Summary
В данной работе подчеркивается эффективность метода оптической когерентной эластографии (ОЦЭ) для быстрой и неразрушающей характеристики упругих свойств биопленки. Мы разъясняем важнейшие процедуры реализации OCE для точных измерений и представляем значения модуля Юнга для двух гранулированных биопленок.
Abstract
Биопленки представляют собой сложные биоматериалы, представляющие собой хорошо организованную сеть микробных клеток, заключенных в самостоятельно производимые внеклеточные полимерные вещества (ЭПС). В данной работе представлен подробный отчет о реализации измерений с помощью оптической когерентной эластографии (ОЦЭ), предназначенных для упругой характеризации биопленок. OCE — это неразрушающий оптический метод, который позволяет локально картировать микроструктуру, морфологию и вязкоупругие свойства частично прозрачных мягких материалов с высоким пространственным и временным разрешением. Мы предоставляем подробное руководство с подробным описанием основных процедур для правильного применения этого метода, а также методологию оценки объемного модуля Юнга гранулированных биопленок на основе собранных измерений. Они включают в себя настройку системы, сбор данных и постобработку. В ходе дискуссии мы углубимся в физику, лежащую в основе датчиков, используемых в OCE, и исследуем фундаментальные ограничения, касающиеся пространственных и временных масштабов измерений OCE. В заключение мы расскажем о возможных будущих направлениях развития метода OCE для облегчения упругих измерений биопленок окружающей среды.
Introduction
При очистке сточных вод и восстановлении водных ресурсов полезные биопленки в прикрепленных реакторах роста все чаще используются для того, чтобы микробы могли преобразовывать нежелательные загрязнители, такие как органические вещества, азот и фосфаты, в стабилизированные формы, которые могут быть легко удаленыиз воды. В этих системах эмерджентная функция биопленки, а именно биохимические превращения, тесно связана с разнообразием микробов, находящихся в ней, и питательных веществ, которые эти микробыполучают. Соответственно, продолжающийся рост биопленки может представлять проблему для поддержания стабильной функциональности реактора, поскольку рост новой биопленки может изменить общие метаболические процессы биопленки, характеристики массопереноса и состав сообщества. Максимально возможная стабилизация среды биопленки может защитить от таких изменений3. Это включает в себя обеспечение постоянного потока питательных веществ и поддержание стабильной структуры биопленки с постоянной толщиной4. Мониторинг жесткости и физической структуры биопленки позволит исследователям получить представление об общем состоянии и функционировании биопленки.
Биопленки проявляют вязкоупругие свойства 5,6,7. Эта вязкоупругая природа приводит к сочетанию мгновенной и медленной, зависящей от времени деформации в ответ на внешние механические силы. Одним из уникальных аспектов биопленок является то, что, когда они подвергаются существенной деформации, они реагируют как вязкие жидкости. И наоборот, при незначительной деформации их реакция сравнима с твердыми телами5. Более того, в пределах этой области малой деформации существует диапазон деформаций, в котором биопленки демонстрируют линейную зависимость между силой и смещением 5,6,7. Деформации в этом линейном диапазоне являются оптимальными для оценки механических характеристик биопленки, поскольку они позволяют проводить воспроизводимые измерения. Существует несколько методов, позволяющих количественно оценить упругий отклик в этом диапазоне. Оптическая когерентная эластография (OCE) является новым методом, который адаптируется для анализа биопленок в этом линейном диапазоне (деформации порядка 10-4-10-5)8,9.
На сегодняшний день OCE наиболее широко применяется в области биомедицины, где этот метод применяется для характеристики биологических тканей, которые требуют только поверхностного оптического доступа. Например, Li et al. использовали OCE для характеристики эластичных свойств кожной ткани10. Другие авторы охарактеризовали анизотропные эластические свойства тканей роговицы свиньи и человека и то, как на них влияет внутриглазное давление 11,12,13,14,15,16. Некоторые преимущества метода ОСЭ для изучения биопленок заключаются в том, что он является неразрушающим и обеспечивает мезомасштабное пространственное разрешение, не требует пробоподготовки, а сам метод быстрый; Он обеспечивает совместные измерения физической структуры и упругих свойств (например, пористости, шероховатости поверхности и морфологии)8,9,17,18.
Метод OCE измеряет локальное смещение распространяющихся упругих волн в образце с помощью фазочувствительной оптической когерентной томографии (ОКТ). ОКТ — это низкокогерентный оптический интерферометр, который преобразует локальные изменения смещения образца в изменение интенсивности, которое регистрируется с помощью оптического спектрометра. Метод ОКТ также используется в исследованиях биопленок для характеристики мезомасштабной структуры, распределения пористости в трех измерениях и деформации биопленки 17,19,20,21. Кроме того, Picioreanu et al. оценили механические свойства биопленки с помощью обратного моделирования взаимодействия жидкости и структуры изображений деформации поперечного сеченияОКТ 22.
С другой стороны, измерения OCE в сочетании с обратным эластодинамическим волновым моделированием позволяют получить волновую скорость упругих волн в образце, что позволяет характеризовать упругие и вязкоупругие свойства образца. Наша группа адаптировала метод OCE для количественного измерения упругих и вязкоупругих свойств биопленки 8,9,18 и валидировала методику в сравнении с измерениями сдвиговой реометрии в образцах агарозных гелевых планшетов18. Подход OCE обеспечивает точную и надежную оценку свойств биопленки, поскольку измеренная скорость упругой волны коррелирует с упругими свойствами образца. Кроме того, пространственное затухание амплитуды упругой волны может быть напрямую коррелировано с вязкоупругими свойствами из-за вязких эффектов в материале. Мы сообщили об измерениях вязкоупругих свойств бактериальных биопленок смешанных культур, выращенных на купонах во вращающемся кольцевом реакторе (RAR), и гранулированных биопленок со сложной геометрией с использованием эластодинамических волновых моделей18.
Метод OCE также является мощной альтернативой традиционной реометрии18, которая используется для вязкоупругой характеризации. Методы реометрии лучше всего подходят для образцов с плоской геометрией. Таким образом, гранулированные биопленки, которые имеют произвольную форму и морфологию поверхности, не могут быть точно охарактеризованы на реометре 8,23. Кроме того, в отличие от ОСЭ, методы реометрии могут быть сложными для адаптации к измерениям в режиме реального времени, например, во время роста биопленки в проточных клетках24,25.
В данной работе мы показываем, что измерения частотно-независимой скорости поверхностных волн с помощью OCE могут быть использованы для характеристики упругих свойств биопленки без необходимости создания сложных моделей. Эта разработка сделает подход OCE более доступным для более широкого сообщества биопленок для изучения механических свойств биопленки.
На рисунке 1 показана схематическая иллюстрация системы ОКТ, используемой в данном исследовании. Система включает в себя несколько приборов, в том числе коммерческую фазочувствительную ОКТ-систему в спектральной области, генератор задержки, генератор функций и пьезоэлектрический преобразователь. Система ОКТ работает по принципу интерферометрии с использованием широкополосного источника света с центральной длиной волны 930 нм. Собранная интенсивность света, которая коррелирует со сложными структурными деталями в образце, анализируется в блоке постобработки, а затем преобразуется в изображение поперечного сечения образца, обычно называемое ОКТ-изображением. Глубина ОКТ-визуализации зависит от выраженности оптического рассеяния в образце, которое обусловлено локальными изменениями показателя преломления и ограничено 1-3 мм в биологических тканях и биопленках. Поскольку оптическая фаза в образце и интенсивность интерференции модулируются движением, ОКТ можно использовать для обнаружения локального смещения образца. Мы используем чувствительность смещения ОКТ в методе ОЦЭ для отслеживания стационарного поля смещения упругих волн в образце. В частности, генератор функций выдает синусоидальное напряжение для управления пьезоэлектрическим преобразователем. Преобразователь, в свою очередь, растягивается и сжимается с колебательной временной историей. Колебательное смещение преобразователя передает синусоидальную силу на поверхность образца через напечатанный на 3D-принтере клиновидный наконечник в вершине преобразователя, что приводит к генерации гармонических упругих волн в образце. Клиновой наконечник обеспечивает легкий контакт с образцом, так что образец остается неповрежденным после того, как привод втягивается с поверхности образца. Для регистрации локального смещения в образце для каждого пикселя в образце регистрируются смежные развертки глубины, разделенные фиксированной временной задержкой. Оптическая разность фаз между последовательными развертками в каждой точке пикселя пропорциональна локальному вертикальному смещению в одной и той же точке. Синхронизация между перемещением преобразователя и сканирующей оптики в системе ОКТ достигается за счет триггерного импульса, который исходит от генератора функций и задерживается в генераторе задержки. Этот этап синхронизации облегчает получение согласованных изображений поперечного сечения локального оптического распределения фазы в образце. Эти изображения прямо пропорциональны локальному вертикальному гармоническому смещению в образце и известны как изображение OCE. Изображения OCE регистрируются на различных частотах срабатывания преобразователя для получения упругой длины волны и скорости волны в зависимости от частоты. Измеренные скорости волн анализируются с помощью эластодинамической модели для определения упругих свойств образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Настройка системы
- Соберите компоненты системы, которые включают в себя коммерческую ОКТ-систему (базовый блок, стойка, головка формирования изображения и компьютер), генератор сигналов, преобразователь, генератор задержки/импульсов, коммутатор с разъемами BNC, кабели и адаптеры BNC, оптические стойки и зажимы.
- Подключите синхросигнал от генератора функций к переключателю. Подключите другой порт коммутатора к генератору задержки.
- Подключите выход генератора функций к выводам преобразователя.
- Подключите выходы генератора задержки к каналу запуска на задней панели базового блока OCT. Выходной сигнал от генератора задержки представляет собой триггерный импульс, инициирующий движение сканирующей оптики в системе ОКТ.
- Включите компоненты системы (базовый блок OCT, компьютер, генератор функций и генератор задержки) и запустите программное обеспечение OCT.
- Настройте генератор задержки для отправки сигнала запуска транзистор-транзисторной логики на базовый блок OCT. Требования к сигналу запуска см. в руководстве по системе OCT.
- Расположите датчик под линзой ОКТ. На одном из концов преобразователя приклеен клиновидный наконечник, напечатанный на 3D-принтере, который служит источником упругих волн.
2. Получение изображения
- В программном обеспечении OCT выберите режим доплеровского захвата и включите внешний триггер.
- Поместите гранулированную биопленку под линзу в держатель образца и переместите ее к кончику датчика с помощью предметного столика. Убедитесь, что преобразователь плотно соприкасается с поверхностью образца, как показано на рисунке 2. Мы использовали две гранулированные биопленки (также известные как гранулированный ил) с разными номинальными диаметрами (4,3 мм и 3,3 мм). Этот выбор был сделан для изучения влияния размера биопленки на ее механические свойства. Они были получены в промышленных масштабах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель образца, использованный в этом исследовании, состоит из пластиковой пластины, напечатанной на 3D-принтере, с несколькими полусферическими углублениями. Этот держатель не позволяет проводить измерения в естественных условиях. Поэтому во время измерений мы вводили воду из естественной среды, чтобы предотвратить высыхание образца. - Укажите область сканирования, щелкнув начальную и конечную точки линии интереса (траектории распространения волны) в окне монитора образца. Отцентрируйте эту линию по отношению к наконечнику датчика и убедитесь, что она перпендикулярна краю наконечника.
- Укажите количество пикселей вдоль области сканирования и глубину образца, а также увеличьте количество B-сканов (2D-изображений поперечного сечения), которые необходимо записать, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум изображений OCE. Представленные результаты были получены с использованием 1523 пикселей по траектории сканирования и 1024 пикселей по глубине. Всего было сделано 50 В-сканов.
- Нажмите кнопку «Сканировать » и включите переключатель. На экране должны появиться изображения OCT и OCE. Активируйте переключатель в течение времени ожидания триггера и времени подготовки к сканированию.
- Убедитесь, что эталонная интенсивность находится в оптимальном диапазоне, и расположите образец в фокальной области объектива ОКТ-микроскопа. Правильно сфокусированный образец должен располагать своим верхним краем близко к верхнему краю изображения.
- Отрегулируйте контур фазы на изображении OCE на панели инструментов дисплея, увеличив большее значение цветовой полосы слева и уменьшив меньшее значение цветовой полосы справа. Это увеличит контраст бахромы.
- Настройте генератор функций на получение одночастотного синусоидального напряжения, нажав кнопку Sine на передней панели, и укажите начальную частоту возбуждения для измерений. Измерения в этом исследовании начинаются с 4 кГц и заканчиваются на 9,6 кГц. Включите разъем Output, нажав клавишу Output.
- Установите допустимое напряжение для измерения. Это значение должно обеспечить максимальную видимость полосы, но при этом избежать переноса фазы. Для биопленок в этом исследовании и диапазона частот измерений напряжение от 5 до 10 В обычно приводит к фазовой карте с хорошим контрастом.
- Получите изображения OCT и OCE, нажав кнопку Запись .
- Повторите измерения на разных частотах, чтобы получить изображения поперечного сечения упругого волнового поля с различными длинами волн (или периодами полос).
3. Анализ изображений
- Получите физический размер пикселей. Физический размер пикселя в x получается путем деления поля зрения в направлении x на размер изображения в направлении x и последующего умножения на коэффициент два. Физический размер пикселя в z получается путем деления поля зрения в направлении z на размер изображения в направлении z. Значения поля зрения и размера изображения хранятся в массиве структур с информацией об изображении, доступ к которой можно получить с помощью функции OCTFileOpen, входящей в состав MATLAB SDK в пакете ThorImageOCT.
- Получаем матрицы OCT и OCE с помощью функций OCTFileGetIntensity и OCTFileGetPhase соответственно и берем среднее значение записанных кадров. Эти функции предусмотрены в MATLAB SDK в пакете ThorImageOCT.
- Получите расположение пикселей верхнего края образца путем бинаризации изображения и обнаружения белых пикселей сверху вниз для каждого столбца.
- Извлеките фазовое распределение изображения OCE вдоль этого края с помощью функции improfile и вычислите суммарную длину дуги в реальных размерах. Вычислите длину дуги, взяв кумулятивную сумму нормы масштабированных разностей между последовательными точками в направлениях x и z.
- Вычислите пространственное быстрое преобразование Фурье измеренного фазового распределения ОКТ (т.е. по изображениям ОЦЭ) относительно кумулятивной длины дуги с помощью функции пломб.
- Определите расположение пика в спектре. Это местоположение представляет собой пространственную частоту волны. Рассчитайте скорость волны (или фазовую скорость) из отношения частоты возбуждения преобразователя (единицы Гц) и пространственной частоты (единицы обратной длины).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании мы использовали гранулированные биопленки (также известные как гранулированный ил), которые были получены в промышленных масштабах. Гранулы представляют собой сферические биопленки, которые образуются путем самоагрегации, что означает, что они не нуждаются в носителе или поверхностидля роста. На рисунке 3А показано репрезентативное ОКТ-изображение поперечного сечения, возникающее из-за пространственной изменчивости локального показателя преломления в зернистой биопленке. Биопленка имеет номинальный диаметр 3 мм. На изображении видны некоторые внутренние особенности, в том числе поры и пустоты, расположенные близко к поверхности образца. Повышенное оптическое рассеяние по глубине образца не позволяет источнику света ОКТ достичь центра образца, тем самым лишая центральную область какой-либо различимой информации. На рисунке 3B показано изображение поперечного сечения образца для частоты возбуждения преобразователя 5,1 кГц. Локальный контраст на изображении коррелирует с локальным вертикальным смещением, вызванным распространяющейся упругой волной в образце. Физическое расстояние полос вдоль трассы распространения соответствует длине волны упругой поверхностной волны. Поверхностная волна распространяется вблизи поверхности образца и имеет глубину проникновения, близкую к длине волны. Пространственная протяженность смещения поверхностной волны на изображении не видна из-за ограниченного оптического проникновения источника света ОКТ в образец. Для определения пространственной частоты поверхностной волны используется оптическое фазовое распределение вдоль пути распространения упругой волны (рис. 4А). Пространственная частота получается путем быстрого преобразования Фурье (БПФ; Рисунок 4Б) данных и выбор частоты, на которой величина спектра БПФ наибольшая.
Крайне важно выбрать напряжение генератора функций, достаточное для получения диаграммы направленности, которая демонстрирует оптимальный контраст на изображении OCE. Однако следует избегать чрезмерно больших напряжений, так как это может привести к переносу фаз на изображении OCE, как показано на рисунке 5A. Фазовое обертывание возникает из-за того, что оптическая разность фаз при измерении ограничена интервалом от -π до π. Когда фаза выходит за один из этих пределов, она сворачивается к противоположному пределу, создавая прерывистое фазовое распределение. Следовательно, возникает необходимость в фазовой распаковке, что создает проблемы и может привести к потенциальным неточностям. Еще одним фактором, который следует учитывать для точных измерений волн, является количество полос, присутствующих на изображении OCE. На низких частотах преобразователя, изображенных на рисунке 5B, полный цикл колебаний поверхностной волны может быть не полностью захвачен из-за малого размера гранулы, и спектр БПФ может дать ошибочные оценки пространственной частоты (или обратной длины волны). Другим источником ошибок в пространственной оценке частоты является наличие пространственно перекрывающихся мод упругих волн, таких как поверхностные волны и объемные сдвиговые волны, на ОКТ-изображении. Эти волновые режимы смешиваются, создавая сложные интерференционные картины, которые может быть трудно проанализировать. Наличие различных волновых мод, выходящих за рамки поверхностных волн, может привести к возникновению интерференционных эффектов вблизи преобразователя, зависящих от конкретного образца, частоты возбуждения и амплитуды. На рисунке 6 приведен пример ОЦЭ-изображения, полученного с частотой возбуждения 5,5 кГц, в котором объемная поперечная волна вблизи локальной точки возбуждения интерферирует с полем поверхностных волн. На рисунке 7А показано фазовое распределение, отличающееся от затухающей синусоидальной картины, наблюдаемой на рисунке 4А, что объясняется комбинацией волновых мод. Следовательно, результирующее БПФ имеет более широкий пик, как показано на рисунке 7B. То же самое явление может происходить вблизи дефектов, таких как пустоты или области с заметными изменениями упругих/вязкоупругих свойств. В этих областях локальное поле смещения модифицируется за счет интерференции падающей или поверхностной волны и рассеянных волн от дефекта.
Рассчитана скорость волны поверхностной волны на частотах от 4,0 до 9,6 кГц для двух гранулированных биопленок с разными номинальными диаметрами (4,3 мм и 3,3 мм). Графики скорости волны называются дисперсионными кривыми. Для используемых настроек каждое измерение дисперсии занимало примерно 15 минут. В пределах выбранного частотного интервала на изображениях OCE присутствует несколько циклов профиля синусоидального смещения, что позволяет точно определить пространственную частоту наряду с заметным фазовым контрастом. На рисунке 8 показаны полученные дисперсионные кривые. Эти кривые представляют собой средние кривые дисперсии для трех местоположений в каждом образце. Скорости поверхностных волн приближаются к постоянной величине, называемой скоростью волны Рэлея, cR, которая связана с модулем сдвига образца через соотношение,
cR = ((0,862 + 1,14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
где, G – модуль сдвига, r – плотность массы, ν – коэффициент Пуассона27,28. Она постоянна, потому что глубина проникновения упругой волны меньше диаметра образца. По сути, упругая волна распространяется близко к поверхности образца со скоростью, прямо пропорциональной квадрату модуля Юнга28. Однако из-за измерительного шума скорость волны не совсем постоянна в этом диапазоне частот. Возьмем среднее значение скоростей волн для частот от 6,0 до 9,6 кГц для меньшей выборки и от 4,0 до 9,6 кГц для большей выборки. Эта средняя скорость волны затем используется для оценки модуля Юнга образца.
Мы предполагаем, что образец несжимаем из-за высокого содержания воды. Таким образом, ν = 0,5. Таким образом, cR напрямую связано с E = 3G для несжимаемого твердого тела, где E – модуль Юнга образца27,28. Пунктирные линии на рисунке 8 представляют скорости волн Рэлея для различных образцов. Мы предполагаем, что состав биопленки состоит в основном из воды, что дает плотность 1000 кг/м3. Следовательно, расчетный модуль Юнга для гранулированных биопленок составляет 85 кПа и 205 кПа для гранулированных биопленок с номинальным диаметром 4,3 мм и 3,3 мм соответственно. Это измерение подтверждает способность метода различать различия в механических свойствах биопленок.
Рисунок 1: Установка оптической когерентной эластографии. Схема используемой здесь системы показана на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Смонтированный образец. Гранулированная биопленка располагается на держателе образца, в то время как датчик обеспечивает мягкий контакт с ней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: ОКТ- и ОКТ-изображения зернистой биопленки. (А) ОКТ-изображение. (B) Изображение OCE для поверхностной волны, распространяющейся с частотой 5,1 кГц, демонстрирующее хороший контраст полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Фазовое распределение и БПФ. Для изображения, показанного на рисунке 3B, (A) распределение разности фаз вдоль верхнего края образца и (B) БПФ распределения разности фаз, показывающее узкий пик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: ОКТ- и ОКТ-изображения зернистой биопленки. (A) Изображение OCE для поверхностной волны, распространяющейся с частотой 5,1 кГц, демонстрирующее фазовое обертывание. (B) Изображение OCE для поверхностной волны, распространяющейся с частотой 1,3 кГц без полного цикла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изображение OCE, показывающее комбинацию режимов. Это изображение получено из другого места выборки и иллюстрирует комбинацию мод для волны, распространяющейся с частотой 5,5 кГц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Фазовое распределение и БПФ. Для изображения, показанного на рисунке 6, (A) распределение разности фаз вдоль верхнего края образца и (B) БПФ распределения разности фаз, показывающее более широкий пик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Дисперсионные кривые. Скорость волны в двух выборках с разными размерами показана на разных частотах с помощью столбцов стандартного отклонения. Соответствующая скорость волны Рэлея для плоской части кривых показана сверху. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Достижимая глубина изображения в системе ОКТ определяется степенью проникновения света от источника света, которая зависит от длины волны источника. Кроме того, длина волны определяет осевое разрешение. Более длинные волны могут проникать глубже в образец, но за счет снижения осевого разрешения по сравнению с более короткими волнами. Поперечное разрешение, с другой стороны, зависит как от числовой апертуры системы, так и от длины волны, при этом более короткие длины волн обеспечивают более высокое разрешение. Увеличение числовой апертуры приводит к компромиссу за счет ограничения глубины резкости29. Пространственное разрешение ограничено самой короткой упругой длиной волны, которая может быть обнаружена при достаточном соотношении сигнал/шум. Текущая методология OCE ограничена 0,5 мм 9,30. Несмотря на то, что этот метод ограничен размером образца, он должен быть применим к различным типам биопленок. Форма биопленки, зернистая или плоская, не будет препятствовать технике. Прозрачность образца также играет роль в определении глубины проникновения. Материалы с высокой прозрачностью позволяют свету проходить через весь образец, делая его незаметным для наблюдения, в то время как непрозрачные образцы препятствуют проникновению света, давая минимальные сведения об их внутренней структуре 9,28. В контексте данного исследования достаточно глубины проникновения в миллиметровом диапазоне.
Другая возможная проблема для этих измерений заключается в том, что в больших образцах, в которых размер не ограничивает количество циклов упругих волн, поле зрения (FOV) ОКТ-микроскопа может быть ограничивающим фактором количества измеряемых циклов. Для измерений здесь поле зрения ограничено 9 мм на 9 мм; таким образом, упругие длины волн более 9 мм не могут быть разрешены в этом ОКТ-микроскопе. Использование объектива с более широким полем зрения позволит получать изображения более крупных образцов, получая больше полос на этих низких частотах. Проблемы возникают и на более высоких частотах. Для образцов в этом исследовании, за пределами 10 кГц, волна испытывает значительное затухание, уменьшая величину распределения разности фаз и усложняя определение пространственной частоты. Эту проблему можно смягчить, увеличив напряжение функционального генератора, тем самым увеличив смещение преобразователя. Тем не менее, увеличение смещения полезно только до определенного момента, так как это в конечном итоге приведет к фазовому обтеканию9. В качестве альтернативы, повышение чувствительности системы за счет использования источника света с более высокой мощностью может противодействовать фазовому обтеканию, вызванному большими перемещениями, и облегчить обнаружение динамического отклика на меньшие возбуждения. Более высокая чувствительность облегчает применение акустических методов OCE, которые обеспечивают преимущества бесконтактной нагрузки, но в большей степени подвержены влиянию высокого затухания31.
При проведении этих измерений на биопленках очень важно поддерживать образцы гидратированными. Сушка приводит к нежелательному увеличению жесткости, что не имеет значения, поскольку основное внимание уделяется оценке свойств образца в его родной среде. Мы не изучали сушку, вызванную освещением. Тем не менее, мы отмечаем, что вода из природной среды периодически добавлялась на протяжении всего измерения, и в течение этого времени морфология образца контролировалась с помощью ОКТ-изображений, и никаких заметных изменений в морфологии не наблюдалось. Кроме того, при размещении преобразователя и получении ОЦЭ-изображений важно учитывать особенности, различимые на ОКТ-изображении. Неоднородности вдоль пути распространения волны могут искажать волновое поле, и поэтому их следует избегать9. Кроме того, крайне важно поддерживать мягкий контакт с биопленкой, так как чрезмерное давление на образец, помимо потенциального изменения его механических характеристик, также может привести к искажению волнового поля. Наконец, область сканирования должна быть перпендикулярна волновым фронтам, чтобы гарантировать, что пространственная частота гармонической волны точно определена на основе измерения.
Для некоторых частот в обоих образцах наблюдались значительные различия в скоростях волн, что можно объяснить присущими им неоднородностями, волновым полем на этой конкретной частоте и морфологией путей распространения. Ранее мы показали, что измеренный профиль скорости волны в секционной гранулированной биопленке неоднороден из-за гетерогенной микроструктуры9. Следовательно, при использовании этого метода на гранулированных биопленках необходимо проводить измерения в нескольких местах по всему образцу, чтобы получить усредненное представление.
Важное наблюдение относительно дисперсионных кривых заключается в том, что они демонстрируют различное поведение для разных размеров выборки. В случае большей выборки кривая остается относительно постоянной во всем измеренном диапазоне. Однако для меньшей выборки наблюдается тенденция к увеличению скорости волны с увеличением частоты, особенно в нижней части диапазона. Это явление можно объяснить наличием вязкоупругих эффектов на более низких частотах и генерацией упругих волноводных мод. Мы учитывали эти эффекты в нашей предыдущей работе, используя более сложные обратные модели 8,9,18.
Важно отметить, что в аэробных гранулированных системах биомасса распределяется неравномерно по высоте реактора. Во время фаз без аэрации более крупные гранулы, как правило, оседают на дне реактора. Такое неравномерное распределение приводит к тому, что агрегаты разных размеров имеют доступ к различному количеству субстрата. В результате агрегаты разных размеров демонстрируют различный состав сообщества. Кроме того, поскольку избыточный ил удаляется избирательно, более крупные гранулы, как правило, задерживаются в реакторе в течение более длительных периодов времени, в то время как более мелкие удаляются легче32. Заметная разница в модуле Юнга предполагает потенциальную связь между составом биопленки, возрастом и механическими свойствами.
Таким образом, метод оптической когерентной эластографии (OCE) предлагает быстрый и неразрушающий способ оценки скорости упругой волны в биопленках. Этот метод преодолевает ограничения реологических измерений и обладает улучшенными характеристиками по сравнению с альтернативными методами эластографии 8,18. Более того, его применимость выходит за рамки гранулированных биопленок и охватывает любой частично прозрачный образец с подходящей глубиной оптического проникновения и размером, достаточно большим, чтобы быть разрешенным системой, включая такие примеры, как гидрогели33, роговица34 и кожа35. Будущие усовершенствования метода охватывают несколько ключевых аспектов. Во-первых, увеличение частоты гармонических упругих волн до диапазона сотен кГц позволит получить длины волн в несколько микрометров, тем самым достигнув пространственного разрешения в аналогичном масштабе. Во-вторых, отношение сигнал/шум оптической системы детектирования будет усилено за счет увеличения оптической мощности системы ОКТ с 2 мВт (ток) до 20 мВт. Наконец, мы заменим привод контактных гармоник на бесконтактный источник давления акустического излучения. Это дополнение облегчит неинвазивную и неразрушающую операцию и позволит исследовать образцы биопленки в их естественной среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят компанию Aqua-Aerobic Systems, Inc. (Рокфорд, штат Иллинойс, США) за предоставление гранулированных биопленок, изученных в этой работе. Авторы также выражают признательность Национальному научному фонду за поддержку в виде премий #210047 и #193729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M.
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al.
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
