Summary
מאמר זה מדגיש את יעילותה של טכניקת האלסטוגרפיה הקוהרנטית האופטית (OCE) באפיון מהיר ולא הרסני של תכונות אלסטיות של ביופילם. אנו מבהירים הליכי יישום OCE קריטיים למדידות מדויקות ומציגים את ערכי המודולוס של יאנג עבור שני ביופילמים גרעיניים.
Abstract
ביופילמים הם ביו-חומרים מורכבים המרכיבים רשת מאורגנת היטב של תאים מיקרוביאליים העטופים בחומרים פולימריים חוץ-תאיים המיוצרים בייצור עצמי (EPS). מאמר זה מציג תיאור מפורט של יישום מדידות אלסטוגרפיה קוהרנטיות אופטית (OCE) המותאמות לאפיון אלסטי של ביופילמים. OCE היא טכניקה אופטית אל-הרסנית המאפשרת מיפוי מקומי של מיקרו-מבנה, מורפולוגיה ותכונות ויסקו-אלסטיות של חומרים רכים שקופים חלקית ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. אנו מספקים מדריך מקיף המפרט את ההליכים החיוניים ליישום נכון של טכניקה זו, יחד עם מתודולוגיה להערכת עיקר המודולוס של יאנג של ביופילמים גרעיניים מהמדידות שנאספו. אלה כוללים את הגדרת המערכת, רכישת נתונים ועיבוד לאחר מכן. בדיון, אנו מתעמקים בפיזיקה הבסיסית של החיישנים המשמשים ב-OCE ובוחנים את המגבלות הבסיסיות לגבי קנה המידה המרחבי והזמני של מדידות OCE. אנו מסכמים עם כיוונים עתידיים פוטנציאליים לקידום טכניקת OCE כדי להקל על מדידות אלסטיות של ביופילמים סביבתיים.
Introduction
בטיפול בשפכים ובהשבת משאבי מים, ביופילמים מועילים בכורי גדילה מחוברים משמשים יותר ויותר כדי לאפשר למיקרובים להמיר מזהמים בלתי רצויים, כגון חומר אורגני, חנקן ופוספט, לצורות מיוצבות שניתן להסיר בקלות מהמים1. במערכות אלה, הפונקציה המתהווה של הביופילם, כלומר טרנספורמציות ביוכימיות, קשורה קשר הדוק למגוון המיקרובים השוכנים בו ולחומרי המזון שמיקרובים אלה מקבלים2. בהתאם לכך, גידול מתמשך של ביופילם יכול להוות אתגר לשמירה על פונקציונליות עקבית של כורים מכיוון שהגידול החדש בביופילם עשוי לשנות את התהליכים המטבוליים הכוללים של הביופילם, מאפייני העברת המסה והרכב הקהילה. ייצוב סביבת הביופילם ככל האפשר יכול להגן מפני שינויים כאלה3. זה כולל הבטחת זרימה עקבית של חומרים מזינים ושמירה על מבנה הביופילם יציב עם עובי קבוע4. ניטור הנוקשות והמבנה הפיזי של הביופילם יאפשר לחוקרים לקבל תובנה לגבי הבריאות הכללית והתפקוד של הביופילם.
ביופילמים מציגים תכונות ויסקו-אלסטיות 5,6,7. אופי ויסקו-אלסטי זה גורם לשילוב של עיוות מיידי ואיטי, תלוי זמן, בתגובה לכוחות מכניים חיצוניים. היבט ייחודי אחד של ביופילמים הוא שכאשר הם נתונים לעיוות משמעותי, הם מגיבים כמו נוזלים צמיגים. לעומת זאת, כאשר הם נתונים לעיוות קל, תגובתם דומה למוצקים5. יתר על כן, בתוך אזור עיוות קטן זה, יש טווח עיוות שבו ביופילמים מציגים יחסי כוח-עקירה ליניאריים 5,6,7. עיוותים בטווח ליניארי זה הם אופטימליים להערכת מאפיינים מכניים של ביופילם מכיוון שהם מניבים מדידות הניתנות לשחזור. מספר טכניקות יכולות לכמת את התגובה האלסטית בטווח זה. אלסטוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCE) היא טכניקה מתפתחת המותאמת לניתוח ביופילמים בטווח ליניארי זה (זנים בסדר גודל של 10-4-10-5)8,9.
היישום המבוסס ביותר של OCE עד כה הוא בתחום הביו-רפואי, שם יושמה הטכניקה לאפיון רקמות ביולוגיות הדורשות גישה אופטית שטחית בלבד. לדוגמה, Li et al. השתמשו ב-OCE כדי לאפיין את התכונות האלסטיות של רקמת העור10. מחברים אחרים אפיינו את התכונות האלסטיות האנאיזוטרופיות של רקמות קרנית חזיריות ואנושיות וכיצד הן מושפעות מלחץ תוך עיני 11,12,13,14,15,16. כמה יתרונות של שיטת OCE לחקר ביופילמים הם שהיא אינה הרסנית ומספקת רזולוציה מרחבית מזוסקאלית, היא אינה דורשת הכנת דגימה, והשיטה עצמה מהירה; הוא מספק מדידות רשומות משותפות של מבנה פיזי ותכונות אלסטיות (למשל, נקבוביות, חספוס פני השטח ומורפולוגיה)8,9,17,18.
שיטת OCE מודדת את התזוזה המקומית של גלים אלסטיים מתפשטים בדגימה באמצעות טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית רגישה לפאזה (OCT). OCT הוא אינטרפרומטר אופטי בקוהרנטיות נמוכה שהופך שינויים מקומיים בתזוזת הדגימה לשינוי עוצמה המתועד באמצעות ספקטרומטר אופטי. טכניקת OCT שימשה גם במחקר ביופילם לאפיון מבנה מזוסקאלי, התפלגות נקבוביות בתלת ממד ועיוות ביופילם 17,19,20,21. בנוסף, Picioreanu et al. העריכו תכונות מכניות של ביופילם באמצעות מודלים הופכיים של אינטראקציה בין מבנה נוזל לתמונות דפורמציה של חתך OCT22.
לעומת זאת, מדידות OCE, בשילוב עם מידול גלים אלסטודינמיים הופכיים, מניבות את מהירות הגל של הגלים האלסטיים בדגימה, מה שמאפשר לאפיין את התכונות האלסטיות והויסקו-אלסטיות של הדגימה. הקבוצה שלנו התאימה את טכניקת OCE למדידה כמותית של תכונות אלסטיות וויסקו-אלסטיות של ביופילם 8,9,18 ואישרה את הטכניקה כנגד מדידות ריאומטריית גזירה בדגימות צלחת ג'ל אגרוז18. גישת OCE מספקת הערכות מדויקות ואמינות של תכונות הביופילם מכיוון שמהירות הגל האלסטי הנמדדת מתואמת עם התכונות האלסטיות של הדגימה. יתר על כן, הדעיכה המרחבית של משרעת הגל האלסטי יכולה להיות בקורלציה ישירה עם התכונות הויסקו-אלסטיות עקב השפעות צמיגיות בחומר. דיווחנו על מדידות OCE של תכונות ויסקו-אלסטיות של ביופילמים חיידקיים בתרבית מעורבת שגדלו על קופונים בכור טבעתי מסתובב (RAR) וביופילמים גרגיריים עם גיאומטריות מורכבות באמצעות מודלים של גלים אלסטודינמיים18.
טכניקת OCE היא גם חלופה רבת עוצמה לריאומטריה18המסורתית המשמשת לאפיון ויסקו-אלסטי. שיטות הראומטריה מתאימות ביותר לדגימות עם גאומטריה מישורית. לפיכך, לא ניתן לאפיין במדויק ביופילמים גרגיריים, בעלי צורות שרירותיות ומורפולוגיה של פני השטח, על גבי ראומטר 8,23. בנוסף, שלא כמו OCE, שיטות ראומטריה עשויות להיות מאתגרות להסתגל למדידות בזמן אמת, למשל, במהלך גידול ביופילם בתאי זרימה24,25.
במאמר זה אנו מראים כי מדידות OCE של מהירות הגל הבלתי תלויה בתדר של גלי פני השטח יכולות לשמש לאפיון התכונות האלסטיות של הביופילם ללא צורך במודלים מסובכים. פיתוח זה יהפוך את גישת OCE לנגישה יותר לקהילת הביופילם הרחבה יותר לחקר התכונות המכניות של הביופילם.
איור 1 מראה המחשה סכמטית של מערכת OCT ששימשה במחקר זה. המערכת משלבת מספר מכשירים, כולל מערכת OCT מסחרית רגישה לפאזה, מחולל השהיה, מחולל פונקציות ומתמר פיאזואלקטרי. מערכת OCT פועלת על עקרון האינטרפרומטריה על ידי שימוש במקור אור רחב פס עם אורך גל מרכזי של 930 ננומטר. עוצמת האור שנאספת, המתואמת עם פרטים מבניים מורכבים בדגימה, מנותחת ביחידת העיבוד שלאחר מכן ומומרת לתמונת חתך רוחב של הדגימה - המכונה בדרך כלל תמונת OCT. עומק הדמיית OCT תלוי בחומרת הפיזור האופטי בדגימה הנובע משונות מקומית במקדם השבירה ומוגבל ל-1-3 מ"מ ברקמות ביולוגיות ובביופילמים. מכיוון שהפאזה האופטית בדגימה ועוצמת ההפרעה מווסתות על ידי תנועה, ניתן להשתמש ב-OCT כדי לזהות את תזוזת הדגימה המקומית. אנו ממנפים את רגישות התזוזה של OCT בשיטת OCE כדי לעקוב אחר שדה התזוזה במצב יציב של גלים אלסטיים בדגימה. באופן ספציפי, מחולל הפונקציה מפיק מתח סינוסואידלי כדי להניע את המתמר הפיזואלקטרי. המתמר, בתורו, נמתח ומתכווץ עם היסטוריית זמן מתנודדת. התזוזה התנודתית של המתמר מקנה כוח סינוסואידי על פני הדגימה דרך קצה טריז מודפס בתלת-ממד בקודקוד המתמר, מה שמוביל ליצירת גלים אלסטיים הרמוניים בדגימה. קצה הטריז יוצר מגע קל עם הדגימה, כך שהדגימה נשארת שלמה לאחר שהמפעיל נסוג משטח הדגימה. לתיעוד התזוזה המקומית בדגימה, מתקבלות סריקות עומק סמוכות המופרדות בהשהיית זמן קבועה בכל פיקסל בדגימה. הפרש הפאזה האופטית בין סריקות עוקבות בכל נקודת פיקסל פרופורציונלי לתזוזה האנכית המקומית באותה נקודה. הסנכרון בין תזוזת המתמר לבין אופטיקת הסריקה במערכת OCT מושג באמצעות פולס טריגר שמקורו במחולל הפונקציות ומתעכב במחולל ההשהיה. שלב סנכרון זה מאפשר קבלת תמונות חתך עקביות של התפלגות הפאזה האופטית המקומית בדגימה. תמונות אלה עומדות ביחס ישר לתזוזה ההרמונית האנכית המקומית בדגימה וידועות כתמונת OCE. תמונות OCE נרכשות בתדרי הפעלת מתמרים שונים כדי לקבל את אורך הגל האלסטי ואת מהירות הגל כפונקציה של תדר. מהירויות הגל הנמדדות מנותחות באמצעות מודל אלסטודינמי כדי לקבוע את התכונות האלסטיות של הדגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הגדרת מערכת
- אסוף את רכיבי המערכת הכוללים את מערכת OCT המסחרית (יחידת בסיס, מעמד, ראש הדמיה ומחשב), מחולל צורת גל, מתמר, מחולל עיכוב/פולס, מתג עם חיבורי BNC, כבלים ומתאמים BNC, עמודים אופטיים ומהדקים.
- חבר את אות הסינכרון ממחולל הפונקציות למתג. חבר את היציאה השנייה של המתג למחולל ההשהיה.
- חבר את הפלט של מחולל הפונקציות למוליכי המתמרים.
- חבר את היציאות של מחולל ההשהיה לערוץ ההדק בחלק האחורי של יחידת הבסיס של OCT. אות הפלט ממחולל ההשהיה הוא פולס הדק להפעלת התנועה של אופטיקת הסריקה במערכת OCT.
- הפעל את רכיבי המערכת (יחידת בסיס OCT, מחשב, מחולל פונקציות ומחולל השהיה) והפעל את תוכנת OCT.
- הגדר את מחולל ההשהיה לשליחת אות מפעיל לוגיקת טרנזיסטור-טרנזיסטור ליחידת הבסיס של OCT. עיין במדריך מערכת OCT לקבלת דרישות אות ההדק.
- מקם את המתמר מתחת לעדשת OCT. למתמר קצה טריז מודפס בתלת-ממד המודבק על אחד מקצותיו המשמש כמקור קו לגלים אלסטיים.
2. רכישת תמונות
- בתוכנת OCT, בחר את מצב רכישת דופלר והפעל את הגורם המפעיל החיצוני.
- הניחו את הביופילם הגרגירי מתחת לעדשה במחזיק דגימה והזיזו אותו לכיוון קצה המתמר באמצעות שלב תרגום. ודא שהמתמר יוצר מגע עדין עם משטח הדגימה, כפי שמוצג באיור 2. השתמשנו בשני ביופילמים גרגיריים (הידועים גם בשם בוצה גרגירית) בקטרים נומינליים שונים (4.3 מ"מ ו-3.3 מ"מ). בחירה זו נעשתה כדי לחקור את ההשפעה של גודל הביופילם על תכונותיו המכניות. אלה הושגו באופן מסחרי.
הערה: מחזיק הדגימה שהועסק במחקר זה מורכב מלוח פלסטיק מודפס בתלת-ממד עם כניסות חצי ספריות מרובות. מחזיק זה אינו מאפשר מדידות בתנאים מקומיים. לכן, הכנסנו מים מהסביבה הטבעית במהלך המדידות כדי למנוע מהדגימה להתייבש. - ציין את אזור הסריקה בלחיצה על נקודות ההתחלה והקצה של קו העניין (נתיב התפשטות הגל) בחלון הצג לדוגמה. מרכז קו זה ביחס לקצה המתמר וודא שהוא מאונך לקצה הקצה.
- ציין את מספר הפיקסלים לאורך אזור הסריקה ואת עומק הדגימה והגדל את מספר סריקות B (תמונות חתך דו-ממדיות) שיש להקליט כדי לשפר את יחס האות לרעש של תמונות OCE. התוצאות המוצגות התקבלו באמצעות 1523 פיקסלים לאורך נתיב הסריקה ו 1024 פיקסלים לאורך העומק. בסך הכל בוצעו 50 סריקות B.
- לחץ על הלחצן סרוק והפעל את המתג. התמונות OCT ו-OCE אמורות להופיע על המסך. הפעל את המתג בזמן הזמן הקצוב להפעלה ובזמן הכנת הסריקה.
- ודא שעוצמת הייחוס נמצאת בטווח האופטימלי ומקם את הדגימה באזור המוקד של מטרת המיקרוסקופ OCT. דגימה ממוקדת כהלכה צריכה שהקצה העליון שלה יהיה קרוב לחלק העליון של התמונה.
- התאימו את מיתאר הפאזה בתמונת OCE בסרגל הכלים של התצוגה באמצעות הגדלת הערך הגבוה יותר של סרגל הצבע בצד שמאל והקטנת הערך הנמוך יותר של סרגל הצבע בצד ימין. זה יגדיל את הניגודיות בשוליים.
- הגדר את מחולל הפונקציות לייצר מתח סינוסואידי בתדר יחיד על ידי לחיצה על לחצן סינוס בלוח הקדמי וציין את תדירות העירור ההתחלתית עבור המדידות. המדידות במחקר זה מתחילות ב-4 קילו-הרץ ומסתיימות ב-9.6 קילו-הרץ. הפעל את מחבר הפלט על-ידי הקשה על מקש הפלט.
- הגדר מתח מקובל למדידה. ערך זה אמור למקסם את נראות השוליים אך גם להימנע מעטיפת פאזות. עבור הביופילמים במחקר זה וטווח התדרים של המדידות, מתח בין 5 ל -10 וולט בדרך כלל מביא למפת פאזה עם ניגודיות טובה.
- רכוש את תמונות OCT ו- OCE על ידי לחיצה על תקליט לחצן.
- חזור על המדידות בתדרים שונים כדי לקבל תמונות חתך של שדה הגל האלסטי באורכי גל שונים (או תקופות שוליים).
3. ניתוח תמונות
- השג את הגודל הפיזי של הפיקסלים. גודל הפיקסלים הפיזי ב- x מתקבל על ידי חלוקת שדה הראייה בכיוון x בגודל התמונה בכיוון x ולאחר מכן הכפלה בפקטור של שניים. גודל הפיקסלים הפיזי ב- z מתקבל על ידי חלוקת שדה הראייה בכיוון z בגודל התמונה בכיוון z. ערכי שדה הראייה וגודל התמונה מאוחסנים במערך המבנה עם פרטי התמונה שניתן לגשת אליהם באמצעות הפונקציה OCTFileOpen המסופקת ב- SDK של MATLAB בחבילת ThorImageOCT.
- השג את מטריצות OCT ו- OCE באמצעות הפונקציות OCTFileGetIntensity ו- OCTFileGetPhase, בהתאמה, וקח את הממוצע של המסגרות המוקלטות. פונקציות אלה מסופקות ב- SDK של MATLAB בחבילת ThorImageOCT.
- השיגו את מיקומי הפיקסלים של הקצה העליון של הדגימה באמצעות בינאריזציה של התמונה וזיהוי הפיקסלים הלבנים מלמעלה למטה בכל עמודה.
- חלץ את התפלגות הפאזה של תמונת OCE לאורך קצה זה באמצעות הפונקציה improfile וחשב את אורך הקשת המצטבר בממדים אמיתיים. חשב את אורך הקשת על-ידי לקיחת הסכום המצטבר של הנורמה של הפרשי קנה מידה בין נקודות עוקבות בכיוון x ו- z.
- חשב את התמרת פורייה המהירה המרחבית של התפלגות הפאזה OCT הנמדדת (כלומר, מתמונות OCE) ביחס לאורך הקשת המצטבר באמצעות פונקציית פלומב.
- קבע את מיקום הפסגה בספקטרום. מיקום זה מייצג את התדר המרחבי של הגל. חישוב מהירות הגל (או מהירות הפאזה) מהיחס בין תדר העירור המתמר (יחידות של Hz) והתדר המרחבי (יחידת אורך הופכית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה השתמשנו בביופילמים גרגיריים (הידועים גם בשם בוצה גרגירית), שהתקבלו באופן מסחרי. גרגירים הם ביופילמים כדוריים הנוצרים באמצעות צבירה עצמית, כלומר הם אינם דורשים נשא או משטח שעליו ניתן לגדול26. איור 3A מראה תמונת OCT מייצגת בחתך רוחב שנוצרת עקב השונות המרחבית של אינדקס השבירה המקומי בביופילם גרעיני. לביופילם קוטר נומינלי של 3 מ"מ. חלק מהתכונות הפנימיות, כולל נקבוביות וחללים הקרובים לפני השטח של הדגימה, נראים בתמונה. פיזור אופטי מוגבר לאורך עומק הדגימה מונע ממקור האור OCT להגיע למרכז הדגימה, ובכך הופך את האזור המרכזי לנטול כל מידע שניתן להבחין בו. איור 3B מראה את תמונת OCE בחתך רוחב של הדגימה עבור תדר עירור מתמר של 5.1 קילוהרץ. הניגודיות המקומית בתמונה מתואמת עם התזוזה האנכית המקומית הנגרמת על ידי הגל האלסטי המתפשט בדגימה. המרווח הפיזיקלי של השוליים לאורך נתיב ההתפשטות מתאים לאורך הגל של גל פני השטח האלסטי. גל פני השטח מתפשט בסמוך לפני השטח של הדגימה, ויש לו עומק חדירה הקרוב לאורך הגל. ההיקף המרחבי של תזוזת גלי פני השטח אינו נראה בתמונה בשל החדירה האופטית המוגבלת של מקור האור OCT בדגימה. התפלגות הפאזה האופטית לאורך נתיב התפשטות הגלים האלסטי (איור 4A) משמשת לקביעת התדירות המרחבית של גל פני השטח. התדר המרחבי מתקבל על ידי לקיחת התמרת פורייה מהירה (FFT; איור 4B) של הנתונים ובחירת התדירות שבה גודל ספקטרום FFT הוא הגדול ביותר.
חיוני לבחור מתח מחולל פונקציות בעוצמה מספקת כדי לייצר תבנית שוליים המציגה ניגודיות אופטימלית בתמונת OCE. עם זאת, יש להימנע ממתחים גדולים מדי מכיוון שזה יכול לגרום לעטיפת פאזה בתמונת OCE, כפי שמודגם באיור 5A. גלישת פאזה נוצרת מכיוון שהפרש הפאזה האופטית במדידה מוגבל למרווח שבין -π ל- π. כאשר הפאזה חורגת מאחת ממגבלות אלה, היא מקופלת לגבול הנגדי, ויוצרת התפלגות פאזה לא רציפה. כתוצאה מכך, מתעורר הצורך בעטיפת שלבים, מה שמציב אתגרים ויכול להציג אי דיוקים פוטנציאליים. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון עבור מדידות גל מדויקות הוא מספר השוליים הקיימים בתוך תמונת OCE. בתדרי מתמרים נמוכים, המתוארים באיור 5B, מחזור תנודה מלא של גל פני השטח עשוי שלא להילכד במלואו בגלל גודלו הקטן של הגרגיר, וספקטרום FFT עשוי להניב הערכות שגויות עבור התדר המרחבי (או אורך הגל ההופכי). מקור נוסף לטעות בהערכת התדירות המרחבית הוא נוכחותם של מצבי גל אלסטיים חופפים מרחבית, כגון גלי שטח וגלי גזירה בתפזורת, בתמונת OCT. מצבי גל אלה מתערבבים, ויוצרים דפוסי התאבכות מסובכים שעשויים להיות קשים לניתוח. נוכחותם של מצבי גל שונים מעבר לגלי פני השטח יכולה ליצור השפעות התאבכות בקרבת המתמר, המותנות בדגימה הספציפית, בתדירות העירור ובמשרעת. איור 6 הוא דוגמה לתמונת OCE המתקבלת בתדירות עירור של 5.5 קילוהרץ, שבה גל גזירה בתפזורת ליד נקודת העירור המקומית מפריע לשדה הגל שעל פני השטח. איור 7A מתאר התפלגות פאזה שסוטה מתבנית גלי הסינוס המתפוררים שנצפתה באיור 4A, המיוחסת לשילוב של מצבי גל. כתוצאה מכך, ה-FFT המתקבל מציג שיא רחב יותר, כפי שמתואר באיור 7B. אותה תופעה יכולה להתרחש קרוב לפגמים כמו חללים או אזורים עם שינויים ניכרים בתכונות אלסטיות/ויסקו-אלסטיות. באזורים אלה, שדה התזוזה המקומי משתנה עקב הפרעה של האירוע או גל פני השטח והגלים המפוזרים מהליקוי.
חישבנו את מהירות הגל של גל פני השטח בתדרים שבין 4.0 ל-9.6 קילוהרץ עבור שני ביופילמים גרגיריים בעלי קטרים נומינליים שונים (4.3 מ"מ ו-3.3 מ"מ). חלקות מהירות הגל נקראות עקומות פיזור. עבור ההגדרות שבהן נעשה שימוש, כל מדידת פיזור ארכה כ-15 דקות. בתוך מרווח התדרים שנבחר, קיימים מחזורים מרובים של פרופיל התזוזה הסינוסואידלי בתמונות OCE, המאפשרים קביעה מדויקת של תדירות מרחבית לצד ניגודיות פאזה בולטת. איור 8 ממחיש את עקומות הפיזור המתקבלות. עקומות אלה מייצגות את עקומות הפיזור הממוצעות עבור שלושה מיקומים בכל מדגם. מהירויות גלי פני השטח מתקרבות לערך קבוע, הנקרא מהירות גל ריילי, cR, הקשור למודולוס הגזירה של הדגימה באמצעות היחסים,
cR = ((0.862 + 1.14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
כאשר G הוא מודולוס הגזירה, r היא צפיפות המסה, ו-ν הוא יחס פואסון27,28. הוא קבוע מכיוון שעומק החדירה של הגל האלסטי קצר מקוטר הדגימה. בעיקרו של דבר, הגל האלסטי נע קרוב לפני השטח של הדגימה במהירות גל ביחס ישר לריבוע של מודולוסיאנג 28. עם זאת, בשל רעש מדידה, מהירות הגל אינה קבועה לחלוטין בתחום תדרים זה. אנו לוקחים את הממוצע של מהירויות הגל עבור תדרים בין 6.0 ל -9.6 קילוהרץ עבור המדגם הקטן יותר ובין 4.0 ל -9.6 קילוהרץ עבור המדגם הגדול יותר. מהירות גל ממוצעת זו משמשת לאחר מכן להערכת המודולוס של יאנג של הדגימה.
אנו מניחים כי הדגימה אינה ניתנת לדחיסה בשל תכולת המים הגבוהה שלה. ככזה, ν = 0.5. לפיכך, cR קשור ישירות ל- E = 3G עבור מוצק בלתי דחיס, כאשר E הוא המודולוס הצעיר של המדגם27,28. הקווים המקווקווים באיור 8 מייצגים את מהירויות גלי ריילי עבור הדגימות השונות. אנו מניחים שהרכב ביופילם מורכב בעיקר ממים, המניב צפיפות של 1000 ק"ג/מ"ק 3. כתוצאה מכך, המודולוס המחושב של יאנג של הביופילמים הגרגיריים הוא 85 kPa ו-205 kPa עבור הביופילמים הגרגיריים בעלי קטרים נומינליים של 4.3 מ"מ ו-3.3 מ"מ, בהתאמה. מדידה זו מאשרת את יכולתה של הטכניקה להבחין בהבדלי תכונות מכניות בין הביופילמים.
איור 1: הגדרת אלסטוגרפיה של קוהרנטיות אופטית. הסכימה של המערכת המשמשת כאן מוצגת באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מדגם רכוב. הביופילם הגרגירי ממוקם על מחזיק הדגימה בזמן שהמתמר יוצר איתו מגע עדין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות OCT ו-OCT של ביופילם גרעיני. (A) תמונת OCT. (B) תמונת OCE עבור גל משטח המתפשט במהירות של 5.1 קילוהרץ ומציגה ניגודיות שוליים טובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התפלגות פאזה ו-FFT. עבור התמונה המוצגת באיור 3B, (A) התפלגות הפרשי הפאזה לאורך הקצה העליון של הדגימה ו-(B) FFT של התפלגות הפרשי הפאזה המציגה שיא צר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות OCT ו-OCT של ביופילם גרעיני. (A) תמונת OCE עבור גל פני שטח המתפשט במהירות של 5.1 קילוהרץ ומראה גלישת פאזה. (B) תמונת OCE עבור גל משטח המתפשט במהירות של 1.3 קילוהרץ ללא מחזור שלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונת OCE המציגה שילוב של מצבים. תמונה זו לקוחה ממיקום אחר של הדגימה ומדגימה את שילוב המצבים של גל המתפשט במהירות של 5.5 קילוהרץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: התפלגות פאזה ו-FFT. עבור התמונה המוצגת באיור 6, (A) התפלגות הפרשי הפאזה לאורך הקצה העליון של הדגימה ו-(B) FFT של התפלגות הפרשי הפאזה המציגה שיא רחב יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: עקומות פיזור. מהירות הגל בשתי דגימות בגדלים שונים מוצגת בתדרים שונים עם פסי סטיית תקן. מהירות גל ריילי המתאימה לחלק השטוח של העקומות משורטטת למעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עומק ההדמיה הניתן להשגה במערכת OCT נקבע על פי מידת חדירת האור ממקור האור, התלויה באורך הגל של המקור. יתר על כן, אורך הגל קובע את הרזולוציה הצירית. אורכי גל ארוכים יותר יכולים לחדור עמוק יותר לתוך הדגימה אך על חשבון רזולוציה צירית מופחתת בהשוואה לאורכי גל קצרים יותר. הרזולוציה הרוחבית, לעומת זאת, תלויה הן בצמצם המספרי של המערכת והן באורך הגל, כאשר אורכי גל קצרים יותר מספקים רזולוציה גבוהה יותר. הגדלת הצמצם המספרי יוצרת פשרה על ידי הגבלת עומק השדה29. הרזולוציה המרחבית מוגבלת לאורך הגל האלסטי הקצר ביותר שניתן לזהות עם יחס אות לרעש מספיק. מתודולוגיית OCE הנוכחית מוגבלת ל-0.5 מ"מ 9,30. בעוד טכניקה זו מוגבלת על ידי גודל הדגימה, זה צריך להיות ישים על סוגים שונים של ביופילם. צורת הביופילם, גרגירי או שטוח, לא תעכב את הטכניקה. שקיפות הדגימה משחקת תפקיד גם בקביעת עומק החדירה. חומרים בעלי שקיפות גבוהה מאפשרים לאור לעבור דרך כל הדגימה, מה שהופך אותה לבלתי מורגשת לתצפית, בעוד שדגימות אטומות מעכבות חדירת אור, ומניבות פרטים מינימליים על המבנה הפנימי שלהן 9,28. בהקשר של מחקר זה, עומק חדירה בתחום המילימטר מספיק.
בעיה אפשרית נוספת למדידות אלה היא שבדגימות גדולות יותר, שבהן הגודל אינו מגביל את מספר מחזורי הגלים האלסטיים, שדה הראייה (FOV) של מיקרוסקופ OCT עשוי להיות הגורם המגביל של מספר המחזורים הנמדדים. למדידות כאן, ה- FOV מוגבל ל- 9 מ"מ על 9 מ"מ; לפיכך, אורכי גל אלסטיים שאורכם עולה על 9 מ"מ אינם ניתנים לפתרון במיקרוסקופ OCT זה. שימוש בעדשה עם שדה ראייה רחב יותר יאפשר הדמיה של דגימות גדולות יותר, ויניב יותר שוליים בתדרים נמוכים אלה. אתגרים מתעוררים גם בתדרים גבוהים יותר. עבור הדגימות במחקר זה, מעבר ל-10 קילוהרץ, הגל חווה הנחתה משמעותית, המפחיתה את גודל התפלגות הפרשי הפאזה ומסבכת את קביעת התדירות המרחבית. ניתן להפחית חשש זה על ידי הגדלת המתח של מחולל הפונקציות, ובכך להגדיל את תזוזת המתמר. עם זאת, הגדלת העקירה היא רק שימושית עד נקודה מסוימת כמו זה בסופו של דבר בסופו של דבר בשלבעטיפת 9. לחלופין, שיפור רגישות המערכת על ידי יישום מקור אור בעל עוצמה גבוהה יותר יכול לנטרל עטיפת פאזה הנגרמת על ידי תזוזות גדולות יותר ולהקל על זיהוי התגובה הדינמית לעירורים קטנים יותר. רגישות גבוהה יותר מאפשרת יישום של שיטות OCE אקוסטיות המציעות את היתרון של טעינה ללא מגע אך מושפעות באופן עמוק יותר מהנחתה גבוהה31.
בעת ביצוע מדידות אלה על ביופילמים, חיוני לשמור על הדגימות hydrated. ייבוש מוביל לעלייה לא רצויה בנוקשות, שאינה רלוונטית מכיוון שההתמקדות היא בהערכת תכונות הדגימה בסביבתה הטבעית. לא חקרנו ייבוש הנגרם על ידי תאורה. עם זאת, נציין כי מים מהסביבה הטבעית נוספו מעת לעת במהלך המדידה, ובמהלך תקופה זו, מורפולוגיית הדגימה נוטרה באמצעות תמונות OCT, ולא נצפו שינויים ניכרים במורפולוגיה. בנוסף, בעת מיקום המתמר ולכידת תמונות OCE, חיוני לקחת בחשבון את התכונות המובחנות בתמונת OCT. להטרוגניות לאורך מסלול התפשטות הגלים יש פוטנציאל לעוות את שדה הגל ולכן יש להימנע מהן9. יתר על כן, שמירה על מגע עדין עם הביופילם היא חיונית, שכן לחץ מוגזם על הדגימה, מלבד שינוי פוטנציאלי של המאפיינים המכניים שלה, עלול גם להוביל לעיוות של שדה הגל. לבסוף, אזור הסריקה חייב להיות מאונך לחזיתות הגל כדי להבטיח שהתדירות המרחבית של הגל ההרמוני נקבעת במדויק מהמדידה.
עבור חלק מהתדרים נצפו שינויים משמעותיים במהירויות הגל בשתי הדגימות, שניתן לייחס להטרוגניות הטבועה בהם, לשדה הגל בתדר הספציפי הזה ולמורפולוגיה של נתיבי ההתפשטות. בעבר הראינו שפרופיל מהירות הגל שנמדד על פני ביופילם גרעיני חתך אינו אחיד בגלל המיקרו-מבנה ההטרוגני9. כתוצאה מכך, כאשר משתמשים בטכניקה זו על ביופילמים גרעיניים, הכרחי לבצע מדידות במספר מקומות ברחבי הדגימה כדי לגזור ייצוג ממוצע.
תצפית חשובה לגבי עקומות הפיזור היא שהן מציגות התנהגויות שונות עבור גדלי מדגם שונים. במקרה של המדגם הגדול יותר, העקומה נשארת קבועה יחסית לאורך הטווח הנמדד. עם זאת, עבור המדגם הקטן יותר, קיימת מגמת עלייה במהירות הגל בתדירות הולכת וגוברת, במיוחד בחלק התחתון של הטווח. ניתן לייחס תופעה זו לנוכחות של אפקטים ויסקו-אלסטיים בתדרים נמוכים יותר וליצירת מצבי מנחה גל אלסטיים. לקחנו בחשבון השפעות אלה בעבודתנו הקודמת באמצעות מודלים הופכיים מתוחכמים יותר 8,9,18.
חשוב לציין כי במערכות גרעיניות אירוביות, הביומסה אינה מופצת באופן שווה לאורך גובה הכור. בשלבים שאינם אוורור, גרגירים גדולים יותר נוטים להתיישב בתחתית הכור. התפלגות לא אחידה זו גורמת לכך שלאגרגטים בגדלים שונים יש גישה לכמויות משתנות של מצע. כתוצאה מכך, אגרגטים בגדלים שונים מציגים הרכב קהילתי שונה. בנוסף, מכיוון שעודפי בוצה מוסרים באופן סלקטיבי, גרגירים גדולים יותר נוטים להישמר בכור לפרקי זמן ארוכים יותר, בעוד גרגירים קטנים יותר מוסרים בקלות רבה יותר32. ההבדל הניכר במודולוס של יאנג מצביע על קשר אפשרי בין הרכב הביופילם, הגיל והתכונות המכניות.
לסיכום, שיטת האלסטוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCE) מציעה אמצעי מהיר ולא הרסני להערכת מהירות גל אלסטית בביופילמים. שיטה זו מתגברת על האילוצים של מדידות ריאולוגיות ומציגה תכונות משופרות בהשוואה לטכניקות אלסטוגרפיה חלופיות 8,18. יתר על כן, תחולתו משתרעת מעבר לביופילמים גרגיריים כדי להקיף כל דגימה שקופה חלקית עם עומק חדירה אופטי מתאים וגודל גדול מספיק כדי להיפתר על ידי המערכת, כולל דוגמאות כמו הידרוג'לים33, קרנית34 ועור35. ההתקדמות העתידית של השיטה כוללת מספר היבטים מרכזיים. ראשית, הגדלת תדירות הגלים האלסטיים ההרמוניים לטווח מאות קילוהרץ תאפשר אורכי גל של מיקרומטרים בודדים, ובכך תשיג רזולוציה מרחבית בקנה מידה דומה. שנית, יחס האות לרעש של מערכת הגילוי האופטית ישופר על ידי הגדלת ההספק האופטי של מערכת OCT מ -2 mW (זרם) ל -20 mW. לבסוף, נחליף את מפעיל הרמונית המגע במקור לחץ קרינה אקוסטית ללא מגע. תוספת זו תאפשר פעולה לא פולשנית ולא הרסנית ותאפשר לחקור דגימות ביופילם בסביבתן הטבעית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים ל-Aqua-Aerobic Systems, Inc. (רוקפורד, אילינוי, ארה"ב) על אספקת הביופילמים הגרעיניים שנחקרו בעבודה זו. המחברים גם מודים על תמיכתה של הקרן הלאומית למדע באמצעות פרסים #210047 ו- #193729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M.
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al.
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
