Summary
Denna artikel belyser OCE-teknikens (optical coherence elastography) effektivitet när det gäller att snabbt och icke-destruktivt karakterisera biofilmens elastiska egenskaper. Vi belyser kritiska OCE-implementeringsprocedurer för noggranna mätningar och presenterar Youngs modulvärden för två granulära biofilmer.
Abstract
Biofilmer är komplexa biomaterial som består av ett välorganiserat nätverk av mikrobiella celler inneslutna i egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS). Denna artikel presenterar en detaljerad redogörelse för implementeringen av mätningar av optisk koherenselastografi (OCE) skräddarsydda för elastisk karakterisering av biofilmer. OCE är en icke-destruktiv optisk teknik som möjliggör lokal kartläggning av mikrostruktur, morfologi och viskoelastiska egenskaper hos delvis transparenta mjuka material med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Vi tillhandahåller en omfattande guide som beskriver de viktigaste procedurerna för korrekt implementering av denna teknik, tillsammans med en metod för att uppskatta bulken av Youngs modul av granulära biofilmer från de insamlade mätningarna. Dessa består av systeminställning, datainsamling och efterbehandling. I diskussionen fördjupar vi oss i den underliggande fysiken hos de sensorer som används i OCE och utforskar de grundläggande begränsningarna när det gäller de rumsliga och tidsmässiga skalorna för OCE-mätningar. Vi avslutar med potentiella framtida riktningar för att utveckla OCE-tekniken för att underlätta elastiska mätningar av miljöbiofilmer.
Introduction
Vid rening av avloppsvatten och återvinning av vattenresurser används i allt högre grad fördelaktiga biofilmer i anslutna tillväxtreaktorer för att göra det möjligt för mikrober att omvandla oönskade föroreningar, såsom organiskt material, kväve och fosfat, till stabiliserade former som lätt kan avlägsnas från vattnet1. I dessa system är biofilmens emergenta funktion, nämligen biokemiska omvandlingar, nära förknippad med mångfalden av mikrober som finns i den och de näringsämnen som dessa mikrober får2. Följaktligen kan pågående biofilmstillväxt utgöra en utmaning för att upprätthålla konsekvent reaktorfunktionalitet eftersom den nya biofilmtillväxten kan förändra biofilmens övergripande metaboliska processer, massöverföringsegenskaper och samhällssammansättning. Att stabilisera biofilmmiljön så mycket som möjligt kan skydda mot sådana förändringar3. Detta inkluderar att säkerställa ett konsekvent flöde av näringsämnen och hålla biofilmens struktur stabil med en jämn tjocklek4. Genom att övervaka biofilmens styvhet och fysiska struktur skulle forskarna kunna få insikt i biofilmens allmänna hälsa och funktion.
Biofilmer uppvisar viskoelastiska egenskaper 5,6,7. Denna viskoelastiska natur resulterar i en kombination av en omedelbar och långsam, tidsberoende deformation som svar på yttre mekaniska krafter. En unik aspekt av biofilmer är att de, när de utsätts för betydande deformation, reagerar som trögflytande vätskor. Omvänt, när de utsätts för mindre deformation, är deras respons jämförbar med fasta ämnen5. Dessutom, inom denna lilla deformationsregion, finns det ett deformationsområde under vilket biofilmer uppvisar ett linjärt kraft-förskjutningsförhållande 5,6,7. Deformationer inom detta linjära område är optimala för att bedöma biofilmens mekaniska egenskaper eftersom dessa ger reproducerbara mätningar. Flera tekniker kan kvantifiera det elastiska svaret inom detta intervall. Optisk koherenselastografi (OCE) är en framväxande teknik som anpassas för att analysera biofilmer i detta linjära område (stammar i storleksordningen 10-4-10-5)8,9.
OCE:s mest etablerade tillämpning hittills är inom det biomedicinska området, där tekniken har tillämpats för att karakterisera biologiska vävnader som endast kräver ytlig optisk åtkomst. Till exempel använde Li et al. OCE för att karakterisera de elastiska egenskaperna hos hudvävnad10. Andra författare karakteriserade de anisotropa elastiska egenskaperna hos svin och mänsklig hornhinnevävnad och hur de påverkas av intraokulärt tryck 11,12,13,14,15,16. Några fördelar med OCE-metoden för att studera biofilmer är att den är icke-destruktiv och ger mesoskalig rumslig upplösning, den kräver ingen provberedning och metoden i sig är snabb; Den ger samregistrerade mätningar av fysisk struktur och elastiska egenskaper (t.ex. porositet, ytjämnhet och morfologi)8,9,17,18.
OCE-metoden mäter den lokala förskjutningen av elastiska vågor i ett prov med hjälp av faskänslig optisk koherenstomografi (OCT). OCT är en optisk interferometer med låg koherens som omvandlar lokala förändringar i provförskjutningen till en intensitetsförändring som registreras med en optisk spektrometer. OCT-tekniken har också använts inom biofilmforskning för karakterisering av mesoskalig struktur, porositetsfördelning i tre dimensioner och biofilmsdeformation 17,19,20,21. Dessutom uppskattade Picioreanu et al. biofilmens mekaniska egenskaper med hjälp av invers modellering av OCT-tvärsnittsdeformationsbilder22.
Å andra sidan ger OCE-mätningar, i kombination med omvänd elastodynamisk vågmodellering, våghastigheten för elastiska vågor i provet, vilket möjliggör karakterisering av provets elastiska och viskoelastiska egenskaper. Vår grupp anpassade OCE-tekniken för kvantitativ mätning av biofilmens elastiska och viskoelastiska egenskaper 8,9,18 och validerade tekniken mot skjuverreometrimätningar i agarosgelplattprover18. OCE-metoden ger exakta och tillförlitliga uppskattningar av biofilmens egenskaper eftersom den uppmätta elastiska våghastigheten är korrelerad med provets elastiska egenskaper. Dessutom kan det rumsliga sönderfallet av den elastiska vågamplituden direkt korreleras med de viskoelastiska egenskaperna på grund av viskösa effekter i materialet. Vi har rapporterat OCE-mätningar av viskoelastiska egenskaper hos bakteriebiofilmer med blandad kultur odlade på kuponger i en roterande ringformig reaktor (RAR) och granulära biofilmer med komplexa geometrier med hjälp av elastodynamiska vågmodeller18.
OCE-tekniken är också ett kraftfullt alternativ till traditionell reometri18som används för viskoelastisk karakterisering. Reometrimetoder lämpar sig bäst för prover med plan geometri. Som sådan kan granulära biofilmer, som har godtyckliga former och ytmorfologier, inte karakteriseras exakt på en reometer 8,23. Dessutom, till skillnad från OCE, kan reometrimetoder vara utmanande att anpassa för realtidsmätningar, till exempel under biofilmstillväxt i flödesceller24,25.
I denna artikel visar vi att OCE-mätningar av ytvågors frekvensoberoende våghastighet kan användas för att karakterisera biofilmens elastiska egenskaper utan behov av komplicerade modeller. Denna utveckling kommer att göra OCE-metoden mer tillgänglig för den bredare biofilmsgemenskapen för att studera biofilmens mekaniska egenskaper.
Figur 1 visar en schematisk illustration av OCT-systemet som används i denna studie. Systemet innehåller flera instrument, inklusive ett kommersiellt faskänsligt OCT-system med spektraldomän, en fördröjningsgenerator, en funktionsgenerator och en piezoelektrisk givare. OCT-systemet fungerar enligt principen om interferometri genom att använda en bredbandsljuskälla med en mittvåglängd på 930 nm. Den insamlade ljusintensiteten, som är korrelerad med intrikata strukturella detaljer i provet, analyseras i efterbehandlingsenheten och konverteras sedan till en tvärsnittsbild av provet - vanligen kallad OCT-bild. OCT-avbildningsdjupet beror på svårighetsgraden av den optiska spridningen i provet som härrör från lokal variation i brytningsindex och är begränsad till 1-3 mm i biologiska vävnader och biofilmer. Eftersom den optiska fasen i sample och interferensintensiteten moduleras av rörelse, kan OCT användas för att detektera den lokala provförskjutningen. Vi utnyttjar förskjutningskänsligheten hos OCT i OCE-metoden för att spåra steady state-förskjutningsfältet för elastiska vågor i provet. Specifikt matar funktionsgeneratorn ut en sinusformad spänning för att driva den piezoelektriska givaren. Givaren sträcker sig i sin tur och drar ihop sig med en oscillerande tidshistorik. Den oscillerande förskjutningen av givaren ger en sinusformad kraft på provytan genom en 3D-printad kilspets vid givarens spets, vilket leder till generering av harmoniska elastiska vågor i provet. Kilspetsen har lätt kontakt med provet, så att provet förblir intakt efter att ställdonet har dragits tillbaka från provytan. För att registrera den lokala förskjutningen i provet hämtas intilliggande djupskanningar separerade med en fast tidsfördröjning vid varje pixel i provet. Den optiska fasskillnaden mellan på varandra följande skanningar vid varje pixelpunkt är proportionell mot den lokala vertikala förskjutningen vid samma punkt. Synkronisering mellan givarens förskjutning och skanningsoptiken i OCT-systemet uppnås genom en triggerpuls som kommer från funktionsgeneratorn och fördröjs i fördröjningsgeneratorn. Detta synkroniseringssteg underlättar insamlingen av konsekventa tvärsnittsbilder av den lokala optiska fasfördelningen i provet. Dessa bilder är direkt proportionella mot den lokala vertikala harmoniska förskjutningen i exemplet och kallas OCE-bilden. OCE-bilder tas vid olika givaraktiveringsfrekvenser för att erhålla den elastiska våglängden och våghastigheten som en funktion av frekvensen. De uppmätta våghastigheterna analyseras med en elastodynamisk modell för att bestämma provets elastiska egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inställning av systemet
- Samla systemkomponenterna som inkluderar det kommersiella OCT-systemet (basenhet, stativ, bildhuvud och dator), vågformsgenerator, givare, fördröjnings-/pulsgenerator, en switch med BNC-anslutningar, BNC-kablar och adaptrar, optiska stolpar och clamps.
- Anslut synksignalen från funktionsgeneratorn till en switch. Anslut den andra porten på omkopplaren till fördröjningsgeneratorn.
- Anslut funktionsgeneratorns utgång till givarkablarna.
- Anslut utgångarna på fördröjningsgeneratorn till triggerkanalen på baksidan av OCT-basenheten. Utsignalen från fördröjningsgeneratorn är en triggerpuls för att initiera rörelsen hos skanningsoptiken i OCT-systemet.
- Slå på systemkomponenterna (OCT-basenhet, dator, funktionsgenerator och fördröjningsgenerator) och starta OCT-programvaran.
- Konfigurera fördröjningsgeneratorn för att skicka en logisk triggersignal för transistor-transistor till OCT-basenheten. Se OCT-systemmanualen för kraven på triggersignalen.
- Placera givaren under OCT-linsen. Givaren har en 3D-printad kilspets limmad på en av dess ändar som fungerar som en linjekälla för elastiska vågor.
2. Bildinsamling
- På OCT-programvaran väljer du Doppler Acquisition Mode och aktiverar den externa triggern.
- Placera den granulära biofilmen under linsen i en provhållare och flytta den mot givarens spets med hjälp av ett translationssteg. Se till att givaren har mild kontakt med sample yta, som visas i figur 2. Vi använde två granulära biofilmer (även känt som granulärt slam) med olika nominella diametrar (4,3 mm och 3,3 mm). Detta urval gjordes för att undersöka biofilmens storlek på dess mekaniska egenskaper. Dessa erhölls kommersiellt.
OBS: Provhållaren som används i denna studie består av en 3D-printad plastplatta med flera halvsfäriska fördjupningar. Denna hållare tillåter inte mätningar under ursprungliga förhållanden. Därför tillförde vi vatten från den naturliga miljön under mätningarna för att förhindra att provet torkar. - Ange skanningsområdet genom att klicka på Start och slutpunkter för intresseraden (sökväg för vågutbredning) i exempelövervakningsfönstret. Centrera denna linje i förhållande till givarens spets och se till att den är vinkelrät mot spetsens kant.
- Ange antalet pixlar längs skanningsområdet och samplingens djup och öka antalet B-skanningar (2D-tvärsnittsbilder) som ska spelas in för att förbättra signal-brusförhållandet för OCE-bilderna. De presenterade resultaten erhölls med hjälp av 1523 pixlar längs skanningsbanan och 1024 pixlar längs djupet. Totalt gjordes 50 B-skanningar.
- Klicka på knappen Skanna och slå PÅ strömbrytaren. OCT- och OCE-bilderna ska visas på skärmen. Aktivera omkopplaren inom utlösarens timeout-tid och skanningsförberedelsetiden.
- Se till att referensintensiteten ligger inom det optimala intervallet och placera provet inom fokalområdet för OCT-mikroskopets objektiv. Ett korrekt fokuserat prov bör ha sin övre kant nära bildens överkant.
- Justera faskonturen i OCE-bilden i displayens verktygsfält genom att öka det högre värdet på den vänstra färgraden och minska det lägre värdet på den högra färgraden. Detta kommer att öka franskontrasten.
- Konfigurera funktionsgeneratorn för att producera en sinusformad spänning med en frekvens genom att trycka på sinusknappen på frontpanelen och ange startexcitationsfrekvensen för mätningarna. Mätningarna i denna studie börjar vid 4 kHz och slutar vid 9,6 kHz. Aktivera utgångskontakten genom att trycka på utgångsknappen.
- Ställ in en acceptabel voltage för mätningen. Det här värdet bör maximera synligheten för kanterna, men även undvika fasbrytning. För biofilmerna i denna studie och frekvensområdet för mätningarna resulterar en spänning mellan 5 och 10 V vanligtvis i en faskarta med god kontrast.
- Hämta OCT- och OCE-bilderna genom att klicka på knappen Spela in .
- Upprepa mätningarna vid olika frekvenser för att få tvärsnittsbilder av det elastiska vågfältet med olika våglängder (eller fransperioder).
3. Bildanalys
- Hämta den fysiska storleken på pixlarna. Den fysiska pixelstorleken i x erhålls genom att dividera synfältet i x-riktningen med bildstorleken i x-riktningen och sedan multiplicera med en faktor två. Den fysiska pixelstorleken i z erhålls genom att dividera synfältet i z-riktningen med bildstorleken i z-riktningen. Värdena för synfält och bildstorlek lagras i strukturmatrisen med bildinformationen som kan nås med OCTFileOpen-funktionen som finns i MATLAB SDK i ThorImageOCT-paketet.
- Hämta OCT- och OCE-matriserna med hjälp av funktionerna OCTFileGetIntensity respektive OCTFileGetPhase och ta medelvärdet av de inspelade bildrutorna. Dessa funktioner finns i MATLAB SDK i ThorImageOCT-paketet.
- Hämta pixelplatserna för provets övre kant genom att binärisera bilden och identifiera de vita pixlarna uppifrån och ned för varje kolumn.
- Extrahera OCE-bildens fasfördelning längs den här kanten med hjälp av improfile-funktionen och beräkna den kumulativa båglängden i verkliga dimensioner. Beräkna båglängden genom att ta den kumulativa summan av normen för skalade skillnader mellan på varandra följande punkter i x- och z-leden.
- Beräkna den rumsliga snabba Fouriertransformen av den uppmätta OCT-fasfördelningen (dvs. från OCE-bilderna) med avseende på den kumulativa båglängden med hjälp av plomb-funktionen.
- Bestäm toppens placering i spektrumet. Denna plats representerar vågens rumsliga frekvens. Beräkna våghastigheten (eller fashastigheten) från förhållandet mellan givarens excitationsfrekvens (enheter av Hz) och den rumsliga frekvensen (enhet av omvänd längd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den här studien använde vi granulära biofilmer (även känt som granulärt slam), som erhölls kommersiellt. Granulat är sfäriska biofilmer som bildas genom självaggregering, vilket innebär att de inte kräver en bärare eller yta att växa på26. Figur 3A visar en representativ tvärsnittsbild av OCT som uppstår på grund av den rumsliga variationen av det lokala brytningsindexet i en granulär biofilm. Biofilmen har en nominell diameter på 3 mm. Några av de inre egenskaperna, inklusive porer och hålrum som ligger nära provets yta, syns i bilden. Ökad optisk spridning längs provets djup förhindrar OCT-ljuskällan från att nå mitten av provet, vilket gör att det centrala området saknar märkbar information. Figur 3B visar tvärsnittsbilden av provet för en givarexcitationsfrekvens på 5,1 kHz. Den lokala kontrasten i bilden är korrelerad med den lokala vertikala förskjutningen som induceras av den utbredande elastiska vågen i provet. Det fysiska avståndet mellan fransarna längs utbredningsvägen motsvarar våglängden för den elastiska ytvågen. Ytvågen sprider sig nära provytan och den har ett penetrationsdjup som ligger nära våglängden. Den rumsliga utsträckningen av ytvågsförskjutningen ses inte i bilden på grund av den begränsade optiska penetrationen av OCT-ljuskällan i provet. Den optiska fasfördelningen längs den elastiska vågutbredningsvägen (figur 4A) används för att bestämma ytvågens rumsliga frekvens. Den rumsliga frekvensen erhålls genom att ta den snabba Fouriertransformen (FFT; Figur 4B) av data och välja den frekvens vid vilken storleken på FFT-spektrumet är störst.
Det är viktigt att välja en funktionsgeneratorspänning av tillräcklig storlek för att producera ett fransmönster som uppvisar optimal kontrast i OCE-bilden. Alltför stora spänningar bör dock undvikas eftersom detta kan resultera i faslindning i OCE-bilden, som illustreras i figur 5A. Faslindning uppstår eftersom den optiska fasskillnaden i mätningen är begränsad till intervallet mellan -π och π. När fasen överskrider en av dessa gränser viks den till motsatt gräns, vilket skapar en diskontinuerlig fasfördelning. Följaktligen uppstår behovet av fasuppackning, vilket innebär utmaningar och kan leda till potentiella felaktigheter. En annan faktor att ta hänsyn till för exakta vågmätningar är antalet fransar som finns i OCE-bilden. Vid låga givarfrekvenser, som visas i figur 5B, kan det hända att en fullständig svängningscykel av ytvågen inte fångas upp helt på grund av granulets lilla storlek, och FFT-spektrumet kan ge felaktiga uppskattningar av den rumsliga frekvensen (eller den omvända våglängden). En annan felkälla i den rumsliga frekvensuppskattningen är närvaron av rumsligt överlappande elastiska vågmoder, såsom ytvågor och skjuvvågor, i OCT-bilden. Dessa våglägen blandas och skapar komplicerade interferensmönster som kan vara svåra att analysera. Närvaron av olika våglägen bortom ytvågor kan introducera interferenseffekter nära givaren, beroende på det specifika provet, excitationsfrekvensen och amplituden. Figur 6 är ett exempel på en OCE-bild erhållen med en excitationsfrekvens på 5,5 kHz, där en bulkskjuvvåg nära den lokala excitationspunkten interfererar med ytvågsfältet. Figur 7A visar en fasfördelning som avviker från det sönderfallande sinusvågsmönstret som observerats i figur 4A, vilket tillskrivs kombinationen av vågmoder. Följaktligen uppvisar den resulterande FFT en bredare topp, som visas i figur 7B. Samma fenomen kan förekomma nära defekter som hålrum eller regioner med markanta variationer i elastiska/viskoelastiska egenskaper. I dessa områden modifieras det lokala förskjutningsfältet på grund av interferens av den infallande eller ytvågen och de spridda vågorna från defekten.
Vi beräknade våghastigheten för ytvågen vid frekvenser mellan 4,0 och 9,6 kHz för två granulära biofilmer med olika nominella diametrar (4,3 mm och 3,3 mm). Våghastighetsdiagrammen kallas dispersionskurvor. För de inställningar som användes tog varje spridningsmätning cirka 15 minuter. Inom det valda frekvensintervallet finns flera cykler av den sinusformade förskjutningsprofilen i OCE-bilderna, vilket möjliggör exakt bestämning av rumslig frekvens tillsammans med anmärkningsvärd faskontrast. Figur 8 illustrerar de erhållna spridningskurvorna. Dessa kurvor representerar de genomsnittliga spridningskurvorna för tre platser inom varje prov. Ytvågshastigheterna närmar sig ett konstant värde, kallat Rayleigh-våghastigheten, cR, som är relaterad till samplingens skjuvmodul genom relationen,
cR = ((0,862 + 1,14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
där G är skjuvmodulen, r är masstätheten och ν är Poissons förhållande27,28. Den är konstant eftersom penetrationsdjupet för den elastiska vågen är kortare än provets diameter. I huvudsak färdas den elastiska vågen nära provets yta med en våghastighet som är direkt proportionell mot kvadraten på Youngs modul28. På grund av mätbrus är dock våghastigheten inte helt konstant i detta frekvensområde. Vi tar medelvärdet av våghastigheterna för frekvenser mellan 6,0 och 9,6 kHz för det mindre urvalet och mellan 4,0 och 9,6 kHz för det större urvalet. Denna genomsnittliga våghastighet används sedan för att uppskatta Youngs modul för provet.
Vi antar att provet är inkomprimerbart på grund av dess höga vattenhalt. Som sådan är ν = 0,5. Således är cR direkt relaterad till E = 3G för ett inkompressibelt fast ämne, där E är Youngs modul för provet27,28. De streckade linjerna i figur 8 representerar Rayleigh-våghastigheterna för de olika proverna. Vi antar en biofilmssammansättning som huvudsakligen består av vatten, vilket ger en densitet på 1000 kg/m3. Följaktligen är Youngs beräknade modul för de granulära biofilmerna 85 kPa och 205 kPa för de granulära biofilmerna med nominella diametrar på 4,3 mm respektive 3,3 mm. Denna mätning bekräftar teknikens förmåga att urskilja skillnader i mekaniska egenskaper mellan biofilmerna.
Figur 1: Inställning av optisk koherens elastografi. Schemat för det system som används här visas i figuren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Monterat prov. Den granulära biofilmen är placerad på provhållaren medan givaren har en försiktig kontakt med den. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: OCT- och OCT-bilder av granulär biofilm. (A) OCT-bild. (B) OCE-bild för en ytvåg som sprider sig vid 5,1 kHz och som visar god franskontrast. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fasfördelning och FFT. För bilden som visas i figur 3B, (A) fasskillnadsfördelning längs provets övre kant och (B) FFT av fasskillnadsfördelningen som visar en smal topp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: OCT- och OCT-bilder av granulär biofilm. (A) OCE-bild för en ytvåg som utbreder sig vid 5,1 kHz som visar faslindning. (B) OCE-bild för en ytvåg som utbreder sig vid 1,3 kHz utan en fullständig cykel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 6: OCE-bild som visar en kombination av lägen. Den här bilden är från en annan plats i exemplet och illustrerar kombinationen av lägen för en våg som sprider sig vid 5,5 kHz. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Fasfördelning och FFT. För bilden som visas i figur 6, (A) fasskillnadsfördelning längs provets övre kant och (B) FFT av fasskillnadsfördelningen som visar en bredare topp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Spridningskurvor. Våghastigheten i två samplingar med olika storlekar visas vid olika frekvenser med standardavvikelsestaplar. Motsvarande Rayleigh-våghastighet för den flacka delen av kurvorna ritas överst. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det uppnåeliga avbildningsdjupet i OCT-systemet bestäms av graden av ljusgenomträngning från ljuskällan, vilket beror på källans våglängd. Dessutom bestämmer våglängden den axiella upplösningen. Längre våglängder kan tränga djupare in i provet men på bekostnad av minskad axiell upplösning jämfört med kortare våglängder. Tvärgående upplösning, å andra sidan, är beroende av både systemets numeriska bländare och våglängden, med kortare våglängder som ger högre upplösning. Att öka den numeriska bländaren introducerar en kompromiss genom att begränsa skärpedjupet29. Den rumsliga upplösningen är begränsad till den kortaste elastiska våglängden som kan detekteras med ett tillräckligt signal-brusförhållande. Den nuvarande OCE-metoden är begränsad till 0,5 mm 9,30. Även om denna teknik begränsas av provets storlek, bör den vara tillämplig på olika typer av biofilm. Formen på biofilmen, granulär eller platt, kommer inte att hämma tekniken. Provets transparens spelar också en roll för att bestämma penetrationsdjupet. Material med hög transparens gör det möjligt för ljus att passera genom hela provet, vilket gör det omärkligt för observation, medan ogenomskinliga prover hindrar ljusgenomträngning, vilket ger minimala detaljer om deras inre struktur 9,28. I samband med denna studie räcker det med ett penetrationsdjup i millimeterområdet.
Ett annat möjligt problem för dessa mätningar är att i större prover, där storleken inte begränsar antalet elastiska vågcykler, kan OCT-mikroskopets synfält (FOV) vara den begränsande faktorn för antalet uppmätta cykler. För mätningar här är synfältet begränsat till 9 mm x 9 mm; således kan elastiska våglängder längre än 9 mm inte lösas i detta OCT-mikroskop. Att använda en lins med ett bredare synfält skulle möjliggöra avbildning av större prover, vilket ger fler fransar vid dessa lägre frekvenser. Utmaningar uppstår även vid högre frekvenser. För proverna i denna studie, bortom 10 kHz, upplever vågen en betydande dämpning, vilket minskar storleken på fasskillnadsfördelningen och komplicerar bestämningen av den rumsliga frekvensen. Detta problem kan mildras genom att öka spänningen i funktionsgeneratorn och därigenom öka givarens förskjutning. Att öka förskjutningen är dock bara användbart upp till en viss punkt eftersom detta så småningom kommer att hamna i faslindning9. Alternativt kan man genom att förbättra systemets känslighet genom att implementera en ljuskälla med högre effekt motverka faslindning orsakad av större förskjutningar och underlätta detekteringen av den dynamiska responsen på mindre excitationer. En högre känslighet underlättar implementeringen av akustiska OCE-metoder som erbjuder fördelen med beröringsfri belastning men som påverkas mer djupgående av den höga dämpningen31.
När man utför dessa mätningar på biofilmer är det viktigt att hålla proverna hydrerade. Torkning leder till en oönskad ökning av styvheten, vilket är irrelevant eftersom fokus ligger på att bedöma provets egenskaper i sin ursprungliga miljö. Vi studerade inte belysningsinducerad torkning. Vi noterar dock att vatten från den naturliga miljön tillsattes med jämna mellanrum under hela mätningen, och under den tiden övervakades provets morfologi genom OCT-bilderna, och inga märkbara förändringar i morfologin observerades. Dessutom, när du placerar givaren och tar OCE-bilder, är det viktigt att ta hänsyn till de egenskaper som urskiljs i OCT-bilden. Heterogeniteter längs vågutbredningsvägen har potential att förvränga vågfältet och bör därför undvikas9. Dessutom är det viktigt att upprätthålla en försiktig kontakt med biofilmen, eftersom överdrivet tryck på provet, förutom att potentiellt modifiera dess mekaniska egenskaper, också kan leda till förvrängning av vågfältet. Slutligen måste skanningsområdet vara vinkelrätt mot vågfronterna för att säkerställa att den rumsliga frekvensen för den harmoniska vågen bestäms exakt från mätningen.
För vissa frekvenser observerades signifikanta variationer i våghastigheter i båda proverna, vilket kan tillskrivas deras inneboende heterogeniteter, vågfält vid den specifika frekvensen och morfologi av utbredningsvägarna. Vi har tidigare visat att den uppmätta våghastighetsprofilen över en snittad granulär biofilm är ojämn på grund av den heterogena mikrostrukturen9. Följaktligen, när man använder denna teknik på granulära biofilmer, är det absolut nödvändigt att utföra mätningar på flera platser i provet för att härleda en genomsnittlig representation.
En viktig observation när det gäller spridningskurvorna är att de uppvisar distinkta beteenden för olika urvalsstorlekar. När det gäller det större urvalet förblir kurvan relativt konstant över det uppmätta området. För det mindre urvalet finns det dock en uppåtgående trend i våghastighet med ökande frekvens, särskilt i den nedre delen av intervallet. Detta fenomen kan tillskrivas närvaron av viskoelastiska effekter vid lägre frekvenser och genereringen av elastiska vågledarlägen. Vi tog hänsyn till dessa effekter i vårt tidigare arbete med hjälp av mer sofistikerade inversa modeller 8,9,18.
Det är viktigt att notera att i aeroba granulära system är biomassan inte jämnt fördelad över reaktorns höjd. Under icke-luftningsfaser tenderar större granuler att lägga sig på botten av reaktorn. Denna ojämna fördelning resulterar i att ballast av olika storlekar har tillgång till olika mängder substrat. Som ett resultat uppvisar aggregat av olika storlekar en distinkt samhällssammansättning. Dessutom, eftersom överskottsslam avlägsnas selektivt, tenderar större granulat att hållas kvar i reaktorn under längre perioder, medan mindre granulat lättare avlägsnas32. Den märkbara skillnaden i Youngs modul tyder på ett potentiellt samband mellan biofilmens sammansättning, ålder och mekaniska egenskaper.
Sammanfattningsvis erbjuder OCE-metoden (Optical Coherence Elastography) ett snabbt och icke-destruktivt sätt att bedöma elastisk våghastighet i biofilmer. Denna metod övervinner begränsningarna för reologiska mätningar och uppvisar förbättrade egenskaper jämfört med alternativa elastografitekniker 8,18. Dessutom sträcker sig dess tillämplighet bortom granulära biofilmer för att omfatta alla delvis transparenta prover med lämpligt optiskt penetrationsdjup och storlek som är tillräckligt stor för att kunna lösas upp av systemet, inklusive exempel som hydrogeler33, hornhinna34 och hud35. Metodens framtida utveckling omfattar flera viktiga aspekter. För det första kommer en ökning av frekvensen av harmoniska elastiska vågor till hundratals kHz att möjliggöra våglängder på några mikrometer och därigenom uppnå rumslig upplösning i liknande skala. För det andra kommer signal-brusförhållandet för det optiska detekteringssystemet att förbättras genom att öka OCT-systemets optiska effekt från 2 mW (ström) till 20 mW. Slutligen kommer vi att ersätta kontaktdonet med en beröringsfri akustisk strålningstryckkälla. Detta tillägg kommer att underlätta icke-invasiv och icke-destruktiv drift och göra det möjligt att undersöka biofilmprover i deras ursprungliga miljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar Aqua-Aerobic Systems, Inc. (Rockford, IL, USA) för att ha tillhandahållit de granulära biofilmer som studerats i detta arbete. Författarna erkänner också National Science Foundations stöd via Award #210047 och #193729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M.
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al.
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
