Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utvärdering av kemikaliers toxicitet med hjälp av ett screeningsystem för zebrafiskvibrationer

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66153
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 4, 5, 1, 1, 6, 1
1Institute of Biological and Chemical Systems - Biological Information Processing, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 2DITABIS AG - Digital Biomedical Imaging Systems AG, 3Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 4School of Biosciences, University of Birmingham, 5Institute for Automation and Applied Informatics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 6Department of Bioanalytical Ecotoxicology, Helmholtz-Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

Vi beskriver ett screeningsystems arbetsflöde och dataanalys för att utvärdera kemisk föreningstoxicitet baserat på zebrafiskembryots vibrationsrespons. Systemet registrerar zebrafiskembryons rörelser när de utsätts för vibrationsstimuli och möjliggör en integrerad utvärdering av allmän toxicitet/dödlighet och neuromuskulär toxicitet.

Abstract

Vi utvecklade ett enkelt screeningsystem för utvärdering av neuromuskulär och generell toxicitet i zebrafiskembryon. Det modulära systemet består av elektrodynamiska givare ovanför vilka vävnadsodlingsskålar med embryon kan placeras. Flera sådana par av högtalare-vävnadskulturer kan kombineras. Vibrationsstimuli som genereras av de elektrodynamiska givarna inducerar en karakteristisk skrämsel- och flyktrespons hos embryona. En remdriven linjär drivning placerar sekventiellt en kamera ovanför varje högtalare för att registrera embryonas rörelser. På detta sätt kan förändringar i skrämselresponsen på grund av dödlighet eller neuromuskulär toxicitet hos kemiska föreningar visualiseras och kvantifieras. Vi presenterar ett exempel på arbetsflödet för screening av kemiska föreningar med hjälp av detta system, inklusive beredning av embryon och behandlingslösningar, drift av registreringssystemet och dataanalys för att beräkna referenskoncentrationsvärden för föreningar som är aktiva i analysen. Den modulära monteringen baserad på kommersiellt tillgängliga enkla komponenter gör detta system både ekonomiskt och flexibelt anpassningsbart till behoven hos särskilda laboratorieuppställningar och screeningändamål.

Introduction

Under de senaste åren har zebrafiskar blivit mycket populära modellorganismer för utvärdering av kemiska föreningars effekter, och omfattar forskningsområden från läkemedelsutveckling till miljötoxikologi1. Som ryggradsdjur delar zebrafiskar många aspekter av sin genetiska uppsättning och övergripande fysiologi med människor 2,3. Därför är resultat som erhålls i denna modell ofta direkt relevanta för människors hälsa. Flera läkemedelskandidater som för närvarande befinner sig i kliniska prövningar har identifierats i sammansatta skärmar med zebrafisk4.

Toxicitetsbedömning är en viktig tillämpning där tester med zebrafiskens embryonala stadier är av intresse. Det finns olika testriktlinjer från Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) för användning av zebrafisk vid testning av miljötoxicitet 5,6. Zebrafiskembryonas ringa storlek och snabba utveckling gör dem mycket lämpliga för screening på en medelhög till hög genomströmningsskala 1,3,4. Toxikologiska effektmått som är inriktade på sådana screeningar inkluderar embryonala missbildningar och dödlighet7, endokrina störningar8, organtoxicitet9 och beteendebedömningar som tyder på neural toxicitet10,11. Beteendeanalyserna är möjliga eftersom zebrafiskembryon visar olika typer av motoriska svar på olika stimuli beroende på deras utvecklingsstadium. Till exempel visar embryon 1 dag efter befruktning (dpf) spontan svansringning12 och svarar på en sekvens av ljuspulser med en typisk sekvens av rörelser, den så kallade fotomotoriska responsen (PMR)10. Efter kläckningen, som vanligtvis sker cirka 48-72 timmar efter befruktningen (hpf), utvecklar de fritt simmande eleutheroembryona13 gradvis skrämsel- och flyktreaktioner på vibrationsstimuli med början runt 4 dpf14. Dessa reaktioner kännetecknas av en distinkt böjning i motsatt riktning mot stimulusriktningen (den så kallade C-böjen eller C-starten), som följs av en mindre motböjning och simbeteende 14,15,16,17. Embryonala beteenden styrs av neurala kretsar som använder olika neurotransmittorsystem, vilket gör det möjligt att undersöka kemiska sammansatta effekter som riktar sig mot dessa system. Till exempel avslöjade PMR-analysen effekterna av föreningar som stör kolinerg, adrenerg och dopaminerg signalering10, medan skrämselresponsen involverar kolinerga, glutamaterga och glycinerga neuroner 16,18. Dessutom kommer föreningar som skadar musklerna eller det neuromuskulära gränssnittet också att påverka dessa beteenden, liksom föreningar som är giftiga för innerörat/hårcellerna i sidolinjen 19,20. Att observera zebrafiskars rörelsebeteende som svar på ett stimuli är därför ett lämpligt sätt att bedöma inte bara neurotoxicitet utan även ototoxicitet och myotoxicitet. Poängsättning av rörelsebeteende fungerar också som en proxy för allmän toxicitet/dödlighetsbedömning eftersom döda embryon inte rör sig. Därmed representerar embryonala rörelsebeteenden en integrativ avläsning för en första klassens toxicitetsscreeningmetod, som indikerar dödliga och neuromuskulära sammansatta effekter i en uppställning. Med tanke på att eleutheroembryon redan är kapabla att metabolisera föreningar, kan tillvägagångssättet också upptäcka effekterna av metaboliska transformationsprodukter 7,21,22. Det är viktigt att notera att zebrafiskembryon inte betraktas som skyddade livsstadier enligt vissa djurskyddslagar förrän stadiet för fri utfodring efter 120 hpf13. De betraktas därför som ett alternativ till toxicitetstester på djur.

Figure 1
Figur 1: Inställning av systemet för vibrationsstart. (A) Översikt över systemet. Plattor med embryon som exponerats för testföreningarna placeras på den elektrodynamiska givaruppsättningen ("högtalare"). Kameran flyttas sekventiellt av den remdrivna linjära drivningen till inspelningspositionen ovanför målgivaren. (B) Detaljerad view av givaren/högtalaren med vävnadsodlingsskål insatt ovanpå. Plattorna belyses underifrån av en LED-ljusskiva på 4000-5000 lux. En LED-lampa bredvid högtalaren tänds medan stimulansen ges. C) Stillbild av video som spelats in av kameran vid stimulering av embryona. (D) Skärmdump av konfigurationsfilen. (E) Skärmdump av inspelningsprogramvarans gränssnitt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Här beskriver vi ett testprotokoll för utvärdering av sammansatta effekter på vibrationsskrämselresponsen med hjälp av en egenbyggd enkel testanordning baserad på vibrationsstimuli som genereras av elektrodynamiska givare i kombination med en automatiserad videoinspelning av flera fritt rörliga embryon i en vävnadsodlingsskål23. Systemet är modulärt och möjliggör sekventiell registrering från flera vävnadsodlingsskålar parallellt. I den uppställning som för närvarande används ger fem elektrodynamiska givare en vibrationsstimulus (500 Hz, varaktighet 1 ms) till vävnadsodlingsskålar som innehåller 20 embryon placerade ovanpå dem (figur 1). Plattorna belyses underifrån med 4000-5000 lux med LED-ljusskivor. En LED-lampa bredvid varje givare indikerar perioder av stimulusapplicering, och ett oscilloskop indikerar vågformer och frekvens för den applicerade stimulus (för detaljer, se Ref. 23). Embryonas beteende registreras av en höghastighetskamera (Table of Materials) med 1000 bilder per sekund (fps), som flyttas ovanför den riktade högtalaren av en remdriven linjär drivenhet. Denna inspelningshastighet krävs för att på ett tillförlitligt sätt lösa skrämselresponsen. Systemet är ett kostnadseffektivt och individuellt anpassningsbart alternativ till dagens kommersiella system. Det exakta arbetsflöde som beskrivs nedan utförs för närvarande inom ramen för initiativet för precisionstoxikologi24 för att fastställa lämpliga exponeringsförhållanden för insamling av OMICS-data från zebrafiskembryon som behandlats med en utvald uppsättning toxiska ämnen.

Protocol

All uppfödning och hantering av zebrafiskar utfördes i enlighet med de tyska djurskyddsnormerna och godkändes av regeringen i Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Tyskland (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).

1. Beredning av stamlösningar av kemikalier som ska testas

  1. Märk injektionsflaskan av glas (eller kemisk alikvot) med föreningens namn/förkortning, stamkoncentration och beredningsdatum. Till exempel CdCl2_2.5 g· L-1_210813.
  2. Centrifugera den kemiska alikvoten vid 2000 x g i 1 minut vid rumstemperatur (RT).
  3. Väg blandningen (vid behov) under ett dragskåp på en våg som är känslig för 0,001 g och överför den till den märkta injektionsflaskan. Om föreningen är en vätska, tillsätt den till injektionsflaskan med hjälp av en pipett och en pipettspets av plast.
    OBS: Till exempel, för trikainmetansulfonatstammen som användes i resultatexemplet som visas i figur 2, vägdes 400 mg i den märkta injektionsflaskan.
  4. Tillsätt lösningsmedel (t.ex. sterilt rent vatten eller dimetylsulfoxid (DMSO), beroende på föreningarnas fysikalisk-kemiska egenskaper) med hjälp av en pipett och en pipettspets av plast. Om möjligt är vatten det föredragna lösningsmedlet.
    OBS: Till exempel, för tricainestammen bereddes en 15,3 mM lösning i 100 ml vatten.
  5. Förslut injektionsflaskan, skaka försiktigt och kontrollera om den har fällts ut.
  6. Bered utspädda stamlösningar (om nödvändigt) i injektionsflaskor av glas med hjälp av pipetter och pipettspetsar av plast.
    OBS: Till exempel behövdes ingen ytterligare utspädning för tricinbeståndet.
  7. Förvara stamlösningen (-lösningarna) vid -20 °C fram till användning.
  8. Förvara den återstående kemiska alikvoten under samma förhållanden som tidigare.
  9. Registrera information om lageralikvot i labbanteckningsboken.

2. Insamling och uppfödning av zebrafiskembryon

  1. Samla embryon i klyvningsstadier (2-8 celstadier) från naturlig lek av gruppparningar i 10 cm vävnadsodlingsskålar.
  2. Välj ett parti av lämplig kvalitet: mindre än 10 % obefruktade/döda ägg.
  3. Rengör disken (ta bort obefruktade ägg, skräp, fjäll etc.).
  4. Placera 60 embryon per 10 cm vävnadsodlingsskål i 15 ml E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)25.
  5. Placera disken i en fuktad kammare som tillagas genom att lägga ut pappershanddukar indränkta med vatten.
  6. Föd upp embryon till 72 hpf i en inkubator vid 28,5 °C.

3. Beredning av arbetsutspädning av kemikalier som ska provas

  1. Ta ut stamlösningen ur frysen på -20 °C och låt den tina.
  2. Om föreningens löslighet är tillräckligt hög, bered seriespädningar i E3-medium i glasflaskor, 1 ml per replikat per koncentration. Se till att koncentrationen är 10 gånger högre än den önskade exponeringskoncentrationen. På så sätt undviker man att behöva byta hela embryots medium i början av exponeringen. Vid låg löslighet bereds de seriella spädningarna direkt vid de önskade exponeringskoncentrationerna, 10 ml per replikat per koncentration.
  3. Kontrollera om det finns nederbörd (vid behov). Om lösningen har fällts ut, registrera detta och späd sedan ytterligare för att uppnå nästa högsta koncentration. Kontrollera igen om det finns nederbörd. Upprepa tills det inte finns någon nederbörd.
  4. Kontrollera pH-värdet i exponeringslösningen. Om du ligger utanför pH-intervallet 7,0-8,5, registrera detta och bered lösningarna i E3 som innehåller 5 mM HEPES/pH 7,4, justera pH med HCl eller NaOH.
  5. Kassera oanvända exponeringsmedier i enlighet med lokala bestämmelser.

4. Exponering av embryon för de kemikalier som ska testas

  1. Kontrollera skålarna med de 72 hpf gamla embryona för döda/okläckta embryon och ta bort dem. Om en omgång embryon innehåller mer än 5 % okläckta ägg, ta bort partiet.
  2. Placera 10 embryon per 6 cm vävnadsodlingsskål i 9 ml E3-medium (exponeringsplatta).
  3. Märk exponeringsplattorna med föreningens namn, exponeringskoncentration och replikatnummer. Till exempel, "CdCl2 1 mg· L-1 01". Bifoga tillräckligt med E3-plattor och en kontrollplatta för lösningsmedel vid behov (se avsnitt 5).
  4. Tillsätt 1 ml exponeringslösning till varje platta, börja med den lägsta koncentrationen, och snurra plattan. För föreningar med låg löslighet, byt ut hela 10 ml av plattan mot exponeringslösningen (se steg 3.2).
  5. Anteckna den tidsmässiga ordning i vilken sammansatta lösningar tillsattes till embryona.
  6. Inkubera plattorna i den fuktade kammaren i en inkubator vid 28,5 °C i 48 timmar tills de når 120 hpf.

5. Utföra vibrationsstartelanalysen

OBS: Analysera plattorna i samma ordning som i steg 4.5. Varje körning bör innehålla en E3-kontrollplatta.

  1. Slå på datorn och vibrationsanordningen (blå LED-lampa ska lysa).
  2. Förbered konfigurationsfilen i ett kalkylblad, som visas i figur 1D och bifogas som tilläggsfil 1. Registrera exponeringsinformation för var och en av de 5 plattpositionerna (förening, koncentration, replikat).
  3. Öppna programmet för allmänt användargränssnitt (GUI) (finns på https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit, projekt-ID 43215.)
  4. Kontrollera kamerarörelsen genom att välja de olika positionerna i GUI-programmet och observera kamerarörelserna.
  5. Ta ut provplattorna som ska mätas från inkubatorn. Placera provplattorna på de 5 positionerna (se figur 1A, "högtalare") och låt embryona sätta sig i flera minuter.
  6. Klicka på Spela in; Ett fönster öppnas för att välja konfigurationsfilen.
  7. Välj lämplig konfigurationsfil som förbereddes i steg 5.2 för den här körningen.
  8. Kontrollera att provbeskrivningen stämmer överens med proverna på varje position (1-5).
  9. Mätningen sker automatiskt (10 s / position). När ljudpulsen appliceras av programmet tänds en lysdiod. Registrering för 10 s/position gör det möjligt att samla in tillräckligt med data för att uppskatta simhastighet och tillryggalagd sträcka både före och efter att stimulansen appliceras och förhindrar tillvänjning till efterföljande stimuli.
  10. När inspelningen är klar går kameran tillbaka till position 1 och programvaran börjar komprimera filerna. Under denna tid, byt ut samples med nästa uppsättning som behöver mätas.
  11. Gå till steg 5.2. för att spela in nästa körning.
  12. När alla plattor har mätts, samla upp exponeringslösningarna. Använd en sil för att behålla embryona.
  13. Avliva embryona genom snabb nedkylning i ett is/isopropanolbad (5%).
  14. Kassera exponeringslösningarna och döda embryon enligt lokala bestämmelser.

6. Analys av data

  1. Öppna videodata med VirtualDub (1.10.4).
  2. Poängsätt visuellt antalet embryon som svarar på ljudpulsen (när kontrolllampan lyser).
  3. Mata in data i ett kalkylblad. Anteckna föreningens namn, replikatet, koncentrationen av föreningen och procentandelen orörliga embryon i enlighet med mallen i tilläggsfil 2, som innehåller den exempeldatauppsättning som visas i figur 2C.
    OBS: Mallen har en flexibel struktur och gör det i princip möjligt att använda data från andra organismer och endpoints. Den beskriver responsen för varje koncentration och ger även beskrivningar av endpoints samt definitioner av de parametrar som genereras i den efterföljande koncentrations-responsmodelleringen.
  4. Utför benchmarkkoncentrationsanalysen (BMC) med hjälp av ett KNIME-arbetsflöde (KNIME analytics 4.6,26) med inbäddade R-skript (R-version 3.6., R-packages plotrix, drc och bmd27,28).
    OBS: I princip kan bedömningen också göras direkt i R. Men för enkelhetens skull och för att möjliggöra utvärdering som en webbaserad tjänst har analysen organiserats i ett KNIME-serverkompatibelt arbetsflöde. Utdata från KNIME-arbetsflödet finns i tilläggsfil 3. Mer information om de statistiska parametrar som genereras av KNIME-arbetsflödet finns i den här mallen. De statistiska parametrarna för att uppskatta lämpligheten av passform och trösklar för att acceptera fastställda BMC-värden visas i tabell 1. Själva KNIME-arbetsflödet är tillgängligt via GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). Koncentrationsresponsen modelleras med hjälp av en log-logistisk modell med 4 parametrar. Två av kurvanpassningsparametrarna kan fixeras. Vanligtvis skulle man fastställa maxvärdet till 100 när det gäller procentuella data. Om inga bakgrundseffekter observeras kan minimivärdet fastställas till 0 %.

Representative Results

Figur 2A visar andelen orörliga embryon i 48 kullar av obehandlade vildtypsembryon (AB2O2-stam). I genomsnitt reagerar 14,33 % av obehandlade vildtypsembryon inte på vibrationsstimulus. I 4 kullar nådde andelen orörliga larver 50 %, men 75 % av kullarna hade en andel orörliga larver under 20 %.

Figur 2B,C visar ett exempel på en typisk beräkning av en referenskoncentration/dos (BMC/BMD29,30) för sammansatta effekter på motilitet med arbetsflödet för vibrationsskrämselanalys, som för närvarande utförs inom PrecisionTox-konsortiet24. BMC10-, BMC25- och BMC50-värdena motsvarar de koncentrationer vid vilka 10 %, 25 % respektive 50 % av embryona uppvisar orörliga nivåer som är högre än bakgrunden. Endast embryon som är helt orörliga ingår i denna beräkning, inte de som fortfarande visar partiella svar, till exempel endast en C-böjning utan efterföljande flyktsimning eller endast svansrörelser (figur 2B). Embryona exponerades för 8 koncentrationer av natriumkanalhämmaren tricaine metansulfonat, som ofta används för fiskbedövning31. Data indikerar en bakgrundsnivå på cirka 25 % orörlighet som svar på vibrationsstimulus. Från och med 1 % tricain minskar motiliteten och upphör sedan över 2,5 %. KNIME-arbetsflödet beräknar BMC50 till 164,9 μM, vilket motsvarar 1,07 % tricain och en orörlighetsnivå på 75 % (figur 2C). De små 95-procentiga konfidensintervallen (indikeras av de grå nyanserna i kurvan) indikerar robust reproducerbarhet av motilitetsvärdena i denna analys.

Figur 2D visar ett exempel på en suboptimal analyskörning, vars data inte bör användas för BMC-beräkningar. Fem E3-behandlade kontrollgrupper med olika embryon från samma kull visas (AB2O2 [vildtypsstam] replikat 1-5). Endast den första gruppen visar en nästan normal respons och visar cirka 25 % orörlighet, vilket överensstämmer med litteraturvärden32 och de som erhållits i analysen som beskrivs här, som visas i figur 2A, medan alla andra grupper visar minskade och/eller ofullständiga beteendemässiga reaktioner (t.ex. visar endast en C-böj som inte följs av simaktivitet, eller rörlighet utan en tydlig C-böj i början). En sådan reaktion kan uppstå när embryon inte utvecklas ordentligt och är i ett omoget tillstånd på grund av utvecklingsförsening, vilket påverkar robustheten i skrämselresponsen14,33.

Figure 2
Figur 2: Exempel på ett typiskt resultat, inklusive beräkning av referensdos. A) Procentandel embryon som inte svarar efter ljudpulsen för obehandlade larver av vildtyp för 48 kullar (n = 10 per kull). Medelvärdet (14,33 %) och standardavvikelsen (±16,19 %) är markerade med rött. (B) Utvärdering av skrämselbeteende hos embryon (n=20 per tillstånd) som behandlats med den angivna koncentrationen av tricain i E3-medium eller med enbart E3 som kontroll. Beteendet klassificeras enligt färgschemat och karikatyrerna som anges till höger om grafen, där varje embryo endast tilldelas en av följande klasser: "orörlig": embryot visar ingen rörelse; "svansen rör sig": embryot visar svansrörelser, men varken C-böjning eller simbeteende; "rörlig": embryot visar simrörelse, men ingen C-böjning som svar på vibrationsstimuleringen; "Endast C-böjning": embryot visar C-böjning, men inte undflyende simning; "C-böj + rörlig": embryot uppvisar ett typiskt C-böjningsbeteende följt av flyktsimning (den typiska fullständiga skrämselreaktionen). De olika beteendena visas som en procentandel av det totala antalet embryon för varje behandling. C) BMC-beräkningsdiagram som genereras av KNIME-arbetsflödet och som anger procentandelen "orörliga" embryon för varje behandlingskoncentration. Blå, röda och svarta linjer indikerar BMC10-, BMC25- och BMC50-värdena, dvs. de koncentrationer vid vilka 10 %, 25 % och 50 % av embryona visar immotilitetsnivåer som är högre än bakgrunden. (D) Exempel på en kasserad analysomgång. Fem E3-behandlade kontrollomgångar med olika AB2O2-vildtypsembryon från samma kull visas (replikat 1-5). Endast replikat 1 visar en nästan normal respons, medan embryon från de återstående löpningarna inte visar den typiska C-böjningen + flyktsimningsresponsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Statistiska parametrar för att uppskatta lämpligheten av passform och trösklar för att acceptera fastställda BMC-värden. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Egenskaper hos ett urval av analyssystem för vibrationsskrämselrespons. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tilläggsfil 1: Excel-mall för konfigurationsfil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 2: KNIME-indatamall med ett exempel på datauppsättning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: Exempel på KNIME-utdatafil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Vi presenterar arbetsflödet och dataanalysen för utvärdering av kemiska föreningar med hjälp av en specialbyggd zebrafiskembryovibrationsanalys. Arbetsflödet genererar robusta data som gör det möjligt att beräkna typiska parametrar som specificerar föreningens toxicitet, t.ex. riktmärkeskoncentration/dos (BMC/BMD). Modulariteten i installationen möjliggör anpassning till olika behov av genomströmning och utrymmeskrav. Eftersom systemet är tillverkat av billiga basala komponenter, efter en relativt enkel installation, ger det ett billigt alternativ till befintliga kommersiella system, som i allmänhet är utformade för flera analystyper samtidigt, förlitar sig på proprietär programvara och förblir relativt dyra.

Både dessa kommersiella system och andra specialtillverkade system möjliggör bedömning av enskilda embryon eller larver i flerbrunnsplattor (t.ex. 12-brunnars34, 16-brunnars32,35, 24-brunnars 20,33,36, 48-brunnars37, 96-brunnars 38,39,40,41,42 och till och med 384-brunnars [som 4x96-brunn]43), men den rumsliga begränsningen i brunnarna gör analysen av vissa dataparametrar för flyktresponsen (t.ex. tillryggalagd sträcka) mer utmanande. Dessutom, i vissa av dessa uppställningar, är avbildningen begränsad till en delmängd av plattans brunnar, vilket minskar genomströmningenmed 36,39. Avbildning av embryon i skålar möjliggör bättre bedömning av parametrar för flyktrespons och gör det möjligt att registrera beteendet hos flera embryon samtidigt (upp till 30 i en 6 cm skål, till exempel). Vanligtvis är skålbaserad avbildning begränsad till en maträtt per körning 44,45,46,47,48 (undantag utför avbildning parallellt på 6 rätter med en larv vardera 49 eller på 4 larver i 2 delade rätter50), en nackdel som kan lösas med parallella konstruktioner som i vårt fall. Vi har sammanfattat några egenskaper hos systemet som används i denna studie och andra kommersiella och skräddarsydda lösningar i tabell 22 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.

En fördel med metoden är att den fångar både dödlighet och beteendeförändringar, vilket kan öka prestandan för toxicitetsbedömningar. Till exempel, medan zebrafiskembryot akut toxicitetstest (FET)5 har visat sig förutsäga toxicitet i det akuta toxicitetstestet för vuxna fiskar53 ganska bra, förbättrades dess förutsägelsenoggrannhet genom att inkludera beteendeavläsningar54. Anledningen till detta är den svaga dödligheten som induceras av neuroaktiva föreningar som ses i fiskembryon, troligen på grund av bristen på andningssviktssyndrom som orsakar ökad toxicitet hos unga eller vuxna fiskar. Neuroaktivitet kan dock identifieras genom bedömning av beteende. Dessutom kan beteendeavläsningar också fånga upp myotoxiska och ototoxiska effekter samt andra, mer subtila toxiska effekter på fysiologin, som är subletala men ändå påverkar organismens beteendemässiga prestanda.

När analysen utförs är det viktigt att säkerställa korrekt hantering av föreningar samt att använda en homogent utvecklande sats zebrafiskembryon. Således bör användning av glasflaskor för förvaring av föreningar minimera minskningen av koncentrationerna av kemikalier, särskilt hydrofoba föreningar, på grund av absorbans till plastmaterial. När det gäller föreningar med hög absorptionspotential till "plast" polystyren kan glasplattor också användas för inkubationen. Rengöring av äggen i vävnadsodlingsskålar som används för insamling och avlägsnande av döda embryon är ett kritiskt steg för att säkerställa standardutveckling. Normal utvecklingshastighet är viktig, eftersom utvecklingsförseningar kan påverka mognaden hos neurala nätverk som ligger till grund för det bedömda beteendet14,33. För att möjliggöra jämförelse av sammansatta effekter bör ägg härledas från samma stam eftersom olika stammar har rapporterats uppvisa olika beteendeprofiler 38,55,56,57. Under exponeringen är det viktigt att inkubera embryona i en fuktkammare för att undvika överdriven avdunstning av E3-mediet, vilket skulle förändra de koncentrationer som testas.

E3-kontroller bör ingå i varje omgång för att bestämma utgångsvärdet för responsnivån för den specifika omgång embryon som används i testserien. Vanligtvis kör vi en platta med kontroller längs varje uppsättning med 5 mätningar. Som illustreras i figur 2D gör detta tillvägagångssätt det också möjligt att upptäcka batcher med suboptimala svar på grund av försenad utveckling eller av andra skäl, t.ex. genetiska bakgrundseffekter. I händelse av en oväntad brist på respons på stimulansen, se också upp för potentiella givarfel. Vanligtvis visar skrämselreaktionerna ett sigmoidalt koncentrationsresponsbeteende som möjliggör kurvanpassning med hjälp av en log-logistisk modell. I sällsynta fall med bifasiska svar kan dock andra modeller behöva användas, såsom Gaussiska eller Cedergreen-modeller. De är tillgängliga inom R-paketen drc och bdm 27,28.

Bristen på respons på vibrationsstimulus kan helt enkelt tyda på att embryona dör eller allvarligt försämrade livsfunktioner på grund av allmän cytotoxicitet, men kan också återspegla mer specifik toxicitet som riktar sig mot neurala kretsar för stimulusperception, integration och lokomotorisk produktion. Andra möjliga sammansatta effekter är störningar i det neuromuskulära gränssnittet eller i muskelstruktur och funktion. För att skilja mellan dessa möjligheter krävs ytterligare analyser. Till exempel kan musklernas strukturella integritet bedömas med en dubbelbrytningsanalys 58,59, och transgena linjer finns tillgängliga för att bedöma perturbans av muskel- och nervfunktion60,61. De inspelade videodata möjliggör dock redan en mer detaljerad analys av embryonas morfologi och beteenderespons som kan ge den första ytterligare informationen. Är det bara C-böjen som är nedsatt, eller all rörlighet? Finns det fortfarande rester av neuromuskulär aktivitet, vilket indikeras av svaga eller darrande svansrörelser? Går sådana förändrade beteenden hand i hand med förändringar i morfologi, såsom ödem eller ökad kroppskrökning? Dessutom kan parametrar som latenstid fram till C-böjningen eller den tillryggalagda sträckan under flyktresponsen utvärderas (se t.ex. ref. 44).

Det screeningprotokoll som beskrivs här möjliggör snabba och robusta utvärderingar av substanstoxicitet, med mervärdet att specifikt detektera icke-dödliga neurotoxiska, ototoxiska och myotoxiska föreningar. Det tillhandahållna analysarbetsflödet är enkelt att implementera och ger en robust avläsning. Modifieringar av stimulusprotokollen som används i vibrationsskrämselanalysen har använts för att ta itu med sammansatta effekter på mer komplexa aspekter av skrämselbeteende också, såsom prepulse inhibition (PPI)39,44 och habituation32,33, och kan anpassas till den elektrodynamiska givarbaserade stimulusuppställningen som används i denna studie.

En huvudsaklig tillämpning av screeningsystem baserade på skrämselrespons är bedömning av sammansatta effekter i kemiska screeningar, vilket är av relevans både för utvärdering av toxicitet hos människor och för läkemedelsutveckling 1,4,62. Genom att testa de tidiga livsstadierna hos en vattenlevande organism har de erhållna resultaten samtidigt direkt relevans för ekotoxikologisk riskbedömning63,64. Dessutom kan skrämselresponssystem användas för beteendefenotypning i genetiska skärmar 65,66,67,68,69. Vårt lättimplementerade och anpassningsbara system ger en prisvärd installation till mindre laboratorier som har för avsikt att genomföra sina egna specifika screeningprojekt inom dessa olika tillämpningsområden.

Disclosures

Vi har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar för den utmärkta tekniska hjälpen från supportpersonalen vid IBCS-BIP:s fiskanläggning och screeningcenter. Detta arbete har fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 under Grant Agreement No 965406 (PrecisionTox). Dessa uppgifter återspeglar endast författarnas uppfattning, och Europeiska unionen kan inte hållas ansvarig för hur informationen i den används.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm Sigma-Aldrich Z289744-1EA Or comparable material
High-speed camera XIMEA  MQ013MG-ON USB 3 
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap VWR 215-3261 Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL SARSTEDT 70.3010.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL SARSTEDT 70.3050.100 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL SARSTEDT 70.3020.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL SARSTEDT 70.3030.100 Or comparable material
Serological pipette 10 mL SARSTEDT 86.1254.001 Or comparable material
Serological pipette 25 mL SARSTEDT 86.1685.001 Or comparable material
Serological pipette 5 mL SARSTEDT 86.1253.001 Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) Greiner bio-one 628102 Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) SARSTEDT 83.3902.500 Or comparable material
Transfer pipette 6 mL SARSTEDT 86.1175 Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP SARSTEDT 62.554.502 Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP SARSTEDT 62.5472.54 Or comparable material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  4. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  5. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2013).
  6. OECD. Test No. 250: EASZY assay - Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2021).
  7. Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
  8. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
  9. Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
  10. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  11. Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
  12. Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
  13. Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
  14. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
  15. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
  16. Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
  17. Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
  18. Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
  19. Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
  20. Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
  21. van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
  22. Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
  23. Marcato, D. Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , Karlsruhe Institute of Technology. https://publikationen.bibliothek.kit.edu/1000085054 (2018).
  24. PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
  25. Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish - A Practical Approach. , Oxford University Press, Oxford. (2002).
  26. Preisach, C. hristine, Burkhardt, H. ans, Schmidt-Thieme, L. ars, Decker, R. einhold Data Analysis, Machine Learning and Applications. , Springer Berlin, Heidelberg. (2008).
  27. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
  28. Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
  29. Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
  30. Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
  31. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
  32. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  33. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
  34. Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
  35. Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
  36. Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
  37. Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
  38. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  39. Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
  40. Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
  41. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
  42. Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
  43. Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
  44. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
  45. Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
  46. Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
  47. Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
  48. Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
  49. Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
  50. Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
  51. Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
  52. Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
  53. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2019).
  54. Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
  55. Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
  56. van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
  57. van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
  58. Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
  59. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  60. Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
  61. Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
  62. Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
  63. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  64. Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
  65. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  66. Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
  67. Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
  68. Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
  69. Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 203
Utvärdering av kemikaliers toxicitet med hjälp av ett screeningsystem för zebrafiskvibrationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von… More

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von Clausbruch, C. A., Pace, G., Strähle, U., Colbourne, J. K., Pylatiuk, C., Peravali, R., Weiss, C., Scholz, S., Dickmeis, T. Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System. J. Vis. Exp. (203), e66153, doi:10.3791/66153 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter