Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66153
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 4, 5, 1, 1, 6, 1
1Institute of Biological and Chemical Systems - Biological Information Processing, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 2DITABIS AG - Digital Biomedical Imaging Systems AG, 3Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 4School of Biosciences, University of Birmingham, 5Institute for Automation and Applied Informatics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 6Department of Bioanalytical Ecotoxicology, Helmholtz-Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

אנו מתארים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים של מערכת סינון להערכת רעילות של תרכובות כימיות בהתבסס על תגובת הבהלה של רטט עובר דג הזברה. המערכת מתעדת את תנועותיהם של עוברי דגי זברה בחשיפה לגירוי רטט ומאפשרת הערכה משולבת של רעילות/קטלניות כללית ורעילות עצבית-שרירית.

Abstract

פיתחנו מערכת סינון פשוטה להערכת רעילות עצבית-שרירית וכללית בעוברים של דגי זברה. המערכת המודולרית מורכבת ממתמרים אלקטרודינמיים שמעליהם ניתן להניח צלחות תרבית רקמה עם עוברים. ניתן לשלב מספר זוגות כאלה של תרבית רקמת רמקול. גירויי רטט הנוצרים על ידי המתמרים האלקטרודינמיים גורמים לתגובת בהלה ובריחה אופיינית בעוברים. כונן ליניארי מונע חגורה מציב ברצף מצלמה מעל כל רמקול כדי להקליט את תנועת העוברים. בדרך זו, שינויים בתגובת הבהלה עקב קטלניות או רעילות עצבית-שרירית של תרכובות כימיות ניתן לדמיין ולכמת. אנו מציגים דוגמה לזרימת העבודה לבדיקת תרכובות כימיות באמצעות מערכת זו, כולל הכנת עוברים ופתרונות טיפול, הפעלת מערכת הרישום וניתוח נתונים לחישוב ערכי ריכוז אמת מידה של תרכובות הפעילות בבדיקה. ההרכבה המודולרית המבוססת על רכיבים פשוטים הזמינים מסחרית הופכת מערכת זו לחסכונית וגמישה להתאמה לצרכים של תצורות מעבדה מסוימות ולמטרות סינון.

Introduction

בשנים האחרונות, דגי זברה הפכו לאורגניזמי מודל פופולריים ביותר להערכת השפעות של תרכובות כימיות, המקיפים תחומי מחקר מפיתוח תרופות ועד טוקסיקולוגיה סביבתית1. כבעלי חוליות, דגי זברה חולקים היבטים רבים של המבנה הגנטי שלהם והפיזיולוגיה הכללית שלהם עם בני אדם 2,3. לכן, התוצאות המתקבלות במודל זה לעתים קרובות רלוונטיות ישירות לבריאות האדם. מספר תרופות מועמדות שנמצאות כעת בניסויים קליניים זוהו במסכים מורכבים באמצעות דגי זברה4.

הערכת רעילות היא יישום מרכזי אחד שבו בדיקות באמצעות שלבים עובריים של דגי זברה מעניינות. קיימות הנחיות בדיקה שונות של הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי (OECD) לשימוש בדגי זברה בבדיקות רעילות סביבתית 5,6. גודלם הקטן וההתפתחות המהירה של עוברי דגי זברה הופכים אותם למתאימים מאוד לגישות סינון בסולם תפוקה בינוני עד גבוה 1,3,4. נקודות קצה טוקסיקולוגיות הממוקדות על ידי מסכים כאלה כוללות מומים עובריים וקטלניות7, הפרעה אנדוקרינית8, רעילות איברים9, והערכות התנהגותיות המעידות על רעילות עצבית10,11. הבדיקות ההתנהגותיות אפשריות מכיוון שעוברים של דגי זברה מראים סוגים שונים של תגובות מוטוריות לגירויים שונים בהתאם לשלב התפתחותם. לדוגמה, עוברים של יום אחד לאחר ההפריה (dpf) מראים סלילת זנב ספונטנית12 ומגיבים לרצף של פולסי אור ברצף אופייני של תנועות, מה שמכונה תגובה פוטומוטורית (PMR)10. לאחר הבקיעה, המתרחשת בדרך כלל בסביבות 48-72 שעות לאחר ההפריה (hpf), עוברי Eleutheroembryos13 השוחים בחופשיות מפתחים בהדרגה תגובות בהלה ובריחה לגירויי רטט החל מסביבות 4 dpf14. תגובות אלה מאופיינות בכיפוף ייחודי לכיוון ההפוך לכיוון הגירוי (מה שנקרא C-bend או C-start), ואחריו כיפוף נגדי קטן יותר והתנהגות שחייה 14,15,16,17. יש לציין כי התנהגויות עובריות נשלטות על ידי מעגלים עצביים המשתמשים במערכות נוירוטרנסמיטרים שונות, מה שמאפשר לחקור השפעות של תרכובות כימיות המכוונות למערכות אלה. לדוגמה, בדיקת PMR חשפה את ההשפעות של תרכובות המפריעות לאיתות כולינרגי, אדרנרגי ודופמינרגי10, בעוד שתגובת הבהלה כוללת נוירונים כולינרגיים, גלוטמטרגיים וגליצינרגיים 16,18. יתר על כן, תרכובות הפוגעות בשרירים או בממשק העצבי-שרירי ישפיעו גם הן על התנהגויות אלה, כמו גם תרכובות רעילות לתאי השערה באוזן הפנימית/לרוחב19,20. התבוננות בהתנהגות המוטורית של דגי הזברה בתגובה לגירוי היא אפוא אמצעי מתאים להעריך לא רק רעילות עצבית אלא אוטוטוקסיות ומיוטוקסיות באותה מידה. ניקוד התנהגות מוטורית משמש גם כפרוקסי להערכת רעילות/קטלניות כללית מכיוון שעוברים מתים אינם זזים. לפיכך, התנהגויות תנועה עובריות מייצגות קריאה אינטגרטיבית לגישת בדיקת רעילות מהשורה הראשונה, המצביעה על השפעות קטלניות ותרכובות עצביות-שריריות במערך אחד. בהתחשב בכך eleutheroembryos כבר מסוגלים מטבוליזם תרכובות, הגישה עשויה גם לזהות את ההשפעות של תוצרי טרנספורמציה מטבולית 7,21,22. חשוב לציין, עוברים של דגי זברה אינם נחשבים לשלב החיים המוגנים על פי חלק מהחוקים להגנה על בעלי חיים עד לשלב ההזנה החופשית לאחר 120 HPF13. לכן, הם נחשבים כחלופה לניסויים רעילים בבעלי חיים.

Figure 1
איור 1: הגדרת מערכת תגובת בהלה לרטט. (A) סקירה כללית של המערכת. צלחות עם עוברים שנחשפו לתרכובות הבדיקה ממוקמות על מערך המתמרים האלקטרודינמיים ("רמקולים"). המצלמה מועברת ברצף על ידי הכונן הליניארי מונחה החגורה למצב ההקלטה מעל מתמר המטרה. (B) תצוגה מפורטת של המתמר/רמקול עם צלחת תרבית רקמות מוכנסת למעלה. הלוחות מוארים מלמטה על ידי יריעת תאורת לד ב 4000-5000 לוקס. נורית LED ליד הרמקול נדלקת בזמן שהגירוי ניתן. (C) תמונת סטילס של וידאו שהוקלט על-ידי המצלמה בעת גירוי העוברים. (D) צילום מסך של קובץ התצורה. (ה) צילום מסך של ממשק תוכנת ההקלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול בדיקה להערכת השפעות מורכבות על תגובת בהלת הרטט באמצעות מכשיר בדיקה פשוט פנימי המבוסס על גירויי רטט שנוצרו על ידי מתמרים אלקטרודינמיים יחד עם הקלטת וידאו אוטומטית של מספר עוברים הנעים בחופשיות בצלחת תרבית רקמה23. המערכת מודולרית ומאפשרת הקלטה רציפה ממספר צלחות תרבית רקמה במקביל. במערך שנמצא בשימוש כיום, חמישה מתמרים אלקטרודינמיים מספקים גירוי רטט (500 הרץ, משך 1 אלפיות השנייה) לצלחות תרבית רקמה המכילות 20 עוברים שמונחים מעליהם (איור 1). הלוחות מוארים מלמטה ב 4000-5000 לוקס עם יריעות אור LED. נורת LED ליד כל מתמר מציינת תקופות של הפעלת גירוי, ואוסילוסקופ מציין צורות גל ותדירות הגירוי המופעל (לפרטים, ראה מקור 23). התנהגות העוברים נרשמת על ידי מצלמה במהירות גבוהה (טבלה של חומרים) ב 1000 פריימים לשנייה (fps), אשר מועבר מעל הרמקול היעד על ידי כונן ליניארי מונע חגורה. מהירות הקלטה זו נדרשת כדי לפתור באופן אמין את תגובת הבהלה. המערכת מספקת חלופה זולה וניתנת להתאמה אישית למערכות המסחריות הנוכחיות. תהליך העבודה המדויק המפורט להלן מבוצע כיום במסגרת יוזמת Precision Toxicology24 על מנת לקבוע תנאי חשיפה מתאימים לאיסוף נתוני OMICS מעוברים של דגי זברה שטופלו בקבוצה נבחרת של רעלים.

Protocol

כל הגידול והטיפול בדגי זברה בוצעו בהתאם לתקנים הגרמניים להגנה על בעלי חיים ואושרו על ידי ממשלת באדן-וירטמברג, Regierungspräsidium Karlsruhe, גרמניה (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).

1. הכנת תמיסות מלאי של כימיקלים לבדיקה

  1. תייגו את בקבוקון הזכוכית (או האליקוט הכימי) עם שם התרכובת/קיצור, ריכוז המלאי ותאריך ההכנה. לדוגמה, CdCl2_2.5 גרם· L-1_210813.
  2. צנטריפוגה את aliquot כימי ב 2000 x גרם במשך 1 דקה בטמפרטורת החדר (RT).
  3. מתחת למכסה אדים, שוקלים את התרכובת (במידת הצורך) על סולם רגיש ל-0.001 גרם ומעבירים אותה לבקבוקון המסומן. אם התרכובת היא נוזל, מוסיפים אותה לבקבוקון באמצעות פיפטה וקצה פיפטה מפלסטיק.
    הערה: לדוגמה, עבור מלאי הטריקאין מתאן-סולפונט ששימש בדוגמת התוצאה שמוצגת באיור 2, 400 מ"ג נשקלו לתוך הבקבוקון המסומן.
  4. הוסיפו ממס (למשל, מים טהורים סטריליים או דימתיל סולפוקסיד (DMSO), בהתאם לתכונות הפיזיקוכימיות של התרכובות) באמצעות פיפטה וקצה פיפטה מפלסטיק. במידת האפשר, מים הם הממס המועדף.
    הערה: לדוגמה, עבור מלאי טריקאין, פתרון 15.3 mM ב 100 מ"ל מים הוכנה.
  5. אוטמים את הבקבוקון, מנערים בעדינות ובודקים משקעים.
  6. הכינו תמיסות מלאי מדוללות (במידת הצורך) בבקבוקוני זכוכית באמצעות פיפטות וקצוות פיפטה מפלסטיק.
    הערה: לדוגמה, לא היה צורך בדילול נוסף עבור מלאי הטריקאין.
  7. אחסנו את תמיסות המלאי בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  8. לאחסן את aliquot הכימי הנותר באותם תנאים כמו קודם.
  9. רשום מידע על מלאי aliquot במחברת המעבדה.

2. איסוף וגידול עוברים של דגי זברה

  1. לאסוף עוברים בשלבי מחשוף (שלב 2-8 תאים) מהשרצה טבעית של הזדווגויות קבוצתיות בצלחות תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ.
  2. בחרו אצווה באיכות מתאימה: פחות מ-10% ביצים לא מופרות/מתות.
  3. נקו את הכלים (הוציאו ביצים לא מופרות, פסולת, קשקשים וכו').
  4. מניחים 60 עוברים לכל צלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ ב-15 מ"ל של E3 בינוני (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)25.
  5. הכניסו כלים לתא לח שהוכנו על ידי פריסת מגבות נייר ספוגות במים.
  6. יש לגדל עוברים עד 72 HPF באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.

3. הכנת דילול עובד של כימיקלים לבדיקה

  1. הוציאו את תמיסת המלאי מהמקפיא בטמפרטורה של -20°C ותנו לה להפשיר.
  2. אם מסיסות התרכובת גבוהה מספיק, הכינו דילולים סדרתיים בתווך E3 בבקבוקי זכוכית, 1 מ"ל לכל שכפול לכל ריכוז. יש לוודא שהריכוז גבוה פי 10 מריכוז החשיפה הרצוי. כך נמנע הצורך לשנות את כל התווך של העוברים בתחילת החשיפה. במקרה של מסיסות נמוכה, הכינו את הדילולים הטוריים ישירות בריכוזי החשיפה הרצויים, 10 מ"ל לשכפול לריכוז.
  3. בדוק משקעים (במידת הצורך). אם הפתרון זירז, לרשום את זה, ולאחר מכן לדלל עוד יותר כדי להשיג את הריכוז הגבוה הבא. בדוק שוב אם יש משקעים. חזור על הפעולה עד שאין משקעים.
  4. בדוק את ה- pH של תמיסת החשיפה. אם אתם מחוץ לטווח של pH 7.0-8.5, רשמו זאת, והכינו את התמיסות ב-E3 המכילות 5 mM HEPES/pH 7.4, תוך התאמת ה-pH עם HCl או NaOH.
  5. יש להשליך חומרי חשיפה שאינם בשימוש בהתאם לתקנות המקומיות.

4. חשיפת עוברים לכימיקלים שייבדקו

  1. בדוק את הכלים עם 72 עוברים ישנים HPF עבור עוברים מתים / לא בקעו ולהסיר אותם. אם אצווה של עוברים מכילה יותר מ -5% של ביצים שלא בקעו, להסיר את האצווה.
  2. מניחים 10 עוברים לכל צלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ ב-9 מ"ל של מדיום E3 (צלחת חשיפה).
  3. תייגו לוחות חשיפה עם שם התרכובת, ריכוז החשיפה ומספר ההעתקה. לדוגמה, "CdCl2 1 mg· L-1 01". כלול מספיק לוחות E3 בלבד ולוח בקרה ממס, במידת הצורך (ראה סעיף 5).
  4. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חשיפה לכל צלחת, החל מהריכוז הנמוך ביותר, וסובב את הצלחת. עבור תרכובות עם מסיסות נמוכה, החלף את כל 10 מ"ל הצלחת בתמיסת החשיפה (ראה שלב 3.2).
  5. רשום את הסדר הזמני שבו נוספו תמיסות מורכבות לעוברים.
  6. לדגור את הלוחות בתא לח באינקובטור ב 28.5 ° C במשך 48 שעות עד שהם מגיעים 120 hpf.

5. ביצוע בדיקת בהלת הרטט

הערה: נתח את הלוחות באותו סדר שבו נרשם בשלב 4.5. כל ריצה צריכה לכלול לוחית בקרה E3.

  1. הפעל את המחשב ואת התקן הרטט (נורית LED כחולה אמורה להיות דולקת).
  2. הכן את קובץ התצורה בגיליון אלקטרוני, כפי שניתן לראות באיור 1D ומצורף כקובץ משלים 1. רשום נתוני חשיפה עבור כל אחד מחמשת מיקומי הלוחות (תרכובת, ריכוז, שכפול).
  3. פתח את התוכנית ממשק משתמש כללי (GUI) (זמין בכתובת https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , מזהה פרוייקט 43215.)
  4. בדוק את תנועת המצלמה על ידי בחירת המיקומים השונים בתוכנית ממשק המשתמש הגרפי והתבוננות בתנועת המצלמה.
  5. הוציאו את לוחות הדגימה שיימדדו מהאינקובטור. הניחו את לוחות הדגימה על 5 המיקומים (ראו איור 1A, "רמקולים") והניחו לעוברים לשקוע במשך מספר דקות.
  6. לחץ על הקלט; ייפתח חלון לבחירת קובץ התצורה.
  7. בחר את קובץ התצורה המתאים שהוכן בשלב 5.2 עבור הפעלה זו.
  8. בדוק שתיאור המדגם תואם את הדגימות בכל מיקום (1-5).
  9. המדידה תתבצע באופן אוטומטי (10 שניות / מיקום). כאשר דופק הקול מוחל על ידי התוכנית, נורית מופעלת . הקלטה של 10 שניות לתנוחה מאפשרת להשיג מספיק נתונים כדי להעריך את מהירות השחייה ואת המרחק שעבר לפני ואחרי הפעלת הגירוי ומונעת התרגלות לגירויים הבאים.
  10. כאשר ההקלטה הושלמה, המצלמה חוזרת למצב 1 והתוכנה מתחילה לדחוס את הקבצים. במהלך תקופה זו, החלף את הדגימות בקבוצה הבאה שיש למדוד.
  11. עבור לשלב 5.2. כדי להקליט את הריצה הבאה.
  12. לאחר שכל הצלחות נמדדו, אספו את פתרונות החשיפה. השתמש במסננת כדי לשמור על העוברים.
  13. הרדימו את העוברים על ידי צינה מהירה באמבט קרח/איזופרופנול (5%).
  14. יש להיפטר מתמיסות החשיפה ומהעוברים המתים בהתאם לתקנות המקומיות.

6. ניתוח נתונים

  1. פתח את נתוני הווידאו באמצעות VirtualDub (1.10.4).
  2. סקור חזותית את מספר העוברים המגיבים לפולס הקול (כאשר נורית הבקרה דולקת).
  3. הזן נתונים בגיליון אלקטרוני. רשמו את שם התרכובת, את השכפול, את ריכוז התרכובת ואת אחוז העוברים חסרי התנועה בהתאם לתבנית המופיעה בקובץ משלים 2, הכולל את מערך הנתונים לדוגמה המוצג באיור 2C.
    הערה: לתבנית מבנה גמיש והיא מאפשרת בעיקר יישום נתונים של אורגניזמים אחרים ונקודות קצה. הוא מתאר את התגובות עבור כל ריכוז ומספק גם תיאורים של נקודות קצה, כמו גם הגדרות של הפרמטרים שנוצרו במידול תגובת הריכוז שלאחר מכן.
  4. בצע את ניתוח ריכוז הביצועים (BMC) באמצעות זרימת עבודה של KNIME (ניתוח KNIME 4.626) עם סקריפטים מוטבעים R (R גרסה 3.6., R-packages plotrix, drc ו- bmd 27,28).
    הערה: באופן עקרוני, ההערכה יכולה להתבצע גם ישירות ב-R. עם זאת, מטעמי נוחות וכדי לאפשר הערכה כשירות מבוסס אינטרנט, הניתוח אורגן בזרימת עבודה תואמת שרת KNIME. הפלט של זרימת העבודה של KNIME מסופק בקובץ משלים 3. לקבלת פרטים על הפרמטרים הסטטיסטיים שנוצרו על-ידי זרימת העבודה של KNIME, עיין בתבנית זו. הפרמטרים הסטטיסטיים להערכת מידת ההתאמה ותנאי הסף לקבלת ערכי BMC שנקבעו מוצגים בטבלה 1. זרימת העבודה של KNIME עצמה זמינה דרך GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). תגובת הריכוז מעוצבת באמצעות מודל לוגיסטי לוג-לוגיסטי בן 4 פרמטרים. ניתן לתקן שניים מהפרמטרים של התאמת העקומה. בדרך כלל, אחד יתקן את המקסימום ל -100 במקרה של נתוני אחוזים. במקרה שלא נצפו תופעות רקע, ניתן לתקן את המינימום ל -0%.

Representative Results

איור 2A מראה את אחוז העוברים חסרי התנועה ב-48 זוגות של עוברים פראיים לא מטופלים (זן AB2O2). בממוצע, 14.33% מהעוברים מסוג בר לא מטופלים אינם מגיבים לגירוי הרטט. ב-4 מצמדים אחוז הזחלים הלא תנועתיים הגיע ל-50%, אך ב-75% מהזחלים חסרי התנועה אחוז הזחלים הלא תנועתיים היה נמוך מ-20%.

איור 2B,C מציג דוגמה לחישוב טיפוסי של ריכוז/מינון אמת מידה (BMC/BMD29,30) עבור השפעות מורכבות על תנועתיות עם זרימת העבודה של בדיקת בהלת רטט, כפי שמבוצע כעת בקונסורציוםPrecisionTox 24. ערכי BMC10, BMC25 ו-BMC50 תואמים לריכוזים שבהם 10%, 25% ו-50% מהעוברים מראים רמות חוסר תנועתיות גבוהות יותר מהרקע, בהתאמה. רק עוברים חסרי תנועה לחלוטין נכללים בחישוב הזה, לא אלה שעדיין מראים תגובות חלקיות, כמו למשל רק כיפוף C ללא שחיית בריחה לאחר מכן או רק תנועות זנב (איור 2B). העוברים נחשפו ל-8 ריכוזים של מעכב תעלת הנתרן טריקאין מתאן-סולפונט, המשמש לעתים קרובות להרדמת דגים31. הנתונים מצביעים על רמת רקע של כ-25% חוסר תנועתיות בתגובה לגירוי הרטט. החל מ 1% tricaine, תנועתיות מופחתת ולאחר מכן מפסיק מעל 2.5%. תהליך העבודה של KNIME מחשב את BMC50 כ-164.9 מיקרומטר, המתאים ל-1.07% טריקאין ולרמת חוסר תנועתיות של 75% (איור 2C). מרווחי בר-סמך קטנים של 95% (מסומנים על ידי הגוונים האפורים בעקומה) מצביעים על יכולת שחזור איתנה של ערכי התנועתיות בבדיקה זו.

איור 2D מציג דוגמה לריצת בדיקה תת-אופטימלית, שאין להשתמש בנתונים שלה לחישובי BMC. מוצגות חמש קבוצות ביקורת שטופלו ב-E3 עם עוברים שונים שמקורם באותו מצמד (AB2O2 [זן מסוג פרא] משכפל 1-5). רק הקבוצה הראשונה הראתה תגובה כמעט נורמלית, והראתה חוסר תנועתיות של כ-25% שעולה בקנה אחד עם ערכי ספרות32 ואלה שהתקבלו בבדיקה המתוארת כאן, כפי שמוצג באיור 2A, בעוד שכל שאר הקבוצות מראות תגובות התנהגותיות מופחתות ו/או חלקיות (למשל, מראה רק כיפוף C שלא מלווה בפעילות שחייה, או תנועתיות ללא כיפוף C ברור בהתחלה). תגובה כזו עלולה להתרחש כאשר העוברים אינם מתפתחים כראוי ונמצאים במצב לא בשל עקב עיכוב התפתחותי, המשפיע על חוסנה של תגובת הבהלה14,33.

Figure 2
איור 2: דוגמה לתוצאה טיפוסית, כולל חישוב מינון אמות מידה. (A) אחוז העוברים שאינם מגיבים לאחר דופק הקול עבור זחלים לא מטופלים מסוג בר עבור 48 מצמדים (n = 10 לכל מצמד). הממוצע (14.33%) וסטיית התקן (±16.19%) מסומנים באדום. (B) הערכת התנהגות תגובת הבהלה של עוברים (n=20 לכל מצב) שטופלו בריכוז המצוין של טריקאין בתווך E3 או ב-E3 בלבד כביקורת. ההתנהגות מסווגת לפי ערכת הצבעים והקריקטורות המצוינות מימין לגרף, כאשר כל עובר מוקצה רק לאחד מהסוגים הבאים: "בלתי ניתן לתנועה": העובר אינו מראה כל תנועה; "זנב זז": העובר מראה תנועת זנב, אך לא כיפוף C ולא התנהגות שחייה; "תנועתי": העובר מראה תנועת שחייה, אך ללא כיפוף C בתגובה לגירוי הרטט; "C-bend only": העובר מראה C-bend, אבל לא לברוח משחייה; "C-bend + motile": העובר מראה התנהגות אופיינית לכיפוף C ואחריה שחיית בריחה (תגובת הבהלה המלאה האופיינית). ההתנהגויות השונות מוצגות כאחוז מכלל העוברים בכל טיפול. (C) גרף חישוב BMC שנוצר על ידי תהליך העבודה של KNIME, המציין את אחוז העוברים "הבלתי נעים" עבור כל ריכוז טיפול. קווים כחולים, אדומים ושחורים מציינים את הערכים BMC10, BMC25 ו-BMC50, כלומר הריכוזים שבהם 10%, 25% ו-50% מהעוברים מראים רמות חוסר תנועתיות גבוהות יותר מהרקע, בהתאמה. (ד) דוגמה להפעלת בדיקה שנמחקה. מוצגות חמש ריצות בקרה שטופלו ב-E3 עם עוברים שונים מסוג AB2O2 שמקורם באותו מצמד (משוכפלים 1-5). רק שכפול 1 מראה תגובה כמעט נורמלית, בעוד שהעוברים של שאר הריצות אינם מראים את תגובת השחייה האופיינית לכיפוף C + בריחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פרמטרים סטטיסטיים להערכת מידת ההתאמה ותנאי הסף לקבלת ערכי BMC שנקבעו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: מאפיינים של מבחר מערכות בדיקת תגובת בהלה רטט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: תבנית Excel עבור קובץ תצורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: תבנית קלט KNIME עם ערכת נתונים לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: דוגמה לקובץ פלט KNIME. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

אנו מציגים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים להערכת תרכובת כימית באמצעות מערך בדיקת בהלה של רטט עובר של דג זברה שנבנה בהתאמה אישית. זרימת העבודה מפיקה נתונים חזקים המאפשרים חישוב של פרמטרים אופייניים המציינים רעילות מורכבת, כגון ריכוז/מינון אמת מידה (BMC/BMD). המודולריות של ההתקנה מאפשרת התאמה לצרכים שונים של תפוקה ודרישות מקום. מכיוון שהמערכת עשויה מרכיבים בסיסיים זולים, לאחר התקנה פשוטה יחסית, היא מספקת אלטרנטיבה זולה למערכות מסחריות קיימות, המתוכננות בדרך כלל למספר סוגי בדיקות בבת אחת, מסתמכות על תוכנה קניינית ונשארות יקרות יחסית.

הן מערכות מסחריות אלה והן מערכות מותאמות אישית אחרות מאפשרות הערכה של עוברים בודדים או זחלים בלוחות מרובי בארות (למשל, 12-באר34, 16-באר32,35, 24-באר 20,33,36, 48-באר37, 96-באר 38,39,40,41,42 ואפילו באר 384 [כבאר 4x96]43), אבל ההגבלה המרחבית בבארות הופכת את הניתוח של כמה פרמטרים נתונים של תגובת המילוט (למשל, מרחק נסיעה) למאתגר יותר. יתר על כן, בחלק מהמערכים הללו, ההדמיה מוגבלת לתת-קבוצה של בארות הצלחת, מה שמקטין את התפוקה 36,39. הדמיה של עוברים בצלחות מאפשרת הערכה טובה יותר של פרמטרים של תגובת בריחה ומאפשרת רישום התנהגות של מספר עוברים בבת אחת (עד 30 בצלחת של 6 ס"מ, למשל). בדרך כלל, הדמיה מבוססת צלחת מוגבלת למנה אחת לכל ריצה 44,45,46,47,48 (חריגים מבצעים הדמיה במקביל על 6 מנות עם זחל אחד כל49 או על 4 זחלים ב 2 כלים מפוצלים50), חסרון שניתן לפתור על ידי עיצובים מקבילים כמו במקרה שלנו. סיכמנו כמה מאפיינים של המערכת ששימשה במחקר זה ובפתרונות מסחריים ומותאמים אישית אחרים בטבלה 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.

אחד היתרונות של השיטה הוא קריאה הלוכדת הן קטלניות והן שינויים התנהגותיים, אשר יכולים להגביר את הביצועים של הערכות רעילות. לדוגמה, בעוד שבדיקת רעילות חריפה של עובר דג זברה (FET)5 הוכחה כמנבאת רעילות בבדיקת רעילות חריפה של דג בוגר53 די טוב, דיוק החיזוי שלה השתפר על ידי הכללת קריאות התנהגותיות54. הסיבה לכך היא התמותה החלשה הנגרמת על ידי תרכובות נוירואקטיביות הנראות בעוברי דגים, כנראה בשל היעדר תסמונת הכשל הנשימתי הגורמת לרעילות מוגברת בדגים צעירים או בוגרים. עם זאת, ניתן לזהות נוירואקטיביות על ידי הערכת התנהגות. יתר על כן, קריאות התנהגותיות יכולות גם ללכוד השפעות מיוטוקסיות ואוטוטוקסיות, כמו גם השפעות רעילות אחרות, עדינות יותר, על הפיזיולוגיה, שהן תת-קטלניות אך משפיעות על הביצועים ההתנהגותיים של האורגניזם.

בעת ביצוע הבדיקה, קריטי להבטיח טיפול נכון בתרכובות, כמו גם שימוש באצווה מתפתחת הומוגנית של עוברי דגי זברה. לפיכך, שימוש בבקבוקוני זכוכית לאחסון תרכובות אמור למזער את הירידה בריכוזי כימיקלים, בעיקר תרכובות הידרופוביות, עקב ספיגה לחומר פלסטי. במקרה של תרכובות בעלות פוטנציאל ספיגה גבוה לפוליסטירן "פלסטיק", ניתן להשתמש גם בלוחות זכוכית לדגירה. ניקוי הביציות בצלחות תרבית הרקמה המשמשות לאיסוף והוצאת עוברים מתים הוא צעד קריטי להבטחת התפתחות תקינה. מהירות התפתחות תקינה חשובה, שכן עיכובים התפתחותיים עשויים להשפיע על בשלות הרשתות העצביות העומדות בבסיס ההתנהגות המוערכת14,33. כמו כן, כדי לאפשר השוואה של השפעות מורכבות, ביצים צריכות להיות מופקות מאותו זן שכן זנים שונים דווחו להציג פרופילים התנהגותיים שונים 38,55,56,57. במהלך החשיפה, חשוב לדגור על העוברים בתא לח על מנת למנוע אידוי יתר של תווך E3, אשר ישנה את הריכוזים הנבדקים.

יש לשלב בקרות E3 בכל ריצה על מנת לקבוע את רמת התגובה הבסיסית של קבוצת העוברים המסוימת המשמשת בסדרת הבדיקה. בדרך כלל, אנו מריצים צלחת אחת של פקדים לאורך כל קבוצה של 5 מדידות. כפי שמודגם באיור 2D, גישה זו מאפשרת גם זיהוי של אצוות עם תגובות תת-אופטימליות עקב עיכוב בהתפתחות או מסיבות אחרות, כגון השפעות רקע גנטיות. במקרה של חוסר תגובה בלתי צפוי לגירוי, היזהרו גם מכשל מתמר פוטנציאלי. בדרך כלל, תגובות הבהלה מראות התנהגות סיגמואידלית של ריכוז-תגובה המאפשרת התאמת עקומה באמצעות מודל לוגיסטי-לוג. עם זאת, במקרים נדירים עם תגובות דו-פאזיות, ייתכן שיהיה צורך להשתמש במודלים אחרים, כגון מודלים של גאוס או סידרגרין. הם זמינים בחבילות R drc ו- bdm27,28.

חוסר התגובה לגירוי הרטט עשוי להצביע פשוט על מוות של העוברים או על תפקודי חיים לקויים חמורים עקב ציטוטוקסיות כללית, אך עשוי גם לשקף רעילות ספציפית יותר המכוונת למעגלים עצביים של תפיסת גירוי, אינטגרציה ופלט מוטורי. השפעות מורכבות אפשריות אחרות הן הפרעה לממשק העצבי-שרירי או למבנה השרירים ולתפקודם. כדי להבחין בין האפשרויות הללו, יש צורך בבדיקות נוספות. לדוגמה, ניתן להעריך את השלמות המבנית של השרירים באמצעות בדיקת birefringency58,59, וקווים טרנסגניים זמינים להערכת תפקוד שרירי ועצבי60,61. עם זאת, נתוני הווידאו המוקלטים כבר מאפשרים ניתוח מפורט יותר של המורפולוגיה והתגובה ההתנהגותית של העוברים שיכולים לספק מידע נוסף ראשון. האם רק כיפוף C נפגע, או כל תנועתיות? האם עדיין קיימים שרידים של פעילות עצבית-שרירית, כפי שמעידים תנועות זנב חלשות או רועדות? האם התנהגויות משתנות כאלה הולכות יחד עם שינויים במורפולוגיה, כגון בצקת או עקמומיות גוף מוגברת? בנוסף, ניתן להעריך פרמטרים כגון זמן ההשהיה עד לכיפוף C או המרחק שעבר במהלך תגובת המילוט (ראו, למשל, הערה 44).

פרוטוקול הסינון המתואר כאן מאפשר הערכות רעילות מהירות וחזקות, עם הערך המוסף של זיהוי ספציפי של תרכובות נוירוטוקסיות לא קטלניות, אוטוטוקסיות ומיוטוקסיות. זרימת העבודה של הניתוח המסופקת קלה ליישום ומספקת קריאה חזקה. שינויים בפרוטוקולי הגירוי המשמשים בבדיקת בהלת הרטט שימשו לטיפול בהשפעות מורכבות גם על היבטים מורכבים יותר של התנהגות בהלה, כגון עיכוב דחף (PPI) 39,44 והרגלה32,33, וניתן להתאים אותם למערך הגירוי מבוסס המתמרים האלקטרודינמיים המשמש במחקר זה.

יישום עיקרי של מערכות סינון מבוססות תגובת בהלה הוא הערכת השפעות מורכבות במסכים כימיים, שהיא רלוונטית הן להערכת רעילות אנושית והן לפיתוח תרופות 1,4,62. יחד עם זאת, על ידי בדיקת שלבי החיים המוקדמים של אורגניזם ימי, התוצאות המתקבלות רלוונטיות ישירות להערכת סיכונים אקוטוקסיקולוגית 63,64. בנוסף, מערכות תגובת בהלה יכולות לשמש לפנוטיפ התנהגותי במסכים גנטיים 65,66,67,68,69. המערכת שלנו, הניתנת ליישום ולהתאמה בקלות, מספקת התקנה במחיר סביר למעבדות קטנות יותר המתכוונות לבצע פרויקטי סינון ספציפיים משלהן בתחומי יישום שונים אלה.

Disclosures

אין לנו מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לתודה על הסיוע הטכני המצוין של צוות התמיכה במתקן הדגים ומרכז ההקרנה של IBCS-BIP. עבודה זו קיבלה מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מספר 965406 (PrecisionTox). פלט זה משקף רק את עמדת המחברים, והאיחוד האירופי אינו יכול להיות אחראי לכל שימוש שעשוי להיעשות במידע הכלול בו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm Sigma-Aldrich Z289744-1EA Or comparable material
High-speed camera XIMEA  MQ013MG-ON USB 3 
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap VWR 215-3261 Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL SARSTEDT 70.3010.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL SARSTEDT 70.3050.100 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL SARSTEDT 70.3020.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL SARSTEDT 70.3030.100 Or comparable material
Serological pipette 10 mL SARSTEDT 86.1254.001 Or comparable material
Serological pipette 25 mL SARSTEDT 86.1685.001 Or comparable material
Serological pipette 5 mL SARSTEDT 86.1253.001 Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) Greiner bio-one 628102 Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) SARSTEDT 83.3902.500 Or comparable material
Transfer pipette 6 mL SARSTEDT 86.1175 Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP SARSTEDT 62.554.502 Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP SARSTEDT 62.5472.54 Or comparable material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  4. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  5. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2013).
  6. OECD. Test No. 250: EASZY assay - Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2021).
  7. Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
  8. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
  9. Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
  10. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  11. Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
  12. Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
  13. Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
  14. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
  15. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
  16. Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
  17. Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
  18. Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
  19. Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
  20. Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
  21. van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
  22. Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
  23. Marcato, D. Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , Karlsruhe Institute of Technology. https://publikationen.bibliothek.kit.edu/1000085054 (2018).
  24. PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
  25. Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish - A Practical Approach. , Oxford University Press, Oxford. (2002).
  26. Preisach, C. hristine, Burkhardt, H. ans, Schmidt-Thieme, L. ars, Decker, R. einhold Data Analysis, Machine Learning and Applications. , Springer Berlin, Heidelberg. (2008).
  27. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
  28. Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
  29. Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
  30. Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
  31. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
  32. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  33. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
  34. Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
  35. Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
  36. Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
  37. Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
  38. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  39. Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
  40. Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
  41. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
  42. Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
  43. Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
  44. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
  45. Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
  46. Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
  47. Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
  48. Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
  49. Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
  50. Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
  51. Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
  52. Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
  53. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2019).
  54. Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
  55. Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
  56. van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
  57. van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
  58. Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
  59. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  60. Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
  61. Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
  62. Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
  63. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  64. Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
  65. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  66. Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
  67. Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
  68. Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
  69. Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 203
הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von… More

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von Clausbruch, C. A., Pace, G., Strähle, U., Colbourne, J. K., Pylatiuk, C., Peravali, R., Weiss, C., Scholz, S., Dickmeis, T. Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System. J. Vis. Exp. (203), e66153, doi:10.3791/66153 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter