecteerd. De huidige OCE-methodologie is beperkt tot 0,5 mm 9,30. Hoewel deze techniek wordt beperkt door de grootte van het monster, moet deze worden toegepast op verschillende soorten biofilm. De vorm van de biofilm, korrelig of plat, zal de techniek niet belemmeren. De transparantie van het monster speelt ook een rol bij het bepalen van de penetratiediepte. Materialen met een hoge transparantie laten licht door het hele monster gaan, waardoor het niet waarneembaar wordt, terwijl ondoorzichtige monsters de lichtpenetratie belemmeren, wat minimale details oplevert over hun interne structuur 9,28. In het kader van dit onderzoek volstaat een penetratiediepte in het millimeterbereik.
Een ander mogelijk probleem voor deze metingen is dat in grotere monsters, waarbij de grootte het aantal elastische golfcycli niet beperkt, het gezichtsveld (FOV) van de OCT-microscoop de beperkende factor kan zijn van het aantal gemeten cycli. Voor metingen hier is het gezichtsveld beperkt tot 9 mm bij 9 mm; elastische golflengten langer dan 9 mm kunnen dus niet worden opgelost in deze OCT-microscoop. Het gebruik van een lens met een breder gezichtsveld zou het mogelijk maken om grotere monsters in beeld te brengen, wat meer randen oplevert bij deze lagere frequenties. Uitdagingen doen zich ook voor bij hogere frequenties. Voor de monsters in deze studie ondervindt de golf boven 10 kHz een aanzienlijke verzwakking, waardoor de grootte van de faseverschilverdeling afneemt en de bepaling van de ruimtelijke frequentie wordt bemoeilijkt. Dit probleem kan worden verholpen door de spanning van de functiegenerator te verhogen, waardoor de verplaatsing van de transducer toeneemt. Het verhogen van de verplaatsing is echter slechts tot op zekere hoogte nuttig, omdat dit uiteindelijk in fasewikkeling9 zal eindigen. Als alternatief kan het verbeteren van de gevoeligheid van het systeem door een lichtbron met een hoger vermogen te implementeren, fasewikkeling als gevolg van grotere verplaatsingen tegengaan en de detectie van de dynamische respons op kleinere excitaties vergemakkelijken. Een hogere gevoeligheid vergemakkelijkt de implementatie van akoestische OCE-methoden die het voordeel bieden van contactloze belasting, maar dieper worden beïnvloed door de hoge demping31.
Bij het uitvoeren van deze metingen op biofilms is het cruciaal om de monsters gehydrateerd te houden. Drogen leidt tot een ongewenste toename van de stijfheid, wat niet relevant is omdat de nadruk ligt op het beoordelen van de eigenschappen van het monster in zijn oorspronkelijke omgeving. We hebben geen onderzoek gedaan naar door verlichting geïnduceerde droging. We merken echter op dat tijdens de meting periodiek water uit de natuurlijke omgeving werd toegevoegd, en gedurende die tijd werd de morfologie van het monster gecontroleerd aan de hand van de OCT-beelden en werden er geen waarneembare veranderingen in de morfologie waargenomen. Bovendien is het bij het positioneren van de transducer en het vastleggen van OCE-beelden essentieel om rekening te houden met de kenmerken die in het OCT-beeld worden onderscheiden. Heterogeniteiten langs het golfvoortplantingspad hebben het potentieel om het golfveld te verstoren en moeten dus worden vermeden9. Bovendien is het van cruciaal belang om voorzichtig contact met de biofilm te houden, omdat overmatige druk op het monster, naast het mogelijk wijzigen van de mechanische eigenschappen, ook kan leiden tot vervorming van het golfveld. Ten slotte moet het scangebied loodrecht op de golffronten staan om ervoor te zorgen dat de ruimtelijke frequentie van de harmonische golf nauwkeurig wordt bepaald op basis van de meting.
Voor sommige frequenties werden significante variaties in golfsnelheden waargenomen in beide monsters, die kunnen worden toegeschreven aan hun inherente heterogeniteiten, golfveld op die specifieke frequentie en morfologie van de voortplantingspaden. We toonden eerder aan dat het gemeten golfsnelheidsprofiel over een doorgesneden granulaire biofilm niet-uniform is vanwege de heterogene microstructuur9. Daarom is het bij het toepassen van deze techniek op granulaire biofilms absoluut noodzakelijk om metingen uit te voeren op meerdere locaties in het monster om een gemiddelde weergave af te leiden.
Een belangrijke observatie met betrekking tot de dispersiecurven is dat ze verschillend gedrag vertonen voor verschillende steekproefgroottes. In het geval van de grotere steekproef blijft de curve relatief constant over het gemeten bereik. Voor de kleinere steekproef is er echter een opwaartse trend in golfsnelheid met toenemende frequentie, vooral in het onderste deel van het bereik. Dit fenomeen kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van visco-elastische effecten bij lagere frequenties en het genereren van elastische golfgeleidermodi. We hebben rekening gehouden met deze effecten in ons eerdere werk met behulp van meer geavanceerde inverse modellen 8,9,18.
Het is belangrijk op te merken dat in aërobe granulaire systemen de biomassa niet gelijkmatig over de hoogte van de reactor wordt verdeeld. Tijdens niet-beluchtingsfasen hebben grotere korrels de neiging om zich op de bodem van de reactor te nestelen. Deze ongelijke verdeling heeft tot gevolg dat aggregaten van verschillende grootte toegang hebben tot verschillende hoeveelheden substraat. Als gevolg hiervan vertonen aggregaten van verschillende grootte een verschillende samenstelling van de gemeenschap. Bovendien, omdat overtollig slib selectief wordt verwijderd, worden grotere korrels meestal langer in de reactor vastgehouden, terwijl kleinere korrels gemakkelijker worden verwijderd32. Het merkbare verschil in de modulus van Young suggereert een mogelijk verband tussen de samenstelling van de biofilm, leeftijd en mechanische eigenschappen.
Samenvattend biedt de Optical Coherence Elastography (OCE)-methode een snelle en niet-destructieve manier om de elastische golfsnelheid in biofilms te beoordelen. Deze methode overwint de beperkingen van reologische metingen en vertoont verbeterde eigenschappen in vergelijking met alternatieve elastografietechnieken 8,18. Bovendien reikt de toepasbaarheid verder dan korrelige biofilms en omvat het elk gedeeltelijk transparant monster met een geschikte optische penetratiediepte en -grootte die groot genoeg is om door het systeem te worden opgelost, inclusief voorbeelden zoals hydrogels33, hoornvlies34 en huid35. De toekomstige ontwikkelingen van de methode omvatten verschillende belangrijke aspecten. Ten eerste zal het verhogen van de frequentie van harmonische elastische golven tot het bereik van honderden kHz golflengten van enkele micrometers mogelijk maken, waardoor ruimtelijke resolutie op een vergelijkbare schaal wordt bereikt. Ten tweede zal de signaal-ruisverhouding van het optische detectiesysteem worden verbeterd door het optische vermogen van het OCT-systeem te verhogen van 2 mW (stroom) naar 20 mW. Ten slotte vervangen we de contactharmonische actuator door een contactloze akoestische stralingsdrukbron. Deze toevoeging zal niet-invasieve en niet-destructieve operaties vergemakkelijken en het mogelijk maken om biofilmmonsters in hun oorspronkelijke omgeving te ondervragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs danken Aqua-Aerobic Systems, Inc. (Rockford, IL, VS) voor het leveren van de granulaire biofilms die in dit werk zijn bestudeerd. De auteurs erkennen ook de steun van de National Science Foundation via Award #210047 en #193729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M.
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al.
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
