Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Evaluering av toksisitet av kjemikalier ved hjelp av et Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66153
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 4, 5, 1, 1, 6, 1
1Institute of Biological and Chemical Systems - Biological Information Processing, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 2DITABIS AG - Digital Biomedical Imaging Systems AG, 3Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 4School of Biosciences, University of Birmingham, 5Institute for Automation and Applied Informatics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 6Department of Bioanalytical Ecotoxicology, Helmholtz-Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

Vi beskriver et screeningsystems arbeidsflyt og dataanalyse for evaluering av kjemisk forbindelsestoksisitet basert på sebrafiskembryoens vibrasjonsrespons. Systemet registrerer bevegelsene til sebrafiskembryoer ved eksponering for vibrasjonsstimulus og muliggjør en integrert evaluering av generell toksisitet/dødelighet og nevromuskulær toksisitet.

Abstract

Vi utviklet et enkelt screeningsystem for evaluering av nevromuskulær og generell toksisitet i sebrafiskembryoer. Det modulære systemet består av elektrodynamiske transdusere, over hvilke vevskulturretter med embryoer kan plasseres. Flere slike høyhøyttaler-vevskulturparabolpar kan kombineres. Vibrasjonsstimuli generert av de elektrodynamiske transduserne induserer en karakteristisk skremme- og rømningsrespons i embryoene. En beltedrevet lineær stasjon plasserer sekvensielt et kamera over hver høyttaler for å registrere bevegelsen til embryoene. På denne måten kan endringer i skremmeresponsen på grunn av dødelighet eller nevromuskulær toksisitet av kjemiske forbindelser visualiseres og kvantifiseres. Vi presenterer et eksempel på arbeidsflyten for kjemisk sammensatt screening ved hjelp av dette systemet, inkludert fremstilling av embryoer og behandlingsløsninger, drift av registreringssystemet og dataanalyse for å beregne referansekonsentrasjonsverdier for forbindelser som er aktive i analysen. Den modulære monteringen basert på kommersielt tilgjengelige enkle komponenter gjør dette systemet både økonomisk og fleksibelt tilpasningsdyktig til behovene til bestemte laboratorieoppsett og screeningformål.

Introduction

I de senere år har sebrafisk blitt svært populære modellorganismer for evaluering av kjemiske sammensatte effekter, som omfatter forskningsområder fra legemiddelutvikling til miljøtoksikologi1. Som virveldyr deler sebrafisk mange aspekter av deres genetiske sminke og generelle fysiologi med mennesker 2,3. Derfor er resultater oppnådd i denne modellen ofte direkte relevante for menneskers helse. Flere legemiddelkandidater som for tiden er i kliniske studier har blitt identifisert i sammensatte skjermer ved bruk av sebrafisk4.

Toksisitetsvurdering er en stor applikasjon der tester med sebrafiskembryonale stadier er av interesse. Det finnes ulike testretningslinjer fra Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) for bruk av sebrafisk i testing av miljøgifter 5,6. Den lille størrelsen og raske utviklingen av sebrafiskembryoer gjør dem svært egnet for screeningtilnærminger på en middels til høy gjennomstrømningsskala 1,3,4. Toksikologiske endepunkter rettet mot slike skjermer inkluderer embryonale misdannelser og dødelighet7, hormonforstyrrelser8, organtoksisitet9 og atferdsvurderinger som indikerer nevral toksisitet10,11. Atferdsanalysene er mulige fordi sebrafiskembryoer viser ulike typer lokomotoriske responser på forskjellige stimuli avhengig av utviklingsstadiet. For eksempel viser 1 dag etter befruktning (dpf) embryoer spontan hale coiling12 og reagerer på en sekvens av lyspulser med en typisk sekvens av bevegelser, den såkalte fotomotoriske responsen (PMR) 10. Etter klekking, som vanligvis forekommer rundt 48-72 timer etter befruktning (hpf), utvikler de fritt svømmende eleutheroembryoene13 gradvis skremsel og unnslipper responser på vibrasjonsstimuli som starter rundt 4 dpf14. Disse responsene er preget av en særegen bøyning til retningen motsatt retning av stimulansen (den såkalte C-bend eller C-start), som etterfølges av en mindre motbøyning og svømmeoppførsel 14,15,16,17. Spesielt styres embryonal atferd av nevrale kretser ved hjelp av forskjellige nevrotransmittersystemer, noe som gjør det mulig å undersøke kjemiske sammensatte effekter rettet mot disse systemene. For eksempel avslørte PMR-analysen effekten av forbindelser som forstyrrer kolinerg, adrenerg og dopaminerg signalering10, mens skremmeresponsen involverer kolinerge, glutamaterge og glycinerge nevroner 16,18. Videre vil forbindelser som skader musklene eller det nevromuskulære grensesnittet også påvirke disse atferdene, og det samme vil forbindelser som er giftige for hårcellene i det indre øret / sidelinjen19,20. Observasjon av sebrafiskens lokomotoriske atferd som respons på en stimulus er derfor et egnet middel for å vurdere ikke bare nevrotoksisitet, men like ototoksisitet og myotoksisitet. Scoring lokomotorisk oppførsel fungerer også som en proxy for generell toksisitet / dødelighetsvurdering siden døde embryoer ikke beveger seg. Dermed representerer embryonal bevegelsesadferd en integrert avlesning for en første-tier toksisitetsscreening-tilnærming, som indikerer dødelige og nevromuskulære sammensatte effekter i ett oppsett. Gitt at eleutheroembryoene allerede er i stand til å metabolisere forbindelser, kan tilnærmingen også oppdage effekten av metabolske transformasjonsprodukter 7,21,22. Det er viktig at sebrafiskembryoer ikke anses som beskyttet livsstadium i henhold til noen dyrevernlovgivninger før stadiet med fri fôring etter 120 hpf13. Derfor betraktes de som et alternativ til testing av toksisitet hos dyr.

Figure 1
Figur 1: Oppsett av vibrasjonsskremmende responssystem. (A) Oversikt over systemet. Plater med embryoer utsatt for testforbindelsene plasseres på den elektrodynamiske transdusergruppen ("høyttalere"). Kameraet beveges sekvensielt av den beltedrevne lineære stasjonen til opptaksposisjonen over måltransduseren. (B) Detaljert visning av svingeren/høyttaleren med tallerkenen vevskultur satt inn på toppen. Platene belyses nedenfra av et LED-lysark på 4000-5000 lux. Et LED-lys ved siden av høyttaleren lyser mens stimulansen gis. (C) Stillbilde av video tatt opp av kameraet ved stimulering av embryoene. (D) Skjermbilde av konfigurasjonsfilen. (E) Skjermbilde av grensesnittet for innspillingsprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Her beskriver vi en testprotokoll for evaluering av sammensatte effekter på vibrasjonsskremmeresponsen ved hjelp av en intern konstruksjonsenkel testenhet basert på vibrasjonsstimuli generert av elektrodynamiske transdusere kombinert med et automatisert videoopptak av flere fritt bevegelige embryoer i en vevskulturskål23. Systemet er modulært og muliggjør sekvensiell registrering fra flere vevskulturskåler parallelt. I oppsettet som brukes i dag, gir fem elektrodynamiske transdusere en vibrasjonsstimulus (500 Hz, varighet 1 ms) til vevskulturskåler som inneholder 20 embryoer plassert på toppen av dem (figur 1). Platene er opplyst nedenfra ved 4000-5000 lux med LED-lysplater. Et LED-lys ved siden av hver svinger indikerer perioder med stimuluspåføring, og et oscilloskop indikerer bølgeformer og frekvens av den påførte stimulansen (for detaljer, se Ref. 23). Oppførselen til embryoene registreres av et høyhastighetskamera (materialfortegnelse) med 1000 bilder per sekund (fps), som beveges over målhøyttaleren av en beltedrevet lineær stasjon. Denne opptakshastigheten er nødvendig for å løse skremmeresponsen på en pålitelig måte. Systemet gir et rimelig, individuelt tilpasningsdyktig alternativ til dagens kommersielle systemer. Den nøyaktige arbeidsflyten som er beskrevet nedenfor, utføres for tiden innenfor rammen av Precision Toxicology initiative24 for å bestemme passende eksponeringsforhold for OMICS-datainnsamling fra sebrafiskembryoer behandlet med et utvalgt sett med toksiske stoffer.

Protocol

Alt sebrafiskhold og håndtering ble utført i samsvar med de tyske dyrevernstandardene og godkjent av regjeringen i Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Tyskland (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).

1. Klargjøring av stamløsninger av kjemikalier som skal testes

  1. Merk hetteglasset (eller kjemisk alikot) med forbindelsens navn/forkortelse, stamkonsentrasjon og tilberedningsdato. For eksempel CdCl2_2,5 g· L-1_210813.
  2. Sentrifuger den kjemiske alikoten ved 2000 x g i 1 min ved romtemperatur (RT).
  3. Under en avtrekkshette veier du forbindelsen (om nødvendig) på en vekt som er følsom for 0,001 g og overfører den til det merkede hetteglasset. Hvis forbindelsen er en væske, tilsett den til hetteglasset ved hjelp av en pipette og plastpipettespiss.
    MERK: For trikain metansulfonatstammen som ble brukt i resultateksemplet vist i figur 2, ble for eksempel 400 mg veid inn i det merkede hetteglasset.
  4. Tilsett løsningsmiddel (f.eks. sterilt rent vann eller dimetylsulfoksid (DMSO), avhengig av forbindelsenes fysisk-kjemiske egenskaper) ved hjelp av en pipette- og plastpipettespiss. Hvis det er mulig, er vann det foretrukne løsningsmidlet.
    MERK: For trikain ble det for eksempel fremstilt en 15,3 mM løsning i 100 ml vann.
  5. Forsegl hetteglasset, rist forsiktig og se etter nedbør.
  6. Forbered fortynnede stamløsninger (om nødvendig) i glassflasker ved hjelp av pipetter og plastpipettespisser.
    MERK: For eksempel var det ikke nødvendig med ytterligere fortynning for tricaine-stambenet.
  7. Oppbevar stamoppløsningen(e) ved -20 °C til bruk.
  8. Oppbevar den gjenværende kjemiske alikoten under samme forhold som før.
  9. Registrer lagerinformasjon i laboratorienotatblokken.

2. Innsamling og oppdrett av sebrafiskembryoer

  1. Samle embryoer i spaltningsstadier (2-8 celletrinn) fra naturlig gyting av gruppeparringer i 10 cm vevskulturretter.
  2. Velg et parti av passende kvalitet: mindre enn 10% ubefruktede/døde egg.
  3. Rengjør oppvasken (fjern unfertilized egg, rusk, skalaer, etc.).
  4. Plasser 60 embryoer per 10 cm vevskulturskål i 15 ml E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) 25.
  5. Plasser retter i et fuktet kammer tilberedt ved å legge ut papirhåndklær gjennomvåt med vann.
  6. Oppdra embryoer til 72 hpf i en inkubator ved 28,5 °C.

3. Forberedelse av arbeidsfortynning av kjemikalier som skal testes

  1. Ta stamoppløsningen ut av fryseren på -20 °C og la den tine.
  2. Hvis forbindelsesløseligheten er høy nok, tilbered serielle fortynninger i E3-medium i glassflasker, 1 ml per replikat per konsentrasjon. Sørg for at konsentrasjonen er 10 ganger høyere enn ønsket eksponeringskonsentrasjon. Dette unngår å måtte endre hele mediet av embryoene i begynnelsen av eksponeringen. Ved lav løselighet tilberedes seriefortynningene direkte ved ønskede eksponeringskonsentrasjoner, 10 ml per replikat per konsentrasjon.
  3. Sjekk for nedbør (om nødvendig). Hvis løsningen har utfelt, registrer dette, og fortynn deretter ytterligere for å oppnå nest høyeste konsentrasjon. Sjekk igjen for nedbør. Gjenta til det ikke er nedbør.
  4. Kontroller pH i eksponeringsoppløsningen. Hvis utenfor området pH 7,0-8,5, registrer dette, og klargjør løsningene i E3 som inneholder 5 mM HEPES / pH 7,4, juster pH med HCl eller NaOH.
  5. Kast ubrukte eksponeringsmedier i henhold til lokale forskrifter.

4. Utsette embryoer for kjemikaliene som skal testes

  1. Sjekk oppvasken med de 72 hpf gamle embryoene for døde / uklekkede embryoer og fjern dem. Hvis en gruppe embryoer inneholder mer enn 5% uklekkede egg, fjern batchen.
  2. Plasser 10 embryoer per 6 cm vevskulturfat i 9 ml E3 medium (eksponeringsplate).
  3. Merk eksponeringsplater med sammensatt navn, eksponeringskonsentrasjon og replikasjonsnummer. For eksempel "CdCl2 1 mg· L-1 01". Inkluder tilstrekkelige plater kun for E3 og en kontrollplate med løsemiddel om nødvendig (se avsnitt 5).
  4. Tilsett 1 ml eksponeringsløsning til hver plate, start med den laveste konsentrasjonen, og virvle platen. For forbindelser med lav løselighet, erstatt hele 10 ml av platen med eksponeringsløsningen (se trinn 3.2.)
  5. Registrer den tidsmessige rekkefølgen der sammensatte løsninger ble tilsatt embryoene.
  6. Inkuber platene i det fuktede kammeret i en inkubator ved 28,5 °C i 48 timer til de når 120 hpf.

5. Utføre vibrasjonsskremmeanalysen

MERK: Analyser platene i samme rekkefølge som registrert i trinn 4.5. Hver kjøring bør inneholde en E3-kontrollplate.

  1. Slå på datamaskinen og vibrasjonsenheten (blått LED-lys skal være på).
  2. Klargjør konfigurasjonsfilen i et regneark, som vist i figur 1D og vedlagt som tilleggsfil 1. Registrer eksponeringsinformasjon for hver av de 5 plateposisjonene (forbindelse, konsentrasjon, replikasjon).
  3. Åpne programmet for generelt brukergrensesnitt (GUI) (tilgjengelig på https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit, prosjekt-ID 43215.)
  4. Kontroller kamerabevegelsen ved å velge de forskjellige posisjonene i GUI-programmet og observere kamerabevegelser.
  5. Ta ut prøveplatene som skal måles fra inkubatoren. Plasser prøveplatene på de 5 posisjonene (se figur 1A, "høyttalere") og la embryoene slå seg ned i flere minutter.
  6. Klikk på Record; Et vindu åpnes for å velge konfigurasjonsfilen.
  7. Velg den aktuelle konfigurasjonsfilen som ble klargjort i trinn 5.2 for denne kjøringen.
  8. Sjekk at eksempelbeskrivelsen samsvarer med prøvene på hver posisjon (1–5).
  9. Måling vil bli utført automatisk (10 s / posisjon). Når lydpulsen brukes av programmet, slås en LED på. Opptak for 10 s / posisjon gjør det mulig å skaffe nok data til å estimere svømmehastighet og tilbakelagt avstand både før og etter at stimulansen er påført og forhindrer tilvenning til påfølgende stimuli.
  10. Når opptaket er fullført, går kameraet tilbake til posisjon 1 og programvaren begynner å komprimere filene. I løpet av denne tiden erstatter du prøvene med det neste settet som må måles.
  11. Gå til trinn 5.2. for å registrere neste løp.
  12. Når alle platene er målt, samles eksponeringsløsningene. Bruk en sil for å beholde embryoene.
  13. Avlive embryoene ved rask nedkjøling i et is/isopropanol (5%) bad.
  14. Kast eksponeringsløsninger og døde embryoer i henhold til lokale forskrifter.

6. Dataanalyse

  1. Åpne videodataene med VirtualDub (1.10.4).
  2. Skår visuelt antall embryoer som reagerer på lydpulsen (når kontrolllampen lyser).
  3. Skriv inn data i et regneark. Registrer det sammensatte navnet, replikatet, konsentrasjonen av forbindelsen og prosentandelen av immotile embryoer i henhold til malen i tilleggsfil 2, som inkluderer eksempeldatasettet vist i figur 2C.
    MERK: Malen har en fleksibel struktur og tillater hovedsakelig applikasjon for data fra andre organismer og endepunkter. Den beskriver responsene for hver konsentrasjon og gir også endepunktbeskrivelser samt definisjoner av parametrene som genereres i den påfølgende konsentrasjon-respons-modelleringen.
  4. Gjennomfør BMC-analysen (benchmark konsentrasjon) ved hjelp av en KNIME-arbeidsflyt (KNIME analytics 4.626) med innebygde R-skript (R versjon 3.6., R-pakker plotrix, DRC og BMD 27,28).
    MERK: I prinsippet kan vurderingen også gjennomføres direkte i R. For enkelhets skyld og for å tillate vurdering som en nettbasert tjeneste, har analysen imidlertid blitt organisert i en KNIME-serverkompatibel arbeidsflyt. Utdataene fra KNIME-arbeidsflyten finnes i tilleggsfil 3. Hvis du vil ha mer informasjon om de statistiske parameterne som genereres av KNIME-arbeidsflyten, kan du se denne malen. De statistiske parametrene for å estimere tilpasningens godhet og terskler for å akseptere bestemte BMC-verdier er vist i tabell 1. Selve KNIME-arbeidsflyten er tilgjengelig via GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). Konsentrasjonsresponsen modelleres ved hjelp av en 4-parameter log-logistisk modell. To av kurvetilpasningsparametrene kan fastsettes. Vanligvis vil man fastsette maksimumet til 100 når det gjelder prosentvise data. Hvis ingen bakgrunnseffekter observeres, kan minimumet fastsettes til 0%.

Representative Results

Figur 2A viser prosentandelen av immotile embryoer i 48 koblinger av ubehandlede villtypeembryoer (AB2O2-stamme). I gjennomsnitt reagerer 14,33% av ubehandlede villtypeembryoer ikke på vibrasjonsstimulansen. I 4 koblinger nådde prosentandelen immotile larver 50%, men 75% av clutchene hadde en prosentandel immotile larver under 20%.

Figur 2B,C viser et eksempel på en typisk beregning av en referansekonsentrasjon/dose (BMC/BMD29,30) for sammensatte effekter på motilitet med arbeidsflyten for vibrasjonsskremmingsanalyse, som for tiden utføres i PrecisionTox-konsortiet24. BMC10-, BMC25- og BMC50-verdier tilsvarer konsentrasjonene der henholdsvis 10%, 25% og 50% av embryoene viser immotilitetsnivåer høyere enn bakgrunnen. Bare embryoer som er helt immotile er inkludert i denne beregningen, ikke de som fortsatt viser delvise responser, for eksempel bare en C-bøyning uten påfølgende fluktsvømming eller bare halebevegelser (figur 2B). Embryoene ble utsatt for 8 konsentrasjoner av natriumkanalhemmeren trikain metansulfonat, som ofte brukes til fiskebedøvelse31. Dataene indikerer et bakgrunnsnivå på rundt 25% immotilitet som respons på vibrasjonsstimulansen. Fra 1% trikain reduseres motiliteten og opphører deretter over 2,5%. KNIME-arbeidsflyten beregner BMC50 til 164,9 μM, noe som tilsvarer 1,07 % trikain og et immotilitetsnivå på 75 % (figur 2C). De små 95 % konfidensintervallene (indikert av de grå nyansene i kurven) indikerer robust reproduserbarhet av motilitetsverdiene i denne analysen.

Figur 2D viser et eksempel på en suboptimal analysekjøring, hvis data ikke skal brukes til BMC-beregninger. Fem E3-behandlede kontrollgrupper med forskjellige embryoer avledet fra samme kobling er vist (AB2O2 [villtypestamme] replikerer 1-5). Bare den første gruppen viser en tilnærmet normal respons, og viser rundt 25 % immotilitet som er konsistent med litteraturverdier32 og de som er oppnådd i analysen beskrevet her, som vist i figur 2A, mens alle andre grupper viser reduserte og/eller ufullstendige atferdsresponser (f.eks. viser bare en C-bøy som ikke etterfølges av svømmeaktivitet, eller motilitet uten en klar C-bøyning i begynnelsen). En slik respons kan oppstå når embryoer ikke utvikler seg riktig og er i en umoden tilstand på grunn av utviklingsforsinkelse, noe som påvirker robustheten til skremmeresponsen14,33.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på et typisk resultat, inkludert beregning av referansedose. (A) Prosentandel av ikke-responsive embryoer etter lydpulsen for ubehandlede larver av villtype for 48 clutcher (n = 10 per clutch). Gjennomsnittet (14,33 %) og standardavviket (±16,19 %) er angitt i rødt. (B) Evaluering av skremmeresponsatferd hos embryoer (n = 20 per tilstand) behandlet med den angitte konsentrasjonen av trikain i E3 medium eller med E3 alene som kontroll. Atferd er klassifisert i henhold til fargeskjemaet og tegneserier angitt til høyre for grafen, med hvert embryo tildelt bare en av følgende klasser: "immotile": embryo viser ingen bevegelse; "hale flytting": embryo viser halebevegelse, men verken C-bøyning eller svømmeadferd; "bevegelig": embryo viser svømmebevegelse, men ingen C-bøyning som respons på vibrasjonsstimulansen; "C-bend only": embryo viser C-bøy, men unnslipper ikke svømming; "C-bend + motile": embryo viser typisk C-bøyningsatferd etterfulgt av fluktsvømming (den typiske full skremmeresponsen). De forskjellige atferdene vises som en prosentandel av det totale antall embryoer for hver behandling. (C) BMC-beregningsgraf generert av KNIME-arbeidsflyten, som indikerer prosentandelen av "immotile" embryoer for hver behandlingskonsentrasjon. Blå, røde og svarte linjer indikerer BMC10-, BMC25- og BMC50-verdiene, dvs. konsentrasjonene der henholdsvis 10%, 25% og 50% av embryoene viser immotilitetsnivåer høyere enn bakgrunnen. (D) Eksempel på en forkastet analysekjøring. Fem E3-behandlede kontrollkjøringer med forskjellige AB2O2 villtypeembryoer avledet fra samme kobling er vist (replikere 1-5). Bare replikat 1 viser en nesten normal respons, mens embryoer av de resterende løpene ikke viser den typiske C-bend + fluktsvømmingsresponsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Statistiske parametere for å estimere tilpasningens godhet og terskler for å akseptere bestemte BMC-verdier. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Egenskaper til et utvalg av vibrasjonelle skremmeresponsanalysesystemer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Excel-mal for konfigurasjonsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: KNIME-inndatamal med et eksempeldatasett. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Eksempel på KNIME-utdatafil. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Vi presenterer arbeidsflyten og dataanalysen for kjemisk sammensetningsevaluering ved hjelp av et spesialbygd oppsett for sebrafiskembryovibrasjonsskremmelse. Arbeidsflyten genererer robuste data som gjør det mulig å beregne typiske parametere som spesifiserer forbindelsestoksisitet, for eksempel referansekonsentrasjon/dose (BMC/BMD). Modulariteten i oppsettet tillater tilpasning til ulike behov for gjennomstrømning og plassbehov. Siden systemet er laget av rimelige basale komponenter, etter et relativt enkelt oppsett, gir det et billig alternativ til eksisterende kommersielle systemer, som vanligvis er designet for flere analysetyper samtidig, stole på proprietær programvare og forbli relativt kostbare.

Både disse kommersielle systemene og andre skreddersydde systemer tillater vurdering av enkeltembryoer eller larver i flerbrønnsplater (f.eks. 12-brønn34, 16-brønn32,35, 24-brønn 20,33,36, 48-brønn 37, 96-brønn 38,39,40,41,42 og til og med 384-brønn [som 4x96-brønn]43), men den romlige begrensningen i brønnene gjør analysen av noen dataparametere for rømningsresponsen (f.eks. tilbakelagt distanse) mer utfordrende. Videre, i noen av disse oppsettene, er avbildning begrenset til en delmengde av brønnene på platen, noe som reduserer gjennomstrømningen36,39. Avbildning av embryoer i skåler muliggjør bedre vurdering av rømningsresponsparametere og gjør det mulig å registrere oppførselen til flere embryoer samtidig (opptil 30 i en 6 cm tallerken, for eksempel). Vanligvis er parabolbasert avbildning begrenset til en tallerken per løp 44,45,46,47,48 (unntak utfører avbildning parallelt på 6 retter med en larve hver49 eller på 4 larver i 2 splittretter50), en ulempe som kan løses ved parallelle design som i vårt tilfelle. Vi har oppsummert noen kjennetegn ved systemet som er brukt i denne studien og andre kommersielle og skreddersydde løsninger i tabell 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.

En fordel med metoden er en avlesning som fanger opp både dødelighet og atferdsendringer, noe som kan øke ytelsen til toksisitetsvurderinger. For eksempel, mens sebrafiskfiskembryoens akutte toksisitetstest (FET)5 har vist seg å forutsi toksisitet i voksenfiskens akutte toksisitetstest53 ganske bra, ble prediksjonsnøyaktigheten forbedret ved å inkludere atferdsavlesninger54. Årsaken til dette er den svake dødeligheten forårsaket av nevroaktive forbindelser sett i fiskeembryoer, sannsynligvis på grunn av mangel på respirasjonssviktsyndrom som forårsaker økt toksisitet hos ungfisk eller voksen fisk. Nevroaktivitet kan imidlertid identifiseres ved vurdering av atferd. Videre kan atferdsavlesninger også fange myotoksiske og ototoksiske effekter, samt andre, mer subtile toksiske effekter på fysiologi, som er subletale, men påvirker organismens atferdsytelse.

Når analysen utføres, er det avgjørende å sikre riktig håndtering av forbindelser, samt å bruke et homogent utviklende parti sebrafiskembryoer. Bruk av glassflasker til oppbevaring av forbindelser bør derfor minimere nedgangen i konsentrasjoner av kjemikalier, spesielt hydrofobe forbindelser, på grunn av absorbans til plastmateriale. Ved forbindelser med høyt absorberende potensial til "plast" polystyren, kan glassplater også brukes til inkubasjonen. Rengjøring av eggene i vevskulturskålene som brukes til innsamling og fjerning av døde embryoer er et kritisk skritt for å sikre standardutvikling. Normal utviklingshastighet er viktig, da utviklingsforsinkelser kan påvirke modenheten til nevrale nettverk som ligger til grunn for den vurderte oppførselen14,33. For å muliggjøre sammenligning av sammensatte effekter, bør egg avledes fra samme stamme siden forskjellige stammer har blitt rapportert å presentere forskjellige atferdsprofiler 38,55,56,57. Under eksponering er det viktig å inkubere embryoene i et fuktet kammer for å unngå overdreven fordampning av E3-mediet, noe som vil endre konsentrasjonene som er testet.

E3-kontroller bør innlemmes i hver kjøring for å bestemme baselineresponsnivået for den bestemte gruppen embryoer som brukes i testserien. Vanligvis kjører vi en plate med kontroller langs hvert sett med 5 målinger. Som illustrert i figur 2D, tillater denne tilnærmingen også deteksjon av partier med suboptimale responser på grunn av forsinket utvikling eller av andre grunner, for eksempel genetiske bakgrunnseffekter. I tilfelle en uventet mangel på respons på stimulansen, må du også se opp for potensiell transduserfeil. Vanligvis viser skremmeresponsene en sigmoidal konsentrasjon-respons-oppførsel som muliggjør kurvetilpasning ved hjelp av en log-logistisk modell. I sjeldne tilfeller med bifasiske responser kan det imidlertid hende at andre modeller må brukes, for eksempel Gauss- eller Cedergreen-modeller. De er tilgjengelige i R-pakkene drc og bdm27,28.

Mangelen på respons på vibrasjonsstimulansen kan ganske enkelt indikere embryoens død eller alvorlig svekkede livsfunksjoner på grunn av generell cytotoksisitet, men kan også gjenspeile mer spesifikk toksisitet rettet mot nevrale kretser av stimuluspersepsjon, integrasjon og lokomotorisk utgang. Andre mulige sammensatte effekter er interferens med det nevromuskulære grensesnittet eller med muskelstruktur og funksjon. For å skille mellom disse mulighetene, er det nødvendig med ytterligere analyser. For eksempel kan den strukturelle integriteten til musklene vurderes med en birefringency-analyse58,59, og transgene linjer er tilgjengelige for å vurdere forstyrrelse av muskel- og nevralfunksjon60,61. Imidlertid tillater de innspilte videodataene allerede en mer detaljert analyse av morfologien og atferdsresponsen til embryoene som kan gi første tilleggsinformasjon. Er bare C-bøyningen svekket, eller all bevegelighet? Er fortsatt rester av nevromuskulær aktivitet tilstede, som indikert ved svake eller skjelvende halebevegelser? Går slike endrede atferd sammen med endringer i morfologi, som ødem eller økt kroppskrumning? I tillegg kan parametere som latenstid til C-svingen eller tilbakelagt distanse under rømningsresponsen evalueres (se for eksempel Ref. 44).

Screeningprotokollen beskrevet her tillater raske og robuste sammensatte toksisitetsevalueringer, med merverdien av spesifikt å oppdage ikke-dødelige nevrotoksiske, ototoksiske og myotoksiske forbindelser. Den medfølgende analysearbeidsflyten er enkel å implementere og gir en robust avlesning. Modifikasjoner av stimulusprotokollene som brukes i vibrasjonsskremmeanalysen har blitt brukt til å adressere sammensatte effekter på mer komplekse aspekter av skremmeatferd også, for eksempel prepulshemming (PPI) 39,44 og habituering32,33, og kan tilpasses det elektrodynamiske transduserbaserte stimulusoppsettet som ble brukt i denne studien.

En hovedanvendelse av skremmeresponsbaserte screeningsystemer er vurdering av sammensatte effekter i kjemiske skjermer, noe som er relevant både for human toksisitetsevaluering og legemiddelutvikling 1,4,62. Samtidig, ved å teste de tidlige livsstadiene til en vannlevende organisme, har de oppnådde resultatene direkte relevans for økotoksikologisk risikovurdering63,64. I tillegg kan skremmeresponssystemer brukes til atferdsfenotyping i genetiske skjermer 65,66,67,68,69. Vårt lett implementerbare og tilpasningsdyktige system gir et rimelig oppsett til mindre laboratorier som har til hensikt å gjennomføre sine egne spesifikke screeningprosjekter i disse ulike anvendelsesområdene.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker for den utmerkede tekniske assistansen fra støttepersonalet på IBCS-BIP fiskeanlegg og screeningsenter. Dette arbeidet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Grant Agreement No 965406 (PrecisionTox). Dette resultatet gjenspeiler bare forfatternes syn, og EU kan ikke holdes ansvarlig for eventuell bruk av informasjonen som finnes der.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm Sigma-Aldrich Z289744-1EA Or comparable material
High-speed camera XIMEA  MQ013MG-ON USB 3 
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap VWR 215-3261 Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL SARSTEDT 70.3010.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL SARSTEDT 70.3050.100 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL SARSTEDT 70.3020.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL SARSTEDT 70.3030.100 Or comparable material
Serological pipette 10 mL SARSTEDT 86.1254.001 Or comparable material
Serological pipette 25 mL SARSTEDT 86.1685.001 Or comparable material
Serological pipette 5 mL SARSTEDT 86.1253.001 Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) Greiner bio-one 628102 Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) SARSTEDT 83.3902.500 Or comparable material
Transfer pipette 6 mL SARSTEDT 86.1175 Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP SARSTEDT 62.554.502 Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP SARSTEDT 62.5472.54 Or comparable material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  4. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  5. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2013).
  6. OECD. Test No. 250: EASZY assay - Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2021).
  7. Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
  8. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
  9. Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
  10. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  11. Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
  12. Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
  13. Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
  14. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
  15. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
  16. Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
  17. Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
  18. Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
  19. Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
  20. Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
  21. van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
  22. Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
  23. Marcato, D. Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , Karlsruhe Institute of Technology. https://publikationen.bibliothek.kit.edu/1000085054 (2018).
  24. PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
  25. Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish - A Practical Approach. , Oxford University Press, Oxford. (2002).
  26. Preisach, C. hristine, Burkhardt, H. ans, Schmidt-Thieme, L. ars, Decker, R. einhold Data Analysis, Machine Learning and Applications. , Springer Berlin, Heidelberg. (2008).
  27. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
  28. Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
  29. Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
  30. Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
  31. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
  32. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  33. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
  34. Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
  35. Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
  36. Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
  37. Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
  38. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  39. Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
  40. Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
  41. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
  42. Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
  43. Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
  44. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
  45. Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
  46. Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
  47. Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
  48. Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
  49. Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
  50. Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
  51. Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
  52. Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
  53. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2019).
  54. Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
  55. Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
  56. van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
  57. van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
  58. Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
  59. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  60. Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
  61. Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
  62. Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
  63. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  64. Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
  65. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  66. Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
  67. Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
  68. Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
  69. Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203
Evaluering av toksisitet av kjemikalier ved hjelp av et Zebrafish Vibration Startle Response Screening System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von… More

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von Clausbruch, C. A., Pace, G., Strähle, U., Colbourne, J. K., Pylatiuk, C., Peravali, R., Weiss, C., Scholz, S., Dickmeis, T. Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System. J. Vis. Exp. (203), e66153, doi:10.3791/66153 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter