Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تقييم سمية المواد الكيميائية باستخدام نظام فحص الاستجابة المفاجئة لاهتزاز الزرد

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66153
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 4, 5, 1, 1, 6, 1
1Institute of Biological and Chemical Systems - Biological Information Processing, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 2DITABIS AG - Digital Biomedical Imaging Systems AG, 3Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 4School of Biosciences, University of Birmingham, 5Institute for Automation and Applied Informatics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 6Department of Bioanalytical Ecotoxicology, Helmholtz-Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

نحن نصف سير عمل نظام الفحص وتحليل البيانات لتقييم سمية المركبات الكيميائية بناء على استجابة اهتزاز جنين الزرد. يسجل النظام تحركات أجنة الزرد عند التعرض لمحفز اهتزازي ويسمح بإجراء تقييم متكامل للسمية العامة / الفتك والسمية العصبية العضلية.

Abstract

قمنا بتطوير نظام فحص بسيط لتقييم السمية العصبية العضلية والعامة في أجنة الزرد. يتكون النظام المعياري من محولات الطاقة الكهروديناميكية التي يمكن وضع أطباق زراعة الأنسجة مع الأجنة فوقها. يمكن الجمع بين العديد من أزواج أطباق زراعة مناديل مكبرات الصوت. تحفز المحفزات الاهتزازية الناتجة عن محولات الطاقة الكهروديناميكية استجابة مميزة للذهول والهروب في الأجنة. يقوم محرك خطي يحركه الحزام بوضع كاميرا بالتتابع فوق كل مكبر صوت لتسجيل حركة الأجنة. وبهذه الطريقة ، يمكن تصور وقياس التغيرات في الاستجابة المفاجئة بسبب الفتك أو السمية العصبية العضلية للمركبات الكيميائية. نقدم مثالا على سير العمل لفحص المركبات الكيميائية باستخدام هذا النظام ، بما في ذلك إعداد الأجنة وحلول العلاج ، وتشغيل نظام التسجيل ، وتحليل البيانات لحساب قيم التركيز المعيارية للمركبات النشطة في الفحص. إن التجميع المعياري القائم على المكونات البسيطة المتاحة تجاريا يجعل هذا النظام اقتصاديا وقابلا للتكيف بمرونة مع احتياجات إعدادات المختبر وأغراض الفحص الخاصة.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، أصبحت أسماك الزرد كائنات نموذجية شائعة للغاية لتقييم تأثيرات المركبات الكيميائية ، بما في ذلك مجالات البحث من تطوير الأدوية إلى علم السموم البيئي1. كفقاريات ، تشترك أسماك الزرد في العديد من جوانب تركيبها الجيني وعلم وظائف الأعضاء العام مع البشر 2,3. لذلك ، غالبا ما تكون النتائج التي تم الحصول عليها في هذا النموذج ذات صلة مباشرة بصحة الإنسان. تم تحديد العديد من الأدوية المرشحة حاليا في التجارب السريرية في شاشات مركبة باستخدام الزرد4.

تقييم السمية هو أحد التطبيقات الرئيسية حيث تكون الاختبارات التي تستخدم المراحل الجنينية لسمك الزرد ذات أهمية. توجد إرشادات اختبار مختلفة لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (OECD) لاستخدام الزرد في اختبار السمية البيئية 5,6. إن صغر حجم أجنة الزرد وتطورها السريع يجعلها مناسبة للغاية لنهج الفحص على مقياس إنتاجية متوسط إلى مرتفع1،3،4. تشمل نقاط النهاية السمية التي تستهدفها هذه الشاشات التشوهات الجنينية والفتك7 ، واضطراب الغدد الصماء8 ، وسمية الأعضاء9 ، والتقييمات السلوكية التي تشير إلى السمية العصبية10،11. المقايسات السلوكية ممكنة لأن أجنة الزرد تظهر أنواعا مختلفة من الاستجابات الحركية للمنبهات المختلفة اعتمادا على مرحلة تطورها. على سبيل المثال ، تظهر أجنة ما بعد الإخصاب (dpf) بعد يوم واحد لف الذيل التلقائي12 وتستجيب لسلسلة من نبضات الضوء مع تسلسل نموذجي للحركات ، ما يسمى بالاستجابة الحركية الضوئية (PMR)10. بعد الفقس ، الذي يحدث عادة بعد حوالي 48-72 ساعة من الإخصاب (hpf) ، تتطور الأجنة الإليوثيروجينية التي تسبح بحرية13 تدريجيا استجابات مفاجئة وهروب للمنبهات الاهتزازية بدءا من حوالي 4 dpf14. تتميز هذه الاستجابات بانحناء مميز للاتجاه المعاكس لاتجاه التحفيز (ما يسمى بالانحناء C أو C-start) ، والذي يتبعه انحناء مضاد أصغر وسلوك سباحة14،15،16،17. والجدير بالذكر أن السلوكيات الجنينية تحكمها الدوائر العصبية التي تستخدم أنظمة الناقلات العصبية المختلفة ، مما يسمح بالتحقيق في تأثيرات المركبات الكيميائية التي تستهدف هذه الأنظمة. على سبيل المثال ، كشف اختبار PMR عن آثار المركبات التي تتداخل مع الإشارات الكولينية والأدرينالية والدوبامين10 ، في حين أن الاستجابة المفاجئة تتضمن الخلايا العصبية الكولينية والجلوتاماترجية والجلوسينية16,18. علاوة على ذلك ، فإن المركبات التي تلحق الضرر بالعضلات أو الواجهة العصبية العضلية ستؤثر أيضا على هذه السلوكيات ، وكذلك المركبات السامة لخلايا شعر الأذن الداخلية / الخط الجانبي19,20. وبالتالي ، فإن مراقبة السلوك الحركي لسمك الزرد استجابة للتحفيز هو وسيلة مناسبة لتقييم ليس فقط السمية العصبية ولكن على حد سواء السمية الأذنية والسمية العضلية. يعمل تسجيل السلوك الحركي أيضا كبديل لتقييم السمية / الفتك العام لأن الأجنة الميتة لا تتحرك. وبالتالي ، تمثل سلوكيات الحركة الجنينية قراءة تكاملية لنهج فحص السمية من الدرجة الأولى ، والذي يشير إلى التأثيرات المركبة القاتلة والعصبية العضلية في إعداد واحد. بالنظر إلى أن eleutheroembryos قادرة بالفعل على استقلاب المركبات ، قد يكتشف النهج أيضا آثار منتجات التحول الأيضي7،21،22. الأهم من ذلك ، لا تعتبر أجنة الزرد مرحلة حياة محمية بموجب بعض تشريعات حماية حتى مرحلة التغذية المجانية بعد 120 hpf13. لذلك ، فهي تعتبر بديلا لاختبار السمية الحيوانية.

Figure 1
الشكل 1: إعداد نظام استجابة الاهتزاز المفاجئ. (أ) نظرة عامة على النظام. يتم وضع الألواح ذات الأجنة المعرضة لمركبات الاختبار على مجموعة محول الطاقة الكهروديناميكي ("مكبرات الصوت"). يتم تحريك الكاميرا بالتتابع بواسطة محرك خطي يحركه الحزام إلى موضع التسجيل فوق محول الطاقة المستهدف. (B) عرض مفصل لمحول الطاقة / مكبر الصوت مع إدخال طبق زراعة الأنسجة في الأعلى. تضيء الألواح من الأسفل بواسطة ورقة إضاءة LED عند 4000-5000 لوكس. يضيء ضوء LED بجوار السماعة أثناء إعطاء التحفيز. (ج) صورة ثابتة لفيديو سجلته الكاميرا عند تحفيز الأجنة. (D) لقطة شاشة لملف التكوين. (ه) لقطة شاشة لواجهة برنامج التسجيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا ، نصف بروتوكول اختبار لتقييم التأثيرات المركبة على استجابة اهتزاز الاهتزاز باستخدام جهاز اختبار بسيط داخلي يعتمد على محفزات الاهتزاز الناتجة عن محولات الطاقة الكهروديناميكية إلى جانب تسجيل فيديو آلي للعديد من الأجنة التي تتحرك بحرية في طبق زراعة الأنسجة23. النظام معياري ويسمح بالتسجيل المتسلسل من عدة أطباق زراعة الأنسجة بالتوازي. في الإعداد المستخدم حاليا ، توفر خمسة محولات طاقة كهروديناميكية حافزا اهتزازيا (500 هرتز ، المدة 1 مللي ثانية) لأطباق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 20 جنينا موضوعة فوقها (الشكل 1). تضيء الألواح من الأسفل عند 4000-5000 لوكس مع صفائح إضاءة LED. يشير ضوء LED بجوار كل محول طاقة إلى فترات تطبيق التحفيز ، ويشير راسم الذبذبات إلى الأشكال الموجية وتردد التحفيز المطبق (لمزيد من التفاصيل ، انظر المرجع 23). يتم تسجيل سلوك الأجنة بواسطة كاميرا عالية السرعة (جدول المواد) بمعدل 1000 إطار في الثانية (fps) ، والتي يتم تحريكها فوق السماعة المستهدفة بواسطة محرك خطي يحركه الحزام. سرعة التسجيل هذه مطلوبة لحل الاستجابة المذهلة بشكل موثوق. يوفر النظام بديلا منخفض التكلفة وقابل للتكيف بشكل فردي مع الأنظمة التجارية الحالية. يتم حاليا تنفيذ سير العمل الدقيق المفصل أدناه في إطار مبادرة علم السموم الدقيق24 من أجل تحديد ظروف التعرض المناسبة للحصول على بيانات OMICS من أجنة الزرد المعالجة بمجموعة مختارة من المواد السامة.

Protocol

تم إجراء جميع عمليات تربية الزرد ومناولتها وفقا لمعايير حماية الألمانية ووافقت عليها حكومة بادن فورتمبيرغ ، Regierungspräsidium Karlsruhe ، ألمانيا (Aktenzeichen 35-9185.64 / BH KIT).

1. إعداد محاليل مخزون المواد الكيميائية ليتم اختبارها

  1. قم بتسمية القارورة الزجاجية (أو القسمة الكيميائية) باسم / اختصار المركب وتركيز المخزون وتاريخ التحضير. على سبيل المثال، CdCl2_2.5 g· L-1_210813.
  2. أجهزة الطرد المركزي الحصة الكيميائية عند 2000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. تحت غطاء الدخان ، قم بوزن المركب (إذا لزم الأمر) على مقياس حساس ل 0.001 جم وانقله إلى القارورة الملصقة. إذا كان المركب سائلا ، فقم بإضافته إلى القارورة باستخدام ماصة وطرف ماصة بلاستيكية.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة لمخزون الميثان سلفونات التريكائين المستخدم في مثال النتيجة الموضح في الشكل 2 ، تم وزن 400 مجم في القارورة الموسومة.
  4. أضف مذيب (على سبيل المثال ، الماء النقي المعقم أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، اعتمادا على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمركبات) باستخدام ماصة وطرف ماصة بلاستيكية. إذا كان ذلك ممكنا ، فإن الماء هو المذيب المفضل.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة لمخزون التريكائين ، تم تحضير محلول 15.3 mM في 100 مل من الماء.
  5. أغلق القارورة ، رجها برفق ، وتحقق من هطول الأمطار.
  6. قم بإعداد محاليل المخزون المخففة (إذا لزم الأمر) في قوارير زجاجية باستخدام الماصات ونصائح الماصة البلاستيكية.
    ملاحظة: على سبيل المثال، لم يكن من الضروري إجراء مزيد من التخفيف لمخزون التريكائين.
  7. قم بتخزين محلول (محلول) المخزون في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  8. تخزين القسمة الكيميائية المتبقية في نفس الظروف كما كان من قبل.
  9. سجل معلومات حصص الأسهم في دفتر ملاحظات المختبر.

2. جمع وتربية أجنة الزرد

  1. جمع الأجنة في مراحل الانقسام (مرحلة 2-8 خلية) من التفريخ الطبيعي للتزاوج الجماعي في أطباق زراعة الأنسجة 10 سم.
  2. اختر مجموعة من الجودة المناسبة: أقل من 10٪ بيض غير مخصب / ميت.
  3. قم بتنظيف الأطباق (إزالة البيض غير المخصب ، والحطام ، والمقاييس ، وما إلى ذلك).
  4. ضع 60 جنينا لكل طبق زراعة أنسجة 10 سم في 15 مل من وسط E3 (5 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 0.17 مللي مول KCl ، 0.33 مللي مول CaCl2 ، 0.33 مللي مول MgSO4) 25.
  5. ضع الأطباق في غرفة مرطبة محضرة عن طريق وضع مناشف ورقية مبللة بالماء.
  6. رفع الأجنة حتى 72 hpf في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية.

3. إعداد تخفيف العمل من المواد الكيميائية ليتم اختبارها

  1. أخرج محلول المرق من الفريزر -20 درجة مئوية واتركه يذوب.
  2. إذا كانت قابلية الذوبان المركبة عالية بما فيه الكفاية ، فقم بإعداد التخفيفات التسلسلية في وسط E3 في زجاجات زجاجية ، 1 مل لكل مكرر لكل تركيز. تأكد من أن التركيز أعلى 10 مرات من تركيز التعرض المطلوب. هذا يتجنب الاضطرار إلى تغيير وسط الأجنة بالكامل في بداية التعرض. في حالة انخفاض الذوبان، تحضير التخفيفات التسلسلية مباشرة عند تركيزات التعرض المطلوبة، 10 مل لكل مكرر لكل تركيز.
  3. تحقق من هطول الأمطار (إذا لزم الأمر). إذا ترسب المحلول ، فقم بتسجيل ذلك ، ثم قم بتخفيفه لتحقيق أعلى تركيز تالي. تحقق مرة أخرى من هطول الأمطار. كرر حتى لا يكون هناك هطول الأمطار.
  4. تحقق من الرقم الهيدروجيني لمحلول التعرض. إذا كان خارج نطاق الأس الهيدروجيني 7.0-8.5 ، فقم بتسجيل ذلك ، وقم بإعداد المحاليل في E3 التي تحتوي على 5 mM HEPES / pH 7.4 ، مع ضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام HCl أو NaOH.
  5. تخلص من وسائط التعرض غير المستخدمة وفقا للوائح المحلية.

4. تعريض الأجنة للمواد الكيميائية المراد اختبارها

  1. افحص الأطباق التي تحتوي على أجنة قديمة 72 حصانا بحثا عن أجنة ميتة / غير مفقسة وقم بإزالتها. إذا كانت مجموعة من الأجنة تحتوي على أكثر من 5٪ من البيض غير المفقس ، فقم بإزالة الدفعة.
  2. ضع 10 أجنة لكل طبق زراعة أنسجة 6 سم في 9 مل من وسط E3 (لوحة التعرض).
  3. قم بتسمية لوحات التعرض بالاسم المركب وتركيز التعريض ورقم النسخ المتماثل. على سبيل المثال ، "CdCl2 1 mg· L-1 01". قم بتضمين لوحات E3 كافية فقط ولوحة تحكم في المذيبات ، إذا لزم الأمر (انظر القسم 5).
  4. أضف 1 مل من محلول التعرض لكل لوحة ، بدءا من أقل تركيز ، وقم بتدوير اللوحة. بالنسبة للمركبات ذات القابلية المنخفضة للذوبان ، استبدل 10 مل بالكامل من اللوحة بمحلول التعرض (انظر الخطوة 3.2.)
  5. سجل الترتيب الزمني الذي أضيفت به المحاليل المركبة إلى الأجنة.
  6. احتضان الألواح في الغرفة المرطب في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية لمدة 48 ساعة حتى تصل إلى 120 hpf.

5. إجراء مقايسة ذهول الاهتزاز

ملاحظة: قم بتحليل اللوحات بنفس الترتيب المسجل في الخطوة 4.5. يجب أن يتضمن كل تشغيل لوحة تحكم E3.

  1. قم بتشغيل الكمبيوتر وجهاز الاهتزاز (يجب أن يكون ضوء LED الأزرق مضاء).
  2. قم بإعداد ملف التكوين في جدول بيانات ، كما هو موضح في الشكل 1D ومرفق كملف تكميلي 1. سجل معلومات التعرض لكل من مواضع اللوحة ال 5 (مركب ، تركيز ، تكرار).
  3. افتح برنامج واجهة المستخدم العامة (GUI) (متوفر في https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit ، معرف المشروع 43215.)
  4. تحقق من حركة الكاميرا عن طريق تحديد المواضع المختلفة في برنامج واجهة المستخدم الرسومية ومراقبة حركة الكاميرا.
  5. أخرج لوحات العينة المراد قياسها من الحاضنة. ضع لوحات العينة على 5 مواضع (انظر الشكل 1 أ ، "مكبرات الصوت") واترك الأجنة تستقر لعدة دقائق.
  6. انقر فوق تسجيل ؛ سيتم فتح نافذة لتحديد ملف التكوين.
  7. حدد ملف التكوين المناسب الذي تم إعداده في الخطوة 5.2 لهذا التشغيل.
  8. تأكد من أن وصف العينة يتوافق مع العينات الموجودة في كل موضع (1-5).
  9. سيتم إجراء القياس تلقائيا (10 ثوان / موضع). عندما يتم تطبيق نبض الصوت بواسطة البرنامج ، يتم تشغيل مؤشر LED. يسمح التسجيل لمدة 10 ثوان / موضع بالحصول على بيانات كافية لتقدير سرعة السباحة والمسافة المقطوعة قبل وبعد تطبيق التحفيز ويمنع التعود على المحفزات اللاحقة.
  10. عند اكتمال التسجيل ، تعود الكاميرا إلى الموضع 1 ويبدأ البرنامج في ضغط الملفات. خلال هذا الوقت ، استبدل العينات بالمجموعة التالية التي يجب قياسها.
  11. انتقل إلى الخطوة 5.2. لتسجيل الجولة التالية.
  12. عندما يتم قياس جميع اللوحات ، اجمع حلول التعرض. استخدم غربالا للاحتفاظ بالأجنة.
  13. القتل الرحيم للأجنة عن طريق البرد السريع في حمام الثلج / الأيزوبروبانول (5٪).
  14. التخلص من محاليل التعرض والأجنة الميتة وفقا للوائح المحلية.

6. تحليل البيانات

  1. افتح بيانات الفيديو باستخدام VirtualDub (1.10.4).
  2. سجل بصريا عدد الأجنة التي تستجيب لنبض الصوت (عندما يكون مؤشر LED للتحكم قيد التشغيل).
  3. أدخل البيانات في جدول بيانات. سجل اسم المركب، والمكرر، وتركيز المركب، والنسبة المئوية للأجنة غير المتحركة وفقا للنموذج الوارد في الملف التكميلي 2، والذي يتضمن مثال مجموعة البيانات الموضحة في الشكل 2C.
    ملاحظة: يتميز النموذج بهيكل مرن ويسمح أساسا بتطبيق بيانات الكائنات الحية ونقاط النهاية الأخرى. يصف الاستجابات لكل تركيز ويوفر أيضا أوصافا لنقطة النهاية بالإضافة إلى تعريفات للمعلمات التي تم إنشاؤها في نمذجة التركيز والاستجابة اللاحقة.
  4. قم بإجراء تحليل التركيز المعياري (BMC) باستخدام سير عمل KNIME (تحليلات KNIME 4.626) مع نصوص R المضمنة (R الإصدار 3.6 ، R-packages plotrix ، drc و bmd 27,28).
    ملاحظة: من حيث المبدأ، يمكن أيضا إجراء التقييم مباشرة في R. ومع ذلك ، من أجل الراحة وللسماح بالتقييم كخدمة قائمة على الويب ، تم تنظيم التحليل في سير عمل متوافق مع خادم KNIME. يتم توفير إخراج سير عمل KNIME في الملف التكميلي 3. للحصول على تفاصيل حول المعلمات الإحصائية التي تم إنشاؤها بواسطة سير عمل KNIME، راجع هذا القالب. يوضح الجدول 1 المعلمات الإحصائية لتقدير جودة الملاءمة والعتبات لقبول قيم BMC المحددة. يتوفر سير عمل KNIME نفسه عبر GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). تم نمذجة استجابة التركيز باستخدام نموذج لوجستي لوجستي لوجستي مكون من 4 معلمات. يمكن إصلاح اثنين من معلمات تركيب المنحنى. عادة ، يمكن للمرء إصلاح الحد الأقصى إلى 100 في حالة بيانات النسبة المئوية. في حالة عدم ملاحظة أي تأثيرات خلفية ، يمكن تثبيت الحد الأدنى على 0٪.

Representative Results

يوضح الشكل 2 أ النسبة المئوية للأجنة غير المتحركة في 48 براثن من الأجنة البرية غير المعالجة (سلالة AB2O2). في المتوسط ، لا يتفاعل 14.33٪ من الأجنة البرية غير المعالجة مع محفز الاهتزاز. في 4 براثن ، وصلت نسبة اليرقات غير المتحركة إلى 50 ٪ ، ولكن 75 ٪ من القوابض كانت نسبة اليرقات غير المتحركة أقل من 20 ٪.

يوضح الشكل 2B ، C مثالا على حساب نموذجي لتركيز / جرعة معيارية (BMC / BMD29,30) للتأثيرات المركبة على الحركة مع سير عمل فحص أذرع الاهتزاز ، كما يتم إجراؤه حاليا داخل اتحاد PrecisionTox24. تتوافق قيم BMC10 و BMC25 و BMC50 مع التركيزات التي تظهر فيها 10٪ و 25٪ و 50٪ من الأجنة مستويات حركة أعلى من الخلفية ، على التوالي. يتم تضمين الأجنة غير المتحركة تماما في هذا الحساب فقط ، وليس تلك التي لا تزال تظهر استجابات جزئية ، مثل الانحناء C فقط دون السباحة اللاحقة للهروب أو حركات الذيل فقط (الشكل 2B). تعرضت الأجنة ل 8 تركيزات من مثبط قناة الصوديوم Tricaine methanesulfonate ، والذي يستخدم بشكل متكرر لتخدير الأسماك31. تشير البيانات إلى مستوى خلفية يبلغ حوالي 25٪ من الحركة استجابة لمحفز الاهتزاز. بدءا من 1٪ تريكايين ، يتم تقليل الحركة ثم تتوقف فوق 2.5٪. يحسب سير عمل KNIME BMC50 على أنه 164.9 ميكرومتر ، وهو ما يتوافق مع 1.07٪ تريكايين ومستوى حركة 75٪ (الشكل 2C). تشير فترات الثقة الصغيرة بنسبة 95٪ (المشار إليها بالظلال الرمادية في المنحنى) إلى قابلية استنساخ قوية لقيم الحركة في هذا الفحص.

يوضح الشكل 2D مثالا على تشغيل فحص دون المستوى الأمثل ، لا ينبغي استخدام بياناته لحسابات BMC. يتم عرض خمس مجموعات تحكم معالجة E3 مع أجنة مختلفة مشتقة من نفس القابض (AB2O2 [سلالة من النوع البري] تتضاعف 1-5). تظهر المجموعة الأولى فقط استجابة شبه طبيعية ، تظهر حوالي 25٪ من الحركة التي تتوافق مع قيم الأدبيات32 وتلك التي تم الحصول عليها في الفحص الموصوف هنا ، كما هو موضح في الشكل 2 أ ، بينما تظهر جميع المجموعات الأخرى استجابات سلوكية منخفضة و / أو غير مكتملة (على سبيل المثال ، تظهر فقط منحنى C لا يتبعه نشاط سباحة ، أو حركة بدون انحناء C واضح في البداية). قد تحدث مثل هذه الاستجابة عندما لا تتطور الأجنة بشكل صحيح وتكون في حالة غير ناضجة بسبب تأخر النمو ، مما يؤثر على قوة الاستجابة المفاجئة14,33.

Figure 2
الشكل 2: مثال على نتيجة نموذجية ، بما في ذلك حساب الجرعة المرجعية. (أ) النسبة المئوية للأجنة غير المستجيبة بعد النبض الصوتي لليرقات البرية غير المعالجة ل 48 قوابض (ن = 10 لكل قابض). يشار إلى المتوسط (14.33٪) والانحراف المعياري (±16.19٪) باللون الأحمر. (ب) تقييم سلوك الاستجابة المفاجئة للأجنة (ن = 20 لكل حالة) المعالجة بالتركيز المشار إليه من التريكايين في وسط E3 أو مع E3 وحده كعنصر تحكم. يتم تصنيف السلوك وفقا لنظام الألوان والرسوم المتحركة المشار إليها على يمين الرسم البياني ، مع تعيين كل جنين لواحد فقط من الفئات التالية: "غير متحرك": الجنين لا يظهر أي حركة. "تحريك الذيل": يظهر الجنين حركة الذيل ، ولكن لا يظهر سلوك الانحناء C ولا السباحة ؛ "متحرك": يظهر الجنين حركة السباحة ، ولكن لا يوجد انحناء C استجابة للتحفيز الاهتزازي ؛ "C-bend فقط": يظهر الجنين C-bend ، ولكن لا يهرب من السباحة ؛ "C-bend + motile": يظهر الجنين سلوك C-bend نموذجي متبوعا بالسباحة المفاجئة (الاستجابة الكاملة النموذجية). تظهر السلوكيات المختلفة كنسبة مئوية من إجمالي عدد الأجنة لكل علاج. (ج) الرسم البياني لحساب BMC الناتج عن سير عمل KNIME ، مما يشير إلى النسبة المئوية للأجنة "غير المتحركة" لكل تركيز علاجي. تشير الخطوط الزرقاء والحمراء والسوداء إلى قيم BMC10 و BMC25 و BMC50 ، أي التركيزات التي تظهر فيها 10٪ و 25٪ و 50٪ من الأجنة مستويات حركة أعلى من الخلفية ، على التوالي. (د) مثال على تشغيل الفحص المهمل. يتم عرض خمسة أشواط تحكم معالجة ب E3 مع أجنة مختلفة من النوع البري AB2O2 مشتقة من نفس القابض (النسخ المتماثل 1-5). يظهر النسخ المتماثل 1 فقط استجابة طبيعية تقريبا ، في حين أن أجنة الأشواط المتبقية لا تظهر استجابة C-bend + escape swim النموذجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المعلمات الإحصائية لتقدير جودة الملاءمة والعتبات لقبول قيم BMC المحددة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: خصائص مجموعة مختارة من أنظمة فحص الاستجابة الاهتزازية للفزع. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: قالب Excel لملف التكوين. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: قالب إدخال KNIME مع مثال على مجموعة البيانات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: مثال على ملف إخراج KNIME. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

نقدم سير العمل وتحليل البيانات لتقييم المركبات الكيميائية باستخدام إعداد مقايسة اهتزاز جنين الزرد المصمم خصيصا. يولد تدفق العمل بيانات قوية تسمح بحساب المعلمات النموذجية التي تحدد سمية المركبات ، مثل التركيز / الجرعة المرجعية (BMC / BMD). تسمح نمطية الإعداد بالتكيف مع الاحتياجات المختلفة لمتطلبات الإنتاجية والمساحة. نظرا لأن النظام مصنوع من مكونات قاعدية منخفضة التكلفة ، بعد إعداد بسيط نسبيا ، فإنه يوفر بديلا رخيصا للأنظمة التجارية الحالية ، والتي يتم تصميمها بشكل عام لعدة أنواع من الفحص في وقت واحد ، وتعتمد على البرامج الاحتكارية ، وتظل مكلفة نسبيا.

يسمح كل من هذه الأنظمة التجارية وغيرها من الأنظمة المصممة خصيصا بتقييم الأجنة المفردة أو اليرقات في صفائح متعددة الآبار (على سبيل المثال ، 12 بئرا34 ، 16 بئرا32،35 ، 24 بئرا20،33،36 ، 48 بئرا37 ، 96 بئرا38،39،40،41،42 وحتى 384 بئرا [مثل بئر 4 × 96]43)، ولكن التقييد المكاني في الآبار يجعل تحليل بعض بارامترات البيانات الخاصة باستجابة الهروب (مثل المسافة المقطوعة) أكثر صعوبة. علاوة على ذلك ، في بعض هذه الإعدادات ، يقتصر التصوير على مجموعة فرعية من آبار اللوحة ، مما يقلل من الإنتاجية36,39. يسمح تصوير الأجنة في الأطباق بتقييم أفضل لمعلمات استجابة الهروب ويتيح تسجيل سلوك العديد من الأجنة في وقت واحد (حتى 30 في طبق 6 سم ، على سبيل المثال). عادة ، يقتصر التصوير القائم على الأطباق على طبق واحد لكل تشغيل44،45،46،47،48 (استثناءات إجراء التصوير بالتوازي على 6 أطباق مع يرقة واحدة لكل49 أو على 4 يرقات في 2 أطباق مقسمة50) ، وهو عيب يمكن حله عن طريق التصاميم المتوازية كما هو الحال في حالتنا. لقد لخصنا بعض خصائص النظام المستخدم في هذه الدراسة وغيرها من الحلول التجارية والمخصصة في الجدول 220،32،33،34،35،36،37،38،39،40،41،42،43 ، 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.

تتمثل إحدى مزايا هذه الطريقة في قراءة تلتقط كل من التغيرات المميتة والسلوكية ، والتي يمكن أن تزيد من أداء تقييمات السمية. على سبيل المثال ، في حين ثبت أن اختبار السمية الحادة لجنين أسماك الزرد (FET)5 يتنبأ بالسمية في اختبار السمية الحادة للأسماك البالغة53 بشكل جيد ، فقد تحسنت دقة التنبؤ من خلال تضمين القراءات السلوكية54. والسبب في ذلك هو ضعف معدل الوفيات الناجم عن المركبات العصبية النشطة التي تظهر في أجنة الأسماك ، ربما بسبب عدم وجود متلازمة الفشل التنفسي التي تسبب سمية معززة في الأسماك اليافعة أو البالغة. ومع ذلك ، يمكن تحديد النشاط العصبي من خلال تقييم السلوك. علاوة على ذلك ، يمكن للقراءات السلوكية أيضا التقاط التأثيرات السامة للعضلات وتسمم الأذن بالإضافة إلى التأثيرات السامة الأخرى الأكثر دقة على علم وظائف الأعضاء ، والتي تكون شبه مميتة ولكنها تؤثر على الأداء السلوكي للكائن الحي.

عند إجراء الفحص ، من الأهمية بمكان ضمان التعامل السليم مع المركبات وكذلك استخدام مجموعة متجانسة من أجنة الزرد. وبالتالي ، فإن استخدام القوارير الزجاجية لتخزين المركب يجب أن يقلل من انخفاض تركيزات المواد الكيميائية ، وخاصة المركبات الكارهة للماء ، بسبب امتصاص المواد البلاستيكية. في حالة المركبات ذات القدرة الاستيعابية العالية للبوليسترين "البلاستيكي" ، يمكن أيضا استخدام الألواح الزجاجية للحضانة. يعد تنظيف البويضات في أطباق زراعة الأنسجة المستخدمة لجمع وإزالة الأجنة الميتة خطوة حاسمة لضمان التطور القياسي. السرعة الطبيعية للتطور مهمة ، حيث قد تؤثر التأخيرات التنموية على نضج الشبكات العصبية الكامنة وراء السلوك المقيم14,33. أيضا ، لتمكين مقارنة التأثيرات المركبة ، يجب اشتقاق البيض من نفس السلالة حيث تم الإبلاغ عن سلالات مختلفة لتقديم ملامح سلوكية مختلفة38،55،56،57. أثناء التعرض ، من المهم احتضان الأجنة في غرفة مرطبة لتجنب التبخر المفرط لوسط E3 ، مما قد يغير التركيزات التي تم اختبارها.

يجب دمج ضوابط E3 في كل عملية من أجل تحديد مستوى استجابة خط الأساس لدفعة معينة من الأجنة المستخدمة في سلسلة الاختبار. عادة ، نقوم بتشغيل لوحة واحدة من عناصر التحكم على طول كل مجموعة من 5 قياسات. كما هو موضح في الشكل 2D ، يسمح هذا النهج أيضا باكتشاف الدفعات ذات الاستجابات دون المستوى الأمثل بسبب تأخر التطور أو لأسباب أخرى ، مثل تأثيرات الخلفية الجينية. في حالة عدم وجود استجابة غير متوقعة للتحفيز ، احترس أيضا من فشل محول الطاقة المحتمل. عادة ، تظهر الاستجابات المفاجئة سلوك استجابة التركيز السيني الذي يسمح بتركيب المنحنى باستخدام نموذج لوجستي لوغاريتمي. ومع ذلك ، في حالات نادرة مع استجابات ثنائية الطور ، قد يتعين استخدام نماذج أخرى ، مثل نماذج Gaussian أو Cedergreen. وهي متوفرة ضمن حزم R drc و bdm27,28.

قد يشير عدم الاستجابة للمثير الاهتزازي ببساطة إلى موت الأجنة أو ضعف شديد في وظائف الحياة بسبب السمية الخلوية العامة ، ولكنه قد يعكس أيضا سمية أكثر تحديدا تستهدف الدوائر العصبية لإدراك التحفيز والتكامل والإنتاج الحركي. الآثار المركبة المحتملة الأخرى هي التداخل مع الواجهة العصبية العضلية أو مع بنية العضلات ووظيفتها. للتمييز بين هذه الاحتمالات ، من الضروري إجراء مزيد من المقايسات. على سبيل المثال ، يمكن تقييم السلامة الهيكلية للعضلات من خلال مقايسة الانكسار58,59 ، وتتوفر خطوط معدلة وراثيا لتقييم اضطراب الوظيفة العضلية والعصبية60,61. ومع ذلك ، فإن بيانات الفيديو المسجلة تسمح بالفعل بإجراء تحليل أكثر تفصيلا للتشكل والاستجابة السلوكية للأجنة التي يمكن أن توفر معلومات إضافية أولى. هل فقط الانحناء C ضعيف ، أم كل الحركة؟ هل لا تزال بقايا النشاط العصبي العضلي موجودة ، كما يتضح من حركات الذيل الضعيفة أو المرتجفة؟ هل تتماشى هذه السلوكيات المتغيرة مع التغيرات في التشكل ، مثل الوذمة أو زيادة انحناء الجسم؟ بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم معلمات مثل وقت الكمون حتى الانحناء C أو المسافة المقطوعة أثناء استجابة الهروب (انظر ، على سبيل المثال ، المرجع 44).

يسمح بروتوكول الفحص الموصوف هنا بإجراء تقييمات سريعة وقوية للسمية المركبة ، مع القيمة المضافة للكشف على وجه التحديد عن المركبات السمية العصبية غير القاتلة ، والسامة للأذن ، والسمية العضلية. سير عمل التحليل المقدم سهل التنفيذ ويوفر قراءات قوية. تم استخدام تعديلات بروتوكولات التحفيز المستخدمة في مقايسة الاهتزاز المفاجئة لمعالجة التأثيرات المركبة على الجوانب الأكثر تعقيدا لسلوك المفاجئة أيضا ، مثل تثبيط النبضات (PPI) 39،44 والتعود32،33 ، ويمكن تكييفها مع إعداد التحفيز القائم على محول الطاقة الكهروديناميكي المستخدم في هذه الدراسة.

يتمثل أحد التطبيقات الرئيسية لأنظمة الفحص القائمة على الاستجابة المذهلة في تقييم التأثيرات المركبة في الشاشات الكيميائية ، والتي لها صلة بكل من تقييم السمية البشرية وتطوير الأدوية1،4،62. في الوقت نفسه ، من خلال اختبار مراحل الحياة المبكرة للكائن المائي ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها لها صلة مباشرة بتقييم مخاطر السمية البيئية63,64. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام أنظمة الاستجابة المفاجئة للتنميط الظاهري السلوكي في الشاشات الجينية65،66،67،68،69. يوفر نظامنا القابل للتنفيذ والتكيف بسهولة إعدادا ميسور التكلفة للمختبرات الأصغر التي تعتزم إجراء مشاريع فحص خاصة بها في مجالات التطبيق المختلفة هذه.

Disclosures

ليس لدينا ما نكشف عنه.

Acknowledgments

ونقدر لحسن الحظ المساعدة التقنية الممتازة التي قدمها موظفو الدعم في مرفق الأسماك ومركز الفحص التابع للمعهد الدولي للسلامة الكيميائية. حصل هذا العمل على تمويل من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 965406 (PrecisionTox). ولا يعكس هذا الناتج سوى رأي صاحبي البلاغ، ولا يمكن اعتبار الاتحاد الأوروبي مسؤولا عن أي استخدام للمعلومات الواردة فيه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm Sigma-Aldrich Z289744-1EA Or comparable material
High-speed camera XIMEA  MQ013MG-ON USB 3 
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap VWR 215-3261 Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL SARSTEDT 70.3010.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL SARSTEDT 70.3050.100 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL SARSTEDT 70.3020.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL SARSTEDT 70.3030.100 Or comparable material
Serological pipette 10 mL SARSTEDT 86.1254.001 Or comparable material
Serological pipette 25 mL SARSTEDT 86.1685.001 Or comparable material
Serological pipette 5 mL SARSTEDT 86.1253.001 Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) Greiner bio-one 628102 Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) SARSTEDT 83.3902.500 Or comparable material
Transfer pipette 6 mL SARSTEDT 86.1175 Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP SARSTEDT 62.554.502 Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP SARSTEDT 62.5472.54 Or comparable material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  4. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  5. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2013).
  6. OECD. Test No. 250: EASZY assay - Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2021).
  7. Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
  8. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
  9. Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
  10. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  11. Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
  12. Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
  13. Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
  14. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
  15. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
  16. Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
  17. Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
  18. Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
  19. Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
  20. Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
  21. van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
  22. Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
  23. Marcato, D. Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , Karlsruhe Institute of Technology. https://publikationen.bibliothek.kit.edu/1000085054 (2018).
  24. PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
  25. Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish - A Practical Approach. , Oxford University Press, Oxford. (2002).
  26. Preisach, C. hristine, Burkhardt, H. ans, Schmidt-Thieme, L. ars, Decker, R. einhold Data Analysis, Machine Learning and Applications. , Springer Berlin, Heidelberg. (2008).
  27. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
  28. Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
  29. Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
  30. Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
  31. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
  32. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  33. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
  34. Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
  35. Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
  36. Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
  37. Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
  38. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  39. Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
  40. Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
  41. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
  42. Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
  43. Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
  44. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
  45. Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
  46. Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
  47. Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
  48. Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
  49. Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
  50. Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
  51. Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
  52. Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
  53. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2019).
  54. Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
  55. Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
  56. van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
  57. van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
  58. Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
  59. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  60. Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
  61. Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
  62. Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
  63. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  64. Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
  65. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  66. Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
  67. Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
  68. Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
  69. Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 203 ،
تقييم سمية المواد الكيميائية باستخدام نظام فحص الاستجابة المفاجئة لاهتزاز الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von… More

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von Clausbruch, C. A., Pace, G., Strähle, U., Colbourne, J. K., Pylatiuk, C., Peravali, R., Weiss, C., Scholz, S., Dickmeis, T. Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System. J. Vis. Exp. (203), e66153, doi:10.3791/66153 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter