Summary
3D-printen op micrometerschaal maakt snelle prototyping mogelijk van polymere apparaten voor neuronale celculturen. Als proof-of-principle werden structurele verbindingen tussen neuronen beperkt door barrières en kanalen te creëren die de uitgroei van neurieten beïnvloedden, terwijl de functionele gevolgen van dergelijke manipulatie werden waargenomen door extracellulaire elektrofysiologie.
Abstract
Neuronale culturen zijn al tientallen jaren een referentie-experimenteel model. 3D-celrangschikking, ruimtelijke beperkingen op neurietuitgroei en realistische synaptische connectiviteit ontbreken echter. Dit laatste beperkt de studie van structuur en functie in de context van compartimentering en vermindert de betekenis van culturen in de neurowetenschappen. Het benaderen ex vivo van de gestructureerde anatomische rangschikking van synaptische connectiviteit is niet triviaal, ondanks het feit dat het de sleutel is tot het ontstaan van ritmes, synaptische plasticiteit en uiteindelijk de pathofysiologie van de hersenen. Hier wordt twee-fotonpolymerisatie (2PP) gebruikt als een 3D-printtechniek, waardoor de snelle fabricage van polymere celkweekapparaten met behulp van polydimethyl-siloxaan (PDMS) op micrometerschaal mogelijk wordt. Vergeleken met conventionele replicagiettechnieken op basis van microfotolitografie, maakt 2PP-printen op microschaal een snelle en betaalbare doorlooptijd van prototypes mogelijk. Dit protocol illustreert het ontwerp en de fabricage van PDMS-gebaseerde microfluïdische apparaten die gericht zijn op het cultiveren van modulaire neuronale netwerken. Als proof-of-principle wordt een apparaat met twee kamers gepresenteerd om de connectiviteit fysiek te beperken. In het bijzonder wordt de voorkeur gegeven aan een asymmetrische axonale uitgroei tijdens de ex vivo-ontwikkeling en mag deze van de ene kamer naar de andere worden geleid. Om de functionele gevolgen van unidirectionele synaptische interacties te onderzoeken, worden commerciële micro-elektrode-arrays gekozen om de bio-elektrische activiteit van onderling verbonden neuronale modules te monitoren. Hier worden methoden geïllustreerd om 1) mallen te fabriceren met micrometerprecisie en 2) in vitro multisite extracellulaire opnames uit te voeren in corticale neuronale culturen van ratten. Door de kosten te verlagen en in de toekomst wijdverbreide toegankelijkheid van 2PP 3D-printen te bereiken, zal deze methode steeds relevanter worden in onderzoekslaboratoria over de hele wereld. Vooral op het gebied van neurotechnologie en high-throughput neurale gegevensregistratie zal het gemak en de snelheid van prototyping van vereenvoudigde in vitro-modellen de experimentele controle en het theoretische begrip van in vivo grootschalige neurale systemen verbeteren.
Introduction
Het onderzoeken van neuronale activiteit in zich gedragende organismen brengt verschillende uitdagingen met zich mee. Fysieke toegang tot het hersenweefsel wordt bijvoorbeeld beperkt door de noodzaak om de integriteit ervan te behouden, dus de oppervlakkige gebieden van de hersenen worden gemakkelijker overwogen. Het isoleren van specifieke doelwitten in het intacte weefsel is vaak een ontmoedigende taak en soms onmogelijk. Hoewel gedissocieerde homogene neuronale culturen gemakkelijke toegang bieden tot de moleculaire, biochemische en biofysische eigenschappen van individuele (sub)cellulaire componenten van een neuraal circuit, gaat een realistische connectiviteit en anatomische organisatie van de intacte hersenen verloren. Deze fundamentele beperkingen inspireerden onderzoeksinspanningen om een middenweg te bereiken, waarbij in vivo complexiteit wordt vermeden terwijl de structuur in vitro kan worden geconstrueerd, wat op aanvraag is 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Met name modulaire neuronale culturen zijn de afgelopen decennia onderwerp geweest van uitgebreid onderzoek, met als doel de belangrijkste vragen van de hersenfysiologie aan te pakken, zoals hieronder beschreven.
Organisatie: In vivo studies tonen aan dat de hersenen anatomisch gestructureerd zijn in lagen met precieze celtypen en reeksen projecties. Functionele assays onthulden de organisatie van de neuronale netwerken in knooppuntassemblages en modules, met nauwkeurige connectiviteitsschema's10,11. De rol van connectiviteits- en microcircuitmotieven kan echter niet adequaat in vivo worden bestudeerd vanwege het enorme aantal synapsen dat erbij betrokken is, evenals de verweven effecten van ontwikkeling en activiteitsafhankelijke plasticiteit.
Signaaloverdracht: In in vivo of willekeurige in vitro culturen is het een uitdaging om de signaaloverdracht te beoordelen. Het onderzoeken van de axonale geleidings- en actiepotentiaal over de lengte ervan vereist het begeleiden van neurietuitgroei door oppervlaktefunctionalisatie of chemische patronen, wat een hoge signaal-ruisverhouding oplevert bij extracellulaire uitlezingen van elektrische activiteit12.
Translationele relevantie: Het ontcijferen van de exclusieve rol van pre- versus post-synaptische elementen bij pathologische aandoeningen vereist toegang tot deze elementen afzonderlijk. Modulaire culturen met beperkte connectiviteit, die de pre- en postsynaptische elementen effectief scheiden, zijn daartoe onmisbare hulpmiddelen13.
Er bestaan verschillende methoden om een of andere vorm van structuur in neuronale cultuur te verkrijgen. Ze kunnen grofweg worden gecategoriseerd als chemische en fysische oppervlaktemanipulatie9. De eerste methoden 14,15 zijn gebaseerd op de neiging van neuronale cellen om zich te hechten aan bepaalde (bio)chemische verbindingen. Dit vereist het aanbrengen van lijm of aantrekkelijke moleculen op een oppervlak met precisie op microschaal en volgens een gedetailleerd patroon. Hoewel dit een gedeeltelijke dekking van het oppervlak van de cellen mogelijk maakt, volgens het gewenste patroon, zijn chemische methoden inherent beperkt en hebben ze een relatief laag slagingspercentage bij neurietgroeibegeleiding16. Volledige controle over de richting van axonen vereist het vaststellen van een ruimtelijke gradiënt van ad-hoc chemicaliën om axonale geleiding vorm te geven17. De laatste methoden omvatten fysieke oppervlaktemanipulatie en worden vaker gebruikt om de neuronale netwerken in vitro te structureren. Neuronale cellen worden fysiek beperkt op de gewenste locaties door geometrische opsluitingen, zoals microscopisch kleine kamers, wanden, kanalen, enz., waardoor een biocompatibel polymeer zoals polydimethylsiloxaan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 wordt uitgehard en gestold tot een microfluïdisch apparaat. De de facto methode voor PDMS-microfluïdische fabricage is zachte fotolithografie21, waarbij een tweedimensionaal masker op microschaal wordt gevormd en wordt gebruikt om selectief een op silicium gebaseerd materiaal te etsen bij blootstelling aan UV-straling. In een notendop, een UV-uithardende hars (d.w.z. fotoresist) wordt gecoat op een siliciumwafer door middel van spin-coating, waarbij een specifieke hoogte wordt bereikt die wordt bepaald door de viscositeit en spinsnelheid. Vervolgens wordt het masker met patroon over de fotoresist geplaatst en blootgesteld aan UV-licht. Transparante gebieden in het masker, die overeenkomen met interessegebieden, laten UV-licht gelokaliseerde verknoping van de fotoresistmoleculen induceren. De gebieden met onbelichte fotoresist worden weggespoeld met een oplosmiddel, wat resulteert in de vorming van een hoofdmal. Dit wordt herhaaldelijk gebruikt om een elastomeer naar keuze (d.w.z. PDMS) te bakken, dat vervolgens met de gewenste geometrieën wordt gegraveerd in zoveel replica's als gewenst. Een dergelijke productiemethode is de meest gebruikelijke methode om microfluïdische apparaten te fabriceren22. Misschien zijn de belangrijkste beperkingen van zachte fotolithografie de voorwaarde voor aanzienlijke kapitaalinvesteringen en de onbekendheid van biologische laboratoria met de vereiste technieken en expertise. De voorbereiding van het masker en de stappen van zachte fotolithografie die nodig zijn om complexe geometrieën met een hoge hoogte-, hoogte-, aspectverhoudingsgewijs te ontwerpen, zijn niet triviaal23 en vereisen vaak uitbesteding. Hoewel er alternatieve en low-budget methoden zijn voorgesteld, voldoen deze niet altijd aan de hoge precisie-eisen van biologische prototyping24.
Hier wordt een alternatieve productiemethode gepresenteerd, gebaseerd op twee-fotonpolymerisatie (2PP) en additive manufacturing. Het is eenvoudig en vereist niet per se geavanceerde expertise op het gebied van microfabricage en microfotolitografie. Het onderzoeksgebied van 2PP-microfabricage ontstond eind jaren '9025 en is sindsdien getuige geweest van een exponentiële groei26. Meer over de basisprincipes van deze techniek is elders te vinden26. In het kort, door de excitatielichtimpuls in de driedimensionale ruimte te focussen, maakt 2PP gebruik van de niet-lineaire afhankelijkheid van multifotonabsorptie van intensiteit. Dit geeft de mogelijkheid van beperkte absorptie, waardoor nauwkeurige en selectieve excitatie binnen zeer gelokaliseerde regio's wordt gegarandeerd. In wezen wordt een fotoresist met negatieve tinten, een materiaal met verminderde oplosbaarheid bij blootstelling aan licht, onderworpen aan een gefocusseerde bundel femtoseconde laserpulsen bij een lage inschakelduur27. Dit maakt impulsen met hoge intensiteiten mogelijk bij lage gemiddelde vermogens, waardoor polymerisatie mogelijk is zonder het materiaal te beschadigen. De interactie van foto-geïnduceerde radicale monomeren geeft aanleiding tot radicale oligomeren, die polymerisatie initiëren die zich door de fotoresist uitstrekt tot een bepaald volume, d.w.z. voxel, waarvan de grootte afhangt van de intensiteit en duur van de laserpulsen28.
In dit werk worden twee componenten gepresenteerd: A) het ontwerp en de snelle fabricage van een 3D-geprinte mal, die vele malen kan worden hergebruikt om wegwerpbare polymere neuronale celkweekapparaten te produceren (Figuur 1), en B) hun mechanische koppeling aan het oppervlak van vlakke neuronale celkweeksubstraten, of zelfs van substraat-geïntegreerde micro-elektrode-arrays die in staat zijn tot multisite-opnames van bio-elektrische signalen.
Computer Assisted Design van een 3D mechanisch model wordt hier zeer kort beschreven en gaat vergezeld van de stappen die leiden tot een 3D-geprinte mal en het fabriceren van PDMS-apparaten wordt ook gedetailleerd.
Een verscheidenheid aan computerondersteunde ontwerpsoftwaretoepassingen kan worden gebruikt om het startende 3D-objectmodel te genereren en een STL-bestand te produceren om het 2PP-printproces te besturen. In de Materiaaltabel zijn de eerste en de laatste vermelde applicaties gratis of voorzien van een gratis licentie. Voor het maken van een 3D-model moet altijd een 2D-schets worden gemaakt, die vervolgens in de volgende modelleringsstappen wordt geëxtrudeerd. Om dit concept te demonstreren, wordt een generiek 3D CAD-softwareontwerpproces belicht in het protocolgedeelte, wat leidt tot een structuur gemaakt van overlappende kubussen. Voor uitgebreidere informatie zijn een aantal online tutorials en gratis trainingsbronnen beschikbaar, zoals aangegeven in de Materiaaltabel.
Het resulterende STL-bestand wordt vervolgens vertaald in een reeks commando's die door de 3D-printer moeten worden uitgevoerd (d.w.z. slicing-procedure). Voor de specifieke 2PP 3D-printer die in gebruik is, wordt de software DeScribe gebruikt om het STL-bestand te importeren en om te zetten naar het eigen General Writing Language (GWL)-formaat. Het succes van het 2PP-printproces hangt af van verschillende parameters, met name laservermogen en de scansnelheid, stik- en arcering-snijafstanden. De keuze van deze parameters, samen met de selectie van objectief en fotoresist, hangt af van de kleinste kenmerken van het ontwerp en van de beoogde toepassing. Parameteroptimalisatie wordt dus essentieel om te voldoen aan de eisen van verschillende ontwerpscenario's en gebruiksscenario's. Voor dit werk is het aanbevolen recept IP-S 25x ITO Shell (3D MF) overwogen als configuratie voor de afdrukparameters. Uiteindelijk wordt een mechanisch stabiel geprint onderdeel geprint met de nodige resolutie terwijl de 3D-printtijd wordt geminimaliseerd.
Het matrijsontwerp en het bijbehorende STL-bestand, gedemonstreerd in dit werk, bestaat uit een vierkant frame om de ruimte van een celcultuur in twee compartimenten te scheiden: een buitengebied (d.w.z. later aangeduid als Bron) en een binnengebied (d.w.z. later aangeduid als Target). Deze twee compartimenten zijn verbonden door sets van microkanalen, elk gekenmerkt door scherpe hoekranden, ontworpen om specifiek de groei van neurieten van het doelwit naar de bron te belemmeren, maar niet andersom, en als zodanig een directionele synaptische connectiviteit te bevorderen tussen neuronen die op de twee gebieden groeien.
Eerdere studies gebruikten verschillende geometrieën van microkanalen om de directionele groei van neurieten te stimuleren. Voorbeelden hiervan zijn driehoekige vormen18, kanaalprikkelstructuren19 en taps toelopende kanalen20. Hier wordt een ontwerp gebruikt met scherpe hoekbarrières over de grenzen van het microkanaal, ook gekenmerkt door asymmetrische ingangen. Deze microkanalen dienen om continuïteit tot stand te brengen tussen een gesloten binnenruimte, het doelcompartiment, en het externe gebied, het broncompartiment. De trechtervorm van het eerste deel van de microkanalen, vanaf de kant van de Bron, is ontworpen om de vorming van axonale bundels en hun groei langs het kortste, d.w.z. rechte lijn, pad te bevorderen dat de Bron met het Doel verbindt. De driehoekige ruimte die wordt gerealiseerd door scherpe hoeken te zien, heeft een groter volume aan de doelzijde om te streven naar het effectief vertragen van het vinden van neurieten, terwijl het snel afschieten van bundels afkomstig van de Bron en het bezetten van de beschikbare ruimte wordt bevorderd. De keuze van 540 μm voor de lengte van de microkanalen filtert effectief de over het algemeen kortere dendritische uitgroei39. Bovendien voorkomt hun hoogte van 5 μm dat de celsomata door de microkanalen dringen. Over het algemeen bleek deze configuratie de unidirectionele connectiviteit tussen de buitenste, bron- en binnenste doelmodules te bevorderen, en het wordt hier gepresenteerd als een proof-of-principle tussen de vele alternatieve keuzes.
Terwijl de PDMS-apparaten, vervaardigd door de 2PP-mal, kunnen worden bevestigd aan het oppervlak van gewone celkweeksubstraten, zoals glazen dekglaasjes of petrischalen, werden in dit werk in de handel verkrijgbare substraat-geïntegreerde micro-elektrode-arrays gebruikt. Er is geen moeite gedaan om het 3D-ontwerp te optimaliseren voor de lay-out van de micro-elektrode-array, en de mechanische koppeling werd uitgevoerd onder stereomicroscopiebegeleiding die alleen gericht was op het positioneren van het apparaat over de array, waarbij een micro-elektrode aan beide zijden, de bron en het doel, onbedekt bleef. Dit maakt een voorlopige beoordeling mogelijk van de functionele gevolgen van de beperkte connectiviteit in neuronale celculturen.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden behandeld, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en Italiaanse wetgeving (Richtlijn van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 [2010/63/EU]; Italiaans regeringsdecreet van 4 maart 2014, nr. 26), werden uitdrukkelijk goedgekeurd door de institutionele OpBA (Committee for Animal Care) van de Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati en werden officieel goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (Auth. No. 22DAB. N.UVD). Deze leidden tot de beschikbaarheid van niet-bewust materiaal uit het geëxplanteerde hersenweefsel van ratten, dat kan worden gebruikt voor de experimentele validatie van de methode die in dit werk wordt gepresenteerd.
1. 3D matrijsfabricage door polymerisatie van twee fotonen
- Genereren van de CAD-bestanden
OPMERKING: De volgende stappen demonstreren een generieke 3D-ontwerpworkflow, waarbij gebruik wordt gemaakt van computerondersteunde ontwerpsoftware (d.w.z. SolidWorks). Het voorbeeld van een STL-ontwerpbestand dat in dit werk wordt beschreven (Figuur 2) is beschikbaar als aanvullend coderingsbestand 1, evenals via Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).- Start de desktoptoepassing Computer Aided Design Software. Selecteer in de bovenste menubalk de optie Nieuw.
- Kies uit de opties de optie Onderdeel: een 3D-weergave van één ontwerponderdeel. Druk op de toetsencombinatie Ctrl + 5 om het bovenaanzicht van de schets tot stand te brengen.
- Selecteer in het zijpaneel Schets en kies Hoekrechthoek. Selecteer een rand van de rechthoek door erop te klikken. Als er een parameterpaneel verschijnt, stelt u de lengte in op 100 eenheden.
- Herhaal stap 1.1.3 voor de rand loodrecht op de vorige: stel de lengte in op 50 eenheden. Selecteer de rechthoek door eroverheen te slepen terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt.
- Selecteer in het menu Relatie toevoegen de optie Repareren om de relaties tussen regels te beperken.
- Sluit de schets af en herhaal stap 1.1.3 tot en met 1.1.5, waarbij u een nieuwe (kleinere) rechthoek maakt, die de vorige schets overlapt.
- Selecteer in het zijpaneel Functies en kies Geëxtrudeerde naaf/basis: stel de diepte van zowel de grote als de kleine rechthoeken in op respectievelijk 5 en 10 eenheden.
- Sla het onderdeel in het menu Bestand op in STL-indeling (d.w.z. Standard Tessellation Language).
- Verwerking van de CAD-bestanden
- Breng het STL-bestand over naar een pc die is uitgerust met de DeScribe-applicatiesoftware.
- Start Beschrijven en open vanuit het menu Bestand het STL-bestand. Er verschijnt een 3D-weergave van het model.
- Draai het model in het gedeelte Oriëntatie in het menu aan de rechterkant om het op de juiste manier in de ruimte te oriënteren en centreer het in het vlak.
- Pas de algehele schaling aan door het gedeelte Schalen van het menu aan de rechterkant te selecteren.
- Selecteer in het vervolgkeuzemenu bovenaan het recept voor IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Dit specificeert IP-S als fotoresist, 25x voor de vergrotingskracht van het objectief, Indium Tin Oxide (ITO) gecoat substraat als printsubstraat en shell en scaffold printing als bedrijfsmodus met middelgrote functies (MF).
- Navigeer door de wizard en selecteer en stel de snijafstand in op 1 μm en de arceringsafstand op 0,5 μm voor zowel de schaal als de steiger.
- Definieer in de uitvoerstap van de importwizard onder splitsen de blokgrootte als X = 200 μm, Y = 200 μm en Z = 265 μm en de blokoffset als X = 133 μm, Y = 133 μm en Z = 0, waarbij u ervoor zorgt dat de delicate structuren van de microkanalen niet worden aangetast door de stiklijnen.
- Gebruik als scanmodus de standaardinstelling: Galvo voor X-Y-vlak en Piëzo voor de Z-as.
- Druk op Opslaan en vervang in het volgende tekstuele menu de regel var $baseLaserPower = $shellLaserPower door var $baseLaserPower = 75, om het laservermogen op de onderste laag van de afdruk tot 75% te verminderen.
- Breng de GWL-bestanden die door de bovenstaande stappen zijn verkregen, over naar het werkstation dat speciaal is bedoeld voor 2PP 3D-printen.
- 3D-printen en monsterontwikkeling
- Start de NanoWrite-toepassingssoftware . Klik na de initialisatie van de printer op Exchange Holder op de software-interface om de substraathouder te plaatsen en het objectief te monteren.
- Monteer het 25x objectief in de juiste positie op het neusstuk. Identificeer welke kant van het glassubstraat is gecoat met ITO, door een elektronische multimeter die is ingesteld om weerstanden te meten: de meting moet lage waarden zijn, zoals 100-300 Ω, maar alleen voor de ITO-gecoate kant.
- Plaats het glassubstraat op de houder en richt de ITO-gecoate kant naar boven. Gebruik tape om het stevig op zijn plaats te houden.
- Breng onder de chemische zuurkast een druppel IP-S fotoresist aan in het midden van het glassubstraat.
- Plaats de houder in de 3D-printer, met de harsdruppel naar het objectief gericht (d.w.z. naar beneden).
- Laad de GWL-bestanden via het menu Bestand van de software. Selecteer Naderingsmonster om het objectief dicht bij de harsdruppel te plaatsen.
- Selecteer Interface zoeken om detectie van de ITO-fotoresist-afdrukinterface mogelijk te maken, op basis van het verschil in brekingsindex van de twee materialen.
- Selecteer Taak starten om het afdrukken te starten. Als het afdrukken klaar is, drukt u op Exchange Holder om de houder op te halen.
- Pak de houder en verwijder voorzichtig het substraat met het geprinte deel. Dompel het glassubstraat gedurende 20 minuten onder in propyleenglycolmethyletheracetaat (PGMEA) onder de zuurkast om het geprinte onderdeel te ontwikkelen.
- Verwijder het substraat van PGMEA en dompel het 5 minuten onder in isopropanol. Laat het geprinte onderdeel aan de lucht drogen, onder de chemische zuurkast.
- Nabewerking en matrijsmontage
- Hard het geprinte onderdeel uit door blootstelling aan UV-licht (d.w.z. 365-405 nm) met voldoende vermogen gedurende 5-20 minuten (zie Discussie voor stroomdetails).
- Verwijder onder een laminaire stroomkap voorzichtig het geprinte deel van het glassubstraat. Druppel ~2 μL hars op de bodem van een petrischaal van 35 mm x 10 mm.
- Plaats het geprinte onderdeel voorzichtig over de druppel en laat de hars onder het onderdeel stromen. Hard het geprinte onderdeel verder uit door blootstelling aan UV-licht, gedurende 5 min.
- Dek de petrischaal af met de dop en zet hem in de oven om te drogen, gedurende 30 minuten op 80 °C. Verwarm de oven niet voor om vervorming of breuk van het bedrukte onderdeel te voorkomen. Na uitharding wordt het geprinte deel permanent aan de bodem van de petrischaal bevestigd. Vanaf nu wordt het geprinte en gemonteerde onderdeel matrijs genoemd.
2. PDMS-apparaatfabricage van de mal en celcultuursubstraten
- Fabricage van PDMS-apparaten
- Bereid 20 ml 10:1 (gewichtsverhouding) mengsel van de basis en hetuithardingsmiddel van niet-gepolymeriseerd PDMS. Voor elk apparaat, en afhankelijk van de vereiste hoogte, is 1-2 ml PDMS-mengsel voldoende. Bewaar het teveel aan niet-gepolymeriseerd PDMS bij -20 °C voor later gebruik.
- Roer het mengsel onder een laminaire stroomkap gedurende 4 minuten grondig door. Omdat het mengsel de luchtbellen gelijkmatig vasthoudt, wordt het ondoorzichtig.
- Breng het mengsel over in een μbuis van 50 μL en centrifugeer het gedurende 5 minuten op 168 x g om luchtbellen uit het mengsel te verwijderen en een helder uiterlijk te krijgen.
- Behandel de mal met 10 μL hydrofoob middel (d.w.z. Repel-silaan ES) en laat het 7 minuten rusten, zodat het gepolymeriseerde PDMS later soepel loskomt van de mal.
- Spoel de mal 1x af met 70% ethanol en 2x met gedeïoniseerd (DI) water. Laat de mal aan de lucht drogen onder de laminaire stromingskap.
- Giet het PDMS-mengsel voorzichtig op de mal, totdat de beoogde eindhoogte van het apparaat is bereikt. Om de vorming van luchtbellen te voorkomen, giet u het mengsel voorzichtig en van dichtbij bij het oppervlak van de vorm.
- Dek de vorm af en breng deze gedurende 18 minuten over naar een voorverwarmde en gestabiliseerde oven op 80 °C, om uit te harden. Verleng bij apparaathoogtes van meer dan 5 mm en tot 1 cm de uithardingstijd van 18 tot 25 min.
- Maak onder de laminaire stroomkap het uitgeharde PDMS-blok voorzichtig los van de mal en dompel het gedurende ten minste 10 minuten onder in isopropanol in een glazen petrischaal. Isopropanol elimineert niet-verknoopte PDMS. Houd het PDMS-blok altijd afgedekt.
- Vernieuw de isopropanol en snijd onder een stereomicroscoop voorzichtig het centrale vierkante gedeelte van het apparaat uit (in dit werk geïdentificeerd als het doelgebied) met een oogheelkundig steekmes. Snijd vervolgens verder langs de randen om de uiteindelijke vorm van het apparaat te bereiken.
- Haal het apparaat uit isopropanol en dompel het 30 minuten onder in ethanol, en spoel het vervolgens 3x af met steriel DI-water. Handhaaf vanaf dit punt de steriliteit.
- Breng het apparaat onder een laminaire stroomkap over in een nieuwe petrischaal, waarbij u de dop een beetje open laat. Laat het volledig aan de lucht drogen.
- Apparaatmontage en voorbereiding van celkweeksubstraten.
- Steriliseer elke micro-elektrodenreeks (MEA's) door ze 30 minuten onder te dompelen in 70% ethanol en spoel deze vervolgens 3x af met steriel DI-water.
- Monteer het PDMS-apparaat met behulp van een steriel fijn pincet, onder een laminaire stroomkap en stereomicroscoop, op het binnenste gedeelte van een MEA. Lijn één kant van het PDMS-apparaat uit met het midden van het binnenste MEA-gebied, met substraatgeïntegreerde micro-elektroden, zodat er weinig micro-elektroden onbedekt blijven van zowel het bron- als het doelgebied (zie afbeelding 2).
NOTITIE: Voor dit werk is het niet nodig om MEA-micro-elektroden uit te lijnen met het microkanaal van het PDMS-apparaat. Een zachte druk op het apparaat kan nodig zijn om een goede afdichting tussen het PDMS-apparaat en het MEA-oppervlak te bereiken. Vermijd ten koste van alles om de micro-elektroden aan de punt van het pincet aan te raken. - Steek de MEA met PDMS-apparaat erop in de plasmareinigingskamer om de oppervlakteactivering door middel van luchtplasma te activeren. Begin het proces met een vacuümpompevacuatie van 4 minuten van de kamer. Open vervolgens het luchtventiel een beetje om gecontroleerd ontluchten mogelijk te maken. Sluit de luchtklep en schakel de plasma-inductoren in, waarbij u het RF-vermogensniveau instelt tussen 10 W en 18 W.
- Zodra er een gloeiend licht verschijnt, laat u het proces 80 seconden lopen. Schakel vervolgens de plasma-inductor uit, sluit de vacuümpompklep en open voorzichtig de luchtklep. Open de kamer om de MEA op te halen.
OPMERKING: Als de plasmabehandeling inhoudt dat MEA's worden blootgesteld aan een niet-steriele omgeving, plaats dan elke MEA gedurende 30 minuten onder UV-licht in een laminaire stroomkap om de steriliteit te garanderen. - Voeg 1 ml polyethyleenimine (PEI) 0,1% gew./vol-oplossing toe aan de MEA en incubeer deze gedurende een nacht bij 37 °C. Zuig de PEI-oplossing op en spoel 5x met steriel DI-water. Voeg 1 ml van het celkweekmedium toe aan de MEA en incubeer het voordat de cellen worden gezaaid.
3. Neuronale celkweek en elektrofysiologie
- Bereid van tevoren het dissectiemedium, de digestieoplossing en de oplossingen 1-3 voor (zie tabel 1).
- Gedissocieerde neuronale celkweek.
- Pak een neonatale Wistar-rattenpup van 0-1 dagen oud voorzichtig bij de snuit en voer een snelle onthoofding uit met een scherpe schaar.
- Verwijder de huid van de hoofdhuid, maak een incisie langs de sagittale middellijn van de schedel met een fijne schaar en maak vervolgens een coronale snede door de schedel op de kruising van het cerebellum.
- Verwijder de schedel, schep de hersenen eruit met een fijne spatel en breng deze over op koud (4 °C) dissectiemedium.
- Verwijder het subcorticale weefsel, de hippocampus en de hersenvliezen. Hak het weefsel in kleine stukjes (d.w.z. 1-2mm3) en breng ze over in een buisje van 15 ml. Gooi de oplossing weg en spoel het weefsel met vers dissectiemedium, gevolgd door een wasbeurt met digestiemedium.
- Gooi het digestiemedium weg en voeg vervolgens 1 ml oplossing 1 toe. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 37 °C. Gooi oplossing 1 weg en spoel het weefsel met vers dissectiemedium. Voeg vervolgens 1 ml oplossing 2 toe en bewaar het mengsel 10 minuten bij 4 °C.
- Gooi oplossing 2 weg en spoel het weefsel met vers dissectiemedium. Voeg vervolgens 1 ml oplossing 3 toe. Dissocieer de cellen mechanisch door de oplossing 20 tot 30 keer langzaam op en neer te pipetteren. Als er een uniform troebel mengsel van gedissocieerde cellen verschijnt, verhoogt u het volume tot 3 ml door dissectiemedium toe te voegen.
- Verzamel de celpellet door het mengsel gedurende 5 minuten op 100 x g te centrifugeren. Zuig het supernatans op en resuspendeer de celpellet in 1 ml voorverwarmd kweekmedium.
- Tel cellen (d.w.z. door een celtelkamer) en pas de dichtheid van de celzaaioplossing dienovereenkomstig aan.
- Zaai elke MEA met 1 ml zaaioplossing met een nominale celdichtheid van 1,8 x 106 (~ 6500 cellen/mm2). Incubeer de gezaaide MEA's in een vochtige incubator bij 37 °C en 5% CO2 . Vervang het medium om de 2 dagen door vers (d.w.z. wekelijks gemaakt) kweekmedium.
- Extracellulaire elektrofysiologie
OPMERKING: Gedissocieerde neuronale celculturen bereiken een volledig volgroeid elektrisch fenotype na 2-3 weken in vitro. De volgende secties beschrijven een extracellulair stimulatieprotocol met behulp van een commerciële MEA-toepassingssoftware (Experimenter) om een van de neuronale populaties die in modules zijn gekweekt, d.w.z. Source of Target, elektrisch te stimuleren, terwijl tegelijkertijd de activiteit van beide populaties wordt geregistreerd in volwassen netwerken.- Monteer voorzichtig een MEA in de hoofdtrap van de meerkanaals elektronische versterker, in een droge incubator (37 °C, 5% CO2) en laat deze gedurende 10 minuten intrekken. Een op maat gemaakte PDMS-dop kan afzonderlijk worden vervaardigd en worden gebruikt als een strakke afdekking voor elke MEA, om waterverdamping te verminderen en de steriliteit te behouden.
- Start de Experimenter-software. Stel de bemonsteringsfrequentie in op 25 kHz en start de data-acquisitie door op Start DAQ te drukken. In het deelvenster Gegevensweergave worden de ruwe sporen van extracellulair geregistreerde activiteit voor elk kanaal weergegeven.
- Bewaak de spontane activiteit en identificeer en selecteer visueel 3 paren naburige micro-elektroden die actief zijn tijdens bursts van netwerkbrede spontane gesynchroniseerde activiteitsbursts, hetzij van de micro-elektroden aan de bron- of doelzijde.
- Configureer in het stimulatorpaneel van de software de parameters voor elk van de stimulerende micro-elektrodeparen in bipolaire configuratie: selecteer een bifasische pulsgolfvorm en stel de piekamplitudes in op ± 800 mV en de pulsduur op 200 μs.
- Stel de recorder in en neem op voor een periode van 300 ms voor tot 1000 ms na de stimulatie.
- Herhaal stap 3.3.3 tot en met 3.3.5 voor de bron- en de doelzijde op een interleaved manier voor het vereiste aantal herhalingen.
Representative Results
De fabricage van een 2-compartiment polymeer (neuronaal) celkweekapparaat wordt hier gerapporteerd, een voorbeeld van het gebruik van 2PP 3D-printen voor snelle prototyping van PDMS-apparaten. In het bijzonder wordt een apparaat geproduceerd voor modulaire neuronale netwerken met unidirectionele synaptische connectiviteit en wordt de functionele karakterisering ervan gepresenteerd in termen van multisite extracellulaire elektrofysiologie. In het kort werd een mal op micrometerschaal gerealiseerd door middel van direct laserschrijven, met behulp van een in de handel verkrijgbare 3D-printer. In het bijzonder levert de printer een vermogen van 50 mW door middel van laserpulsen met een middengolflengte van 780 nm en een duur van 80 tot 100 fs. Tijdens het fabricageproces wordt de laserstraal door het objectief (25x, NA=0,8) van de printer gericht op de negatieve-toon fotoresist (IP-S) om het afdrukvolume te scannen met behulp van de galvoscanner voor de x- en y-as en de piëzo-tafel voor de z-as. Het printvolume werd op passende wijze opgesplitst in blokken van 200 mm x 200 mm x 265 mm om een matrijs te realiseren met een totale afmeting van 6500 mm x 6500 mm x 545 mm en een nominaal volume van 12.423 ml. Figuur 2A geeft een 2D-schets van de mal weer, waarbij de afmetingen en de grootte van de kenmerken worden benadrukt, terwijl figuur 2B een close-upfoto toont van het voltooide apparaat dat op een MEA is gemonteerd. De mallen die waren voorbereid zoals beschreven in de vorige sectie waren duurzaam en konden meer dan 50 keer worden hergebruikt om PDMS-apparaten te fabriceren.
De geprinte mal werd gebruikt voor het gieten van het PDMS-apparaat, dat vervolgens werd gemonteerd op het binnenste gebied van glassubstraat geïntegreerde arrays van micro-elektrodenarrays (MEA), om te worden gebruikt voor extracellulaire opnames van neuronale elektrische activiteit op meerdere locaties en als een proof-of-principle. Commerciële substraat-geïntegreerde MEA's werden gebruikt om de activiteit van modulaire culturen te volgen als reactie op ruimtelijk gelokaliseerde elektrische stimuli die extracellulair werden toegediend door een subset van micro-elecrode die zich in elk kweekcompartiment bevond. Elke MEA bevat 120 titaniumnitraat (TiN) micro-elektroden met een diameter van 30 μm en 100 μm inter-elektrodespoed. Figuur 2C-D toont de plaatsing van het PDMS-apparaat op de bovenkant van de MEA. De geometrische kenmerken van individuele microkanalen van het apparaat, samen met de totale voetafdruk van de kamer zoals weergegeven in figuur 2C, leiden tot een compartimentering van de gekweekte neuronen. Deze kunnen worden onderscheiden op basis van het compartiment waartoe ze behoren, in het buitenste gedeelte (Bron) van het apparaat of in het binnenste gebied (Target) van het apparaat. De geprefereerde axonale geleiding, beperkt van de bron tot het doel, wordt bepaald door de scherpe randen van de microkanalen. Figuur 2D toont de plaatsing van het polymere apparaat op de MEA en het relatieve dekkingsgebied van de opname-elektroden die zich in de bron- of doelcompartimenten bevinden. Merk op dat een nauwkeurige uitlijning van de binnenkant van de microkanalen van het apparaat met een of meer rijen MEA-micro-elektroden niet vereist was voor onze casestudy en ook niet werd nagestreefd.
Representatief bewijs van asymmetrische neurietgroei wordt geleverd in figuur 3, tijdens de ex vivo ontwikkeling, waarbij fluorescerend gelabelde neurieten worden getoond in live beeldvorming, 6 dagen (Figuur 3A) en 2 dagen na celplating (Figuur 3B-D). Terwijl de neurieten aan de doelzijde van het apparaat scherpe hoekbarrières tegenkwamen als obstakels die hun voortgang door de ruimte belemmerden, groeiden de neurieten die afkomstig waren van de Bronzijde ononderbroken en staken de kanalen over. Deze asymmetrie bevordert een unidirectionele axonale verbinding tussen neuronen in de twee compartimenten, projecterend van Bron naar Doel, zoals expliciet bedoeld in het ontwerp. Dit resultaat wordt verder ondersteund door een (functionele) elektrofysiologische evaluatie van elektrische reacties die worden opgeroepen door stimuli die afwisselend in elk van de twee compartimenten worden toegediend.
Na 3-4 weken in vitro, toen neuronale netwerken volledig volwassen waren29,30, kon de functionele connectiviteit tussen de twee compartimenten worden gesondeerd bij het leveren van korte elektrische stimuli en het monitoren van de neuronale reacties die ze opriepen31. Bifasische elektrische impulsen met een amplitude van 800 mV werden vervolgens afwisselend alleen toegepast op de bron of alleen op de doelpopulaties (N herhalingen = 150, N modulaire culturen = 6), geleverd door 3 naast elkaar geplaatste paren vlakke micro-elektroden in een bipolaire configuratie en op een interleaved manier. Daarom kunnen de 3 paar elektroden zich in het brongebied van de MEA of in het doelgebied van de MEA bevinden. De elektrische reacties die door elke stimulus worden opgewekt, kunnen vervolgens worden gedetecteerd door alle MEA-micro-elektroden na een voortplantingsvertraging. Opnames werden uitgevoerd met een bemonsteringsfrequentie van 25 kHz/kanaal, en de resulterende extracellulaire ruwe elektrische signalen werden gedigitaliseerd met een analoog-naar-digitaal conversieresolutie van 16 bits. Een algoritme voor het detecteren van pieken bij het overschrijden van drempels32 werd offline gebruikt om het tijdstip van optreden van extracellulaire actiepotentialen te detecteren, zonder enige spikesortering uit te voeren. Figuur 4A-B laat duidelijk een sterke asymmetrie zien van opgewekte reacties, 150 keer herhaald, afhankelijk van de locatie van de stimulusafgifte, wat wijst op een significante functionele impact van de geometrische beperkingen op de gewenste directionaliteit van connectiviteit. In feite, na het stimuleren van de Bron-kant, nam de vuursnelheid van de Bron-neuronale populatie - geschat door het berekenen van het peri-stimulus spike-times histogram - toe zoals verwacht, waardoor een volledige netwerk-burst van actiepotentialen 33,31,34 werd gegenereerd en het werd, na een vertraging, gevolgd door een toename van de vuursnelheid van de Doelpopulatie. Naarmate de stimulatie echter binnen de doelpopulatie werd gegeven, nam alleen de vuursnelheid van de doelpopulatie toe, waarbij de bronpopulatie grotendeels stil bleef. Figuur 4C-D herhaalt hetzelfde stimulus/respons-paradigma in een controlecultuur, zonder dat er een polymeer apparaat aanwezig was (d.w.z. een ongestructureerde neuronale cultuur), de extracellulaire stimuli werden ook afgeleverd gedurende 4 herhalingen. Voor dergelijke controlecondities trad geen asymmetrie op in de reacties die door beide stimulusen werden opgeroepen. Hoewel de subset van MEA-micro-elektroden die werden gebruikt om de stimuli af te geven, overeenkwam met die in modulaire netwerken, leidde de locatie van de stimulusafgifte tot een vergelijkbare opgewekte respons van de hele populatie. Dit bevestigt dat het PDMS-apparaat de voorkeur gaf aan unidirectionele synaptische connectiviteit, over de twee compartimenten. Over het algemeen duiden asymmetrische responsen opgewekt in modulaire culturen (N = 6) en symmetrische responsen opgewekt in controleculturen (N = 4) sterk op een beperkte anatomische connectiviteit van een gecompartimenteerd in vitro systeem. De elektrofysiologische gegevens en de scripts die worden gebruikt om figuur 4 te genereren, worden beschikbaar gesteld via Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).
Figuur 1: Schets van de fabricage van de 2PP-micromatrijs en PDMS-replicagieten. (A) Een 3D-model wordt ontworpen in CAD en geëxporteerd in een bestand in Standard Tessellation Language (STL)-formaat, (B) het instrueren van het 2-foton 3D-printen door middel van lasergeïnduceerde polymerisatie in een druppel hars (IP-S). (C) De resulterende structuur wordt gebruikt als mal voor herhaalde fabricage van PDMS-replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van in-house rapid prototyping van een polymeer (neuronaal) celkweek PDMS-apparaat. (A) In minder dan 24 uur maakt additive manufacturing op microschaal het mogelijk om van een CAD-model naar een 3D-geprinte master te gaan, die onmiddellijk en herhaaldelijk kan worden gebruikt als een replica-mal met biocompatibele elastomeren, zoals PDMS. (B-C) De resulterende PDMS-apparaten zijn gekoppeld aan een neuronaal celkweek vlak substraat, hier vertegenwoordigd door een reeks micro-elektroden. Voor het specifieke monsterontwerp in (A) worden twee kamers gedefinieerd: de ene wordt aangeduid als Bron en wordt aangeduid met S, en de andere wordt aangeduid als Target en wordt aangegeven met T. (D) Neuronen die in elke kamer zijn geplateerd, kunnen hun neurieten alleen laten groeien via een reeks microkanalen. Wanneer ze op de juiste manier worden uitgelijnd onder stereomicroscopiebegeleiding in (C), worden twee sets substraatgeïntegreerde micro-elektroden blootgelegd, zodat de bio-elektrische activiteit van nabijgelegen neuronen die zich in beide compartimenten bevinden, kan worden gestimuleerd en geregistreerd. Merk hier op dat het uitlijnen van micro-elektroden binnen individuele microkanalen niet de prioriteit was van dit proof-of-principle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Live beeldvorming van cel-ondoordringbare fluorescerende reportermoleculen, identificeert neurieten die zijn uitgerekt door neuronen, enkele dagen na het uitplaten van de cel. (A-D) Representatieve confocale fluorescentiemicrofoto's van modulaire neuronale culturen van het apparaat, vervaardigd uit figuur 1 en figuur 2 (N = 4.128 individuele microkanalen), zijn 2 en 6 dagen na het plateren van de cellen verkregen. (B-D) De 40x vergroting en een omgekeerde grijsschaal van de microfoto's voor een betere zichtbaarheid. De uiteinden van de microkanalen van het Bron- en het Doelcompartiment worden respectievelijk aangeduid met S en T. (A) toont het breedscanbeeld van de cultuur, waarbij Source (d.w.z. het binnenste vierkante gebied) en Target (d.w.z. het buitenste gebied) vol cellen zitten, 6 dagen na het plateren. (B) en (C) tonen, op het eerdere tijdstip van 2 dagen na het uitplaten, de groei van neurieten aan respectievelijk de bron- en de doelzijde van de microkanalen. De kleine zwarte driehoeken duiden op representatieve voorbeelden van vermeende axonenbundelterminals, die blijkbaar alleen afkomstig zijn van de Bron. De grenzen van de pijlvormige microkanalen wijzen naar de verlenging van neurieten langs de rand (B), waar hun doorgang ononderbroken is en naar het doel wordt geleid. In de tegenovergestelde richting, en naast het doeleinde van een microkanaal (C), worden neurieten die afkomstig zijn van het doelwit en oprukken naar de bronzijde gevangen in de scherpe hoeken. (D) onthult verder de details van neurietuitgroei in een microkanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Functionele karakterisering van neuronale elektrische responsen, met en zonder het PDMS-apparaat. MEA's werden gebruikt als celkweeksubstraten en gebruikt om de netwerkbrede spiking-reacties te meten die werden opgeroepen door een zeer korte (d.w.z. 200 μs, 0,8 V) bifasische elektrische stimulatiepuls, afgeleverd in een bipolaire configuratie. Met het PDMS-apparaat van figuur 2 verschillen de neuronale spiking-reacties die zijn geregistreerd van de bron (rood) en van het doel (blauw), afhankelijk van waar de stimulus wordt afgeleverd. Vermeende axonale, synaptische en integratievertragingen worden duidelijk in (A) maar niet in (B), wat suggereert dat er een voorkeurssynaptische connectiviteit (d.w.z. van bron naar doel) bestaat. (C-D) Onder controleomstandigheden (d.w.z. zonder PDMS-apparaat) zijn opgewekte reacties die worden gedetecteerd op twee verschillende sets MEA-micro-elektroden niet afhankelijk van de locatie van de stimulusafgifte. De lichtgetinte arcering, die de lijnen in de grafieken omhult, geeft de momentane standaardfout van het gemiddelde aan (N stimuli = 150). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van de oplossing | Compositie | ||
| polyethyleenimine (PEI) 0,1% | 1 ml PEI-bouillonoplossing, 9 ml steriel gedeïoniseerd (DI) water. | ||
| Kweekmedium (50 ml) | Minimum Essential Medium (MEM), aangevuld met 20 μM Glucose, 50 μg/ml Gentamicine, 50 μM L-glutamine en 10% Heat-Inactivated Horse Serum. | ||
| Dissectie medium (1000 ml) | Hanks′ Gebalanceerde zouten 9,52 g, natriumbicarbonaat 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-glucose 6 g, kynuurenzuur (eindconcentratie 200 μM), D-AP5 (eindconcentratie 25 μM), gentamica 250 μl, runderserumalbumine 300 mg, magnesiumsulfaat 1,44 g. Stel de pH in op 7,3, bescherm tegen licht en bewaar bij 4°C. | ||
| Digestiemedium (100 ml) | Natriumchloride 800 mg, Kaliumchloride 37 mg, di-natriumwaterstoffosfaat 99 mg, HEPES 600 mg, natriumbicarbonaat 35 mg, kynuurenzuur, 200 μL (uit 100 mM voorraad), D-AP5 100 μL (uit voorraad 25 mM). Stel de pH in op 7,4, bescherm tegen licht en bewaar bij 4 °C. | ||
| Oplossing 1 | Trypsine 5 mg, Deoxyribonuclease I 1,5 mg, in 2 ml Digestiemedium. | ||
| Oplossing 2 | Trypsineremmer 5 mg, in 5 ml dissectiemedium. | ||
| Oplossing 3 | Deoxyribonuclease I 1,5 g, in 2,5 ml dissectiemedium. | ||
Tabel 1: Tabel met oplossingen. Raadpleeg de materiaaltabel voor productbeschrijvingen.
Aanvullend coderingsbestand 1: Het STL-ontwerpbestand komt overeen met de structuur die is afgebeeld in figuur 2A. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Ondanks dat het al tientallen jaren oud is, is de toepassing van 2PP-technologie in PDMS-gebaseerd replicagieten op micrometerschaal een recente ontwikkeling43,44. In dit verband worden hieronder een aantal punten besproken om gebruikers te helpen bij het effectief reproduceren van dit werk.
Zorg er bij het ontwerpen van 3D-modellen voor dat het model geen gaten of zelfsnijpunten heeft. Geef de voorkeur aan de binaire bestandsindeling bij het opslaan als STL, vanwege de kleinere bestandsgrootte dan ASCII-gecodeerd. Dit is vooral gunstig voor ontwerpen met ingewikkelde geometrieën en voor milliliter-brede objecten. Het gebruik van binaire STL-bestanden impliceert ook een lage CPU-belasting, later in het proces om het mechanische onderdeel voor te bereiden op 3D-printen. De fysieke afmetingen van de objecten in het STL-bestand worden weergegeven in dimensieloze eenheden. Tijdens de nabewerking van het STL-bestand worden eenheden geïnterpreteerd als micrometers. Daarom wordt aanbevolen om bij het voorbereiden van het bestand vooraf de eenheid van belang, d.w.z. micrometer, te gebruiken. De nauwkeurigheid van het gedrukte model wordt bepaald door het aantal oppervlakken dat de vlakvullingsdriehoeken benadert. Bij een onvoldoende aantal oppervlakken zal er een ongewenste oppervlakteruwheid ontstaan. Het streven naar een te hoge nauwkeurigheid op een zeer groot aantal oppervlakken gaat echter ten koste van een hoge rekenbelasting, waardoor de bestandsverwerking traag verloopt.
Voor 3D-printen wordt tijdens het printen het fysieke 3D-object gevormd met behulp van snelle galvo-scanning in het x-y-vlak en piëzo-beweging in de z-richting. Dit focust de femtoseconde laserstraal binnen een bepaalde 3D-voxel. Wanneer printstructuren echter groter zijn dan de ruimtelijke dekkingsbereiken van de galvo en piëzo, moet het object programmatisch worden opgesplitst in blokken. Hoewel dit een vereiste is voor geprinte onderdelen van millimeterformaat, worden knooppunten tussen blokken geassocieerd met (onvolmaakte) stiklijnen. Zorgvuldige optimalisatie van het aantal blokken en plaatsing van stiklijnen in x-, y- en z-richtingen zijn cruciaal om te voorkomen dat kritieke geometrische kenmerken van het uiteindelijke object worden verstoord met stiklijnen. Er kunnen zich om verschillende redenen luchtbellen vormen op de afdrukinterface (bijv. substraten die onzuiverheden en inhomogeniteiten fotoresist zijn) en een negatieve invloed hebben op de kwaliteit en integriteit van de afgedrukte structuur. Bovendien kan een hoger laservermogen leiden tot een toename van het voorkomen ervan. Door het laservermogen te verminderen, op de onderste laag van het geprinte onderdeel, wordt de kans op luchtbelvorming geminimaliseerd. Als alternatief voor het printen van het hele onderdeel als een vaste structuur, kan de schaal- en steigermethode worden overwogen. Het gaat om het printen van alleen het buitenoppervlak van het onderdeel (schaal) en driehoekige prisma-elementen erin. Deze elementen worden gescheiden door horizontale lagen (steigers), die de niet-gepolymeriseerde hars in kleine zakken houden. Deze methode verkort de printtijd aanzienlijk, wat vooral relevant is voor millimetergrote constructies. Aangezien er echter niet-gepolymeriseerde hars achterblijft, is UV-blootstelling na het printen absoluut noodzakelijk om volledige mechanische stabiliteit te garanderen, hoewel deze stap voorzichtig moet worden uitgevoerd om vervorming van het geprinte onderdeel te voorkomen. De nahardingstijd is afhankelijk van de hars naar keuze, de dikte van het onderdeel en de UV-sterkte40. Voor optimale resultaten wordt aanbevolen om een eerste proef uit te voeren om de tijd te schatten die nodig is voor volledige uitharding, met behulp van een druppel fotoresist en het evalueren van de doorsnede, na blootstelling aan UV-straling. De gebruikelijke uithardingsperiode varieert van 5 tot 20 minuten.
Voor PDMS-replicagieten kan het een uitdaging zijn om een PDMS-apparaat schoon te fabriceren met functies op micrometerschaal, zonder cleanroom-faciliteiten: microdeeltjes in de lucht kunnen zich op het sterk klevende oppervlak van het PDMS bevinden en de afdichting tussen het apparaat en het substraat belemmeren, of het gedeelte van afzonderlijke microkanalen blokkeren. Door de protocolstappen uit te voeren onder een laminaire stromingskap en het PDMS-oppervlak consequent af te schermen met isopropanol, worden de besmettingsrisico's aanzienlijk geminimaliseerd. De uithardingstemperatuur en de duur ervan hebben een directe invloed op de PDMS-vernetting en de daaruit voortvloeiende fysische eigenschappen. Met name de kleefkracht van uitgehard PDMS is een kritische factor. Aan de ene kant is een goede afdichting vereist tussen het PDMS-apparaat en het oppervlak dat wordt gebruikt voor het kweken van neuronale cellen (bijv. een glazen dekglaasje of een MEA), om de doorgang van de neurieten effectief te beperken. Aan de andere kant moet het PDMS-apparaat omkeerbaar aan het oppervlak worden bevestigd, zodat de delicate isolatielaag MEA's niet wordt beschadigd na het verwijderen van het apparaat. Hoewel PDMS-krimp tijdens het uitharden optreedt en kan worden gecorrigeerd door de mal vooraf opnieuw te schalen, zal de hier aangegeven temperaturen en uithardingsintervallen minder dan 2%42 zijn en geen significante invloed hebben op enkellaagse PDMS-apparaten. Volg in het algemeen nauwkeurig de aanbevolen uithardingstemperatuur en duurwaarden, voor de beste resultaten.
Overzicht van de voordelen en beperkingen van de methode
Een techniek gebaseerd op 2-foton direct laserschrijven wordt voorgesteld voor de snelle fabricage van polymere apparaten op microschaal voor de experimentele studie van modulaire neurale netwerken. In tegenstelling tot zachte fotolithografie vereist de voorgestelde aanpak geen hoog niveau van technische expertise, op voorwaarde dat een functionele 2PP 3D-printopstelling toegankelijk en operationeel is. Opmerkelijk is dat de methode het mogelijk maakt om binnen één dag van een CAD-ontworpen 3D-model naar een functioneel PDMS-apparaat te gaan, waardoor een direct en efficiënt pad van concept naar tastbare realisatie wordt geboden. Met name door te kiezen voor de schaal-en-steiger-printmodus wordt de tijd die nodig is om de mal te maken aanzienlijk verkort, aangezien slechts een fractie van het volume wordt geprint. De daaropvolgende UV-uitharding van het geprinte onderdeel garandeert de mechanische stabiliteit en robuustheid, zoals hier geverifieerd gedurende 50 gietcycli met PDMS.
In vergelijking met traditionele methoden heeft 2PP 3D-printen een duidelijk voordeel, dat het meest uitgesproken is als het gaat om de fabricage van matrijzen met een aanzienlijke beeldverhouding, veeleisende resolutie-eisen en complexe driedimensionale geometrieën. De productie van mastermatrijzen met behulp van standaard UV-lithografie wordt beperkt door een resist-dikte van ongeveer 200 μm. Ingewikkelde sequenties van spin-coating- en belichtingscycli35, dure LIGA-processen (Lithografie, galvaniseren en gieten) of diep reactief ionenetsen (DRIE)36 zijn vereist om grotere hoogte- en beeldverhoudingen te bereiken. In schril contrast, zoals aangetoond in het baanbrekende werk van Kumi et al. in 201037, biedt de 2PP-techniek een in wezen onbeperkte reikwijdte voor de beeldverhouding van de geprinte onderdelen, variërend van submicrometer tot millimeters. Hier is het microfabricageproces van een matrijs met een aanzienlijk hoogteverschil van de delen geïllustreerd, met een meer dan 100-voudig onderscheid tussen de hoogte van de microkanalen (5 μm en de maximale hoogte van de matrijs (545 μm; zie figuur 2).
Ook kan een resolutie van een submicrometer gemakkelijk worden bereikt door de geschetste protocolspecificaties te volgen. Ter vergelijking: het bereiken van verbeterde matrijsresoluties door middel van UV-fotolithografie vereist kapitaalinvesteringen. De maskers met de fijnste resolutie, die gebruik maken van chroomafzetting op kwarts met een nominale resolutie van 600 nm, zijn enkele ordes van grootte hoger geprijsd dan de lasergeprinte overheadtransparantiemaskers, die een resolutie van 250 μm35 hebben, zie echter het werk van Pirlo et al.41. Om levensvatbaar te zijn voor intern gebruik, moet een gekozen methode kosteneffectief zijn. Voor veel biologische laboratoria vormen de totale kosten die gepaard gaan met conventionele zachte fotolithografie of direct laserschrijven een barrière. Hoewel het haalbaar is om beide technologieën toegankelijker te maken door de essentiële componenten aan te schaffen en te assembleren, vereist deze aanpak extra expertise en vereist het nog steeds een aanzienlijke investering. In deze context is een essentieel punt om rekening mee te houden het bredere spectrum van toepassingen dat kan worden bereikt door middel van direct laserschrijven. In tegenstelling tot conventionele zachte fotolithografie, die voornamelijk beperkt is tot microfabricage van matrijzen, vertoont 2PP 3D-printen een opmerkelijke veelzijdigheid. De mogelijke toepassingen strekken zich uit van microfluïdica en micro-optica tot geïntegreerde fotonica en micromechanica. Dit maakt investeren in deze technologie aantrekkelijk als een gedeelde faciliteit voor meerdere en diverse wetenschapsgebieden. De op 2PP gebaseerde methodologie die in dit protocol is bedacht, is bijvoorbeeld het resultaat van een interdisciplinaire samenwerking tussen neurowetenschappelijke en wiskundige afdelingen binnen onze instelling. Bovendien is de ontwikkeling van fotoresist een actief onderzoeksgebied en kan het mogelijk het toepassingsgebied van 2PP 3D-printen uitbreiden. Een voorbeeld hiervan is de recente introductie van IP-PDMS-hars. Door te polymeriseren tot structuren met eigenschappen zoals PDMS38, ontsluit deze hars het potentieel voor directe microfabricage van biocompatibele componenten met een ingewikkeld oppervlak of holle ruimtes. Deze fijne kneepjes vormen een barrière voor het bereiken van vergelijkbare resultaten door middel van conventionele replica-gietprocedures.
Als demonstratie van deze methode werd bewijs geleverd dat de ontwikkeling van unidirectionele connectiviteit tussen twee modules in een modulair neuronaal netwerk suggereerde. De mal op microschaal, vervaardigd door middel van 2PP-techniek, had voldoende uithoudingsvermogen om meerdere PDMS-gietstukken te ondergaan en heeft de vereiste precisie op microschaal. Concluderend kan worden gesteld dat het toepassingsgebied van het protocol dat in dit werk wordt beschreven, verder reikt dan het geïllustreerde geval. Naarmate de toegang tot de 2PP-printtechnologie steeds wijder verbreid wordt, zal de initiële investering die nodig is voor de implementatie ervan afnemen, terwijl het scala aan potentiële toepassingen zal toenemen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
M.G. erkent financiële steun van het H2020-kaderprogramma van de Europese Unie via de Europese Innovatieraad (IN-FET-project, GA n. 862882, Arbor-IO-project, FLAG-ERA en het Human Brain Project, ID 650003) en van SISSA (Neuroscience Area). GN erkent financiële steun van het Italiaanse Ministerie van Universiteit en Onderzoek (MUR) via de subsidie Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Mathematics Area). We danken M. Gigante, B. Pastore en M. Grandolfo voor hun hulp bij 3D-printen, celkweek en live-imaging, evenals Drs. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente en H.C. Schultheiss voor discussies. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). -------------------------------------- Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
References
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J.
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
- Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
