Summary
يوفر البروتوكول عملية توحيد مفصلة لصيغة ديكوتيون وتقنية التزويج مع مغلي Yiqi Jiedu في نموذج فأر الساركوما العظمية كمثال. يصف حماية ويحسن موثوقية البيانات البحثية ، ويوفر استراتيجيات فعالة للتحقيق في الفعالية العلاجية والآليات الجزيئية لصيغ ديكوتيون في الجسم الحي.
Abstract
صيغة ديكوتيون هي شكل الجرعة الأكثر استخداما في الطب الصيني التقليدي ويتم تطبيقها في الممارسة السريرية لآلاف السنين عن طريق الإدارة عبر الفم ، والتي تتميز بالتأثير السريع والامتصاص السهل والعلاج الفردي بناء على متلازمات محددة للمرضى. جودة صيغة ديكوتيون مسؤولة بشكل مباشر عن الفعالية السريرية للطب الصيني التقليدي. لذلك ، فإن عملية توحيد صيغة ديكوتيون مهمة لتجنب الاختلافات في جودة ديكوتيون الناجمة عن عوامل ذاتية. وفي الوقت نفسه ، نظرا لقيود إجراء التجارب السريرية ، غالبا ما تستخدم الصغيرة التي تحمل أمراضا بشرية ، مثل الفئران ، في الأبحاث الطبية لاستكشاف الفعالية العلاجية والآليات الشاملة للتدخلات المختلفة ، بما في ذلك صيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي. وبالتالي ، كطريقة مهمة للإعطاء عبر الفم ، فإن تقنية التزويج الماهرة مهمة بشكل خاص لتجنب تلف المريء المحتمل وانسكاب الدواء ، مما يضمن إعطاء كمية متساوية من الدواء لكل نموذجي ، مما يؤدي إلى نتائج تجريبية دقيقة. علاوة على ذلك ، فإن الطريقة الموحدة لإعداد صيغة ديكوتيون واستراتيجية التزويج الماهرة ضرورية لحماية رعاية وتقليل عدد المستخدمة. هنا ، أبلغنا عن عملية توحيد مفصلة لصيغة ديكوتيون وتقنية التزجيج باستخدام Yiqi Jiedu decoction في نموذج فأر الساركوما العظمية كمثال. تم تقييم الفعالية من خلال حجم الورم. سيعمل هذا البروتوكول على زيادة حماية إلى أقصى حد وتحسين موثوقية بيانات البحث ، وبالتالي توفير استراتيجيات فعالة للتحقيق في الفعالية العلاجية المستقبلية والآليات الجزيئية لصيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي في الجسم الحي.
Introduction
صيغة ديكوتيون هي شكل الجرعة الأكثر استخداما للطب الصيني التقليدي والأدوية الطبية السائلة1،2. تتم معالجة صيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي عن طريق إزالة الأعشاب في الماء بعد نقعها ، تليها التصفية للتخلص من الثمالة.
نظرا لأنه يمكن تخصيص تركيبة ديكوتيون بناء على الضرورات السريرية ، خاصة بما يتماشى مع خصائص العلاج القائم على الأدلة في الطب الصيني التقليدي ، فقد تم تطبيق شكل الجرعة هذا عن طريق الإعطاء عن طريق الفم في الممارسة السريرية لآلاف السنين مع مزايا محددة لا يمكن الاستغناء عنها 3,4. ترتبط جودة صيغة ديكوتيون ارتباطا مباشرا بالفعالية السريرية. لذلك ، يجب تحضير تركيبة ديكوتيون بناء على مبادئ طرق ديكوتيون الموحدة لضمان استخراج المكونات النشطة وحمايتها إلى أقصىحد 3. وفي الوقت نفسه ، الأدوية الجاهزة ديكوتيون هي الشكل الرئيسي للأعشاب الصينية الخام المستخدمة في الممارسة السريرية. يجب أن تتوافق معايير الجودة وطرق إنتاج الأدوية الموصوفة الجاهزة ديكوتيون مع أحكام دستور الأدوية الصيني2. علاوة على ذلك ، يجب نقع الأدوية الموصوفة الجاهزة ديكوتيون في ماء الشرب البارد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تفكيكها في وعاء صيدلاني خاص عن طريق تسخين5. أظهرت الدراسات أنه يمكن استخراج معظم المكونات النشطة عن طريق الفك لمرتين ، كما تنص مدونة الممارسات لإدارة غرف ديكوتيون للأدوية الصينية التقليدية في المؤسسات الطبية على أن يتم ديكوتيون مرتين4،6،7. إذا تم وصف الأعشاب الصينية الخاصة ، مثل تلك ذات الملمس الصلب أو المقويات ، فمن المستحسن تمديد وقت ديكوتيون. يجب أن تكون أواني ديكوتيون وحاويات التخزين التي تتلامس مباشرة مع تركيبة ديكوتيون ، بدءا من الحاوية التي تنقع فيها الأدوية الموصوفة الجاهزة ، مستقرة كيميائيا ولها أغطية ، مثل الأوعية المقاومة للحرارة والسيراميك والزجاج والفولاذ المقاوم للصدأ. ومع ذلك ، لا ينبغي استخدام الألمنيوم والمنتجات البلاستيكية العادية ، في حين يجب حظر الحديد والأواني المسببة للتآكل الأخرى لتجنب التفاعلات الكيميائية المحتملة ، مما يقلل من الفعالية العلاجية وحتى ينتج عنه آثار ضارة4،6،7.
نظرا لقيود إجراء التجارب السريرية ، غالبا ما تستخدم الصغيرة التي تحمل الأمراض البشرية ، مثل الفئران ، في الأبحاث الطبية لاستكشاف الفعالية العلاجية والآليات الشاملة للتدخلات المختلفة بما في ذلك صيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي 8,9; ومع ذلك ، على عكس البشر ، يجب تحضير صيغ ديكوتيون كل يوم ، وخلطها معا ، وإدارتها طازجة 2x يوميا في الممارسة السريرية. غير قادرة على تناول أدويتها طواعية في الوقت المحدد بالجرعة المطلوبة ، ومعظم التجارب على المتعلقة بالطب الصيني التقليدي هي إعطاء عن طريق الفم قائم على التزويج لصيغ ديكوتيون في الوقت الحاضر. يجب تحضير تركيبات ديكوتيون المستخدمة في التجارب على في الجسم الحي مسبقا ، وتخزينها في -20 درجة مئوية وإذابتها قبل الاستخدام مباشرة3،4،10. علاوة على ذلك ، فإن تجميد دون المستوى المطلوب والتلاعب بإبرة التزويج يزيد من خطر الإصابات غير الضرورية والعواطف السلبية. لذلك ، كطريقة مهمة لتوصيل الأدوية عبر الفم ، فإن تقنية التزويج الماهرة مهمة بشكل خاص لتجنب إصابة المريء المحتملة وانسكاب الدواء ، وبالتالي ضمان حصول كل نموذجي على كمية متساوية من الأدوية العشبية الموصوفة لتحقيق نتائج تجريبية دقيقة. هنا ، نحن نقدم بروتوكول gavage لصيغة ديكوتيون من الطب الصيني التقليدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يصف هذا البروتوكول تقنية التزويج التفصيلية في الفئران النموذجية للساركوما العظمية باستخدام ديكوتيون Yiqi Jiedu كعينة. تم استخدام ذكور الفئران الأثيمية البالغة من العمر أربعة أسابيع (BALB / c nude) في هذه التجربة وتم الاحتفاظ بها في غرفة تربية SPF في مركز المختبر في جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل إدارة ولجنة جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي ، وامتثلت لمدونة أخلاقيات المختبر (رقم الموافقة على أخلاقيات: PZSHUTCM2304060007) ، وأجريت بما يتفق بدقة مع المتطلبات الدولية المتعلقة بحيوانات المختبر.
1. المواد
- احصل على المواد التالية: الأعشاب الصينية (الجينسنغ 42 جم ، Hedyotis diffusa 52.5 جم ، عشب القلنسوة الشائكة 31.5 جم) ، حقنة 1 مل ، وإبرة تجويف الكوع 12 جم / 55 مم (الشكل 1).
2. تحديد الجرعة
- احسب الجرعة اليومية على النحو التالي: الجرعة اليومية للبالغين الذين يبلغ وزنهم القياسي 60 كجم هي الجينسنغ 12 جم ، Hedyotis diffusa 15 جم ، وعشب قلنسوة الشائكة 9 جم ، بإجمالي 36 جم دواء جاهز ديكوتيون ، أي 0.6 جم من الأدوية الجاهزة ديكوتيون / كجم من وزن الجسم. بالإشارة إلى 12 مرة للجرعة المكافئة ، و 6 مرات للجرعة المنخفضة ، و 24 مرة للجرعة العالية بين البالغين الذين يبلغ وزن الجسم القياسي 60 كجم والفئران ذات وزن الجسم القياسي 25 جم وفقا لمساحة سطح الجسم11 ، بالإضافة إلى بياناتنا الأولية ، استخدم نسبة جرعة 20 مرة من Yiqi Jiedu decoction للفئران في الدراسة الحالية ، لذلك ، كانت جرعة الفئران 12 جم من الأدوية الجاهزة ديكوتيون / كجم من وزن الجسم.
- احسب الجرعة لكل ماوس باستخدام المعادلة:
جرعة الفأر (وزن جسم الحامل) = جرعة للبالغين (وزن جسم الحامل) × 20 (نسبة الجرعة المكافئة المحددة).
الجرعة اليومية لكل فأر هي 0.3 جم [(12 جم أدوية جاهزة ديكوتيون / 1000 جم من وزن الجسم) × 25 جم من وزن الجسم] في 200 ميكرولتر بتركيز نهائي قدره 1.5 جم / مل. - احسب إجمالي الأدوية الجاهزة للديكوتيون للفئران (ن = 7) في مجموعة Yiqi Jiedu decoction مع إعطاء gavage لمدة 28 يوما ليكون 58.8 جم. ركز هذا إلى 39.2 mL للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1.5 g/mL.
- النظر في فقدان المخدرات المحتملة خلال مراحل ديكوتيون و gavage ، ولتسهيل الحساب ، وإعداد ما مجموعه 126 غرام (الجينسنغ 42 غرام ، Hedyotis diffusa 52.5 غرام ، عشب قلنسوة الشائكة 31.5 غرام) دواء جاهز ديكوتيون ، والتركيز في حجم نهائي من 84 مل.
3. مصدر الخلية والثقافة
- قم بشراء خلايا الساركوما العظمية 143B المشتقة من الإنسان من بنك خلايا ATCC.
- بذرة 1 × 106 143 خلية B في 10 مل من وسط MEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في طبق زراعة الخلايا 10 سم.
- زراعة خلايا 143B عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 80٪ -90٪.
4. طرق النمذجة
- اجمع 80٪ من خلايا 143B المستنبتة المتقاربة ، وأعد تعليقها في 6 مل من وسط MEM المحتوي على 10٪ مصل واخلطها مع هلام مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة حجم 1: 1 لعمل تعليق خلية بتركيز نهائي 1 × 107 خلايا / مل.
- حقن 10 ميكرولتر من معلق الخلية في الساق اليسرى لكل فأر أثيمي لإنشاء نموذج فأر ساركوما عظمية في الموقع ، كما هو موضح في منشورنا السابق12. الخطوات باختصار هي كما يلي.
- اغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني. التربسين الخلايا مع 1.5 مل من 0.25 ٪ التربسين لمدة 3 دقائق. أضف 6 مل من وسائط MEM المحتوية على 10٪ مصل. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- نضح 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في غرفة لوحة عد الخلايا وحساب تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية التلقائي. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 800 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة غشاء القاعدية 8.5 مجم / مل ، وضعها على الثلج.
- تخدير الفئران عن طريق تعريضها ل 2٪ إيزوفلوران و 98٪ أكسجين (معدل تدفق الأكسجين ، 2 لتر / دقيقة). ضع كمية صغيرة من مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- نفذ الإجراء بأكمله في منطقة جيدة التهوية. قبل حقن خلايا الساركوما العظمية ، تأكد من أن كل فأر يخضع للتخدير العميق عن طريق لمس القدم برفق ؛ إذا كان الماوس لا يزال لديه استجابات ، مثل نشل أو رعشة. انتظر لفترة أطول إذا كان الماوس لا يزال لديه استجابات ، مثل نشل أو رعشة ، حتى تختفي هذه الاستجابات.
- ضع الماوس في وضع ضعيف. امسك كاحل الماوس باستخدام الإبهام والسبابة وقم بتطهير موقع حقن الساق بثلاث جولات متناوبة من البيتادين و 70٪ من الإيثانول.
- قم بتوصيل الإبرة بمحقنة سعة 1 مل ووجه طرف الإبرة نحو موقع الحقن الموازي لمحور الظنبوب. أدخل الإبرة عن طريق الجلد لحفر ثقب عبر منصة الساق باتجاه الطرف البعيد من الساق.
- قم بتحميل معلق خلايا الساركوما العظمية الذي تم وضعه مسبقا على الثلج في حقنة ميكروحجمية واستبدل المحقنة سعة 1 مل في الساق بحقنة ميكروحجمية محملة بخلايا الساركوما العظمية. حقن ببطء ما يقرب من 10 ميكرولتر من (1 × 107 خلايا / مل) معلق خلايا الساركوما العظمية في قصبة كل فأر أثيمي.
- قم بإزالة المحقنة ذات الحجم الصغير من موقع الحقن ، واضغط على موقع الحقن بقطعة القطن لمدة 30 ثانية تقريبا. ضع الماوس مرة أخرى في قفص نظيف ولاحظ تعافيه لمدة 10 دقائق.
5. إعداد صيغة مغلي الطب الصيني التقليدي للتزجيج (الشكل 2)
- احسب الجرعة حسب الخطوة 2.
- نقع جميع الأعشاب الطبية لديكوتيون ، باستثناء عشب الجينسنغ باهظة الثمن ، في مياه الشرب مع مستوى 3 سم أعلى من سطح الدواء ، لمدة 30 دقيقة ، ثم أداء ديكوتيون 2x كما هو موضح أدناه.
- قم بإجراء ديكوتيون الأول عن طريق التسخين حتى الغليان على نار قوية ، ثم التسخين لمدة 15-25 دقيقة على نار خفيفة. يشير الحريق المعتدل إلى حرارة منخفضة الطاقة تتراوح درجات الحرارة عادة من 80 درجة مئوية إلى 100 درجة مئوية ، بينما يشير الحريق القوي إلى حرارة عالية الطاقة تتراوح عادة من 200 درجة مئوية إلى 300 درجة مئوية.
- صب السائل ديكوتيون في حاوية واحدة.
- قم بإجراء ديكوتيون الثاني عن طريق تسخين الأعشاب الطبية في مياه الشرب ، بحجم يكفي فقط لغمر سطح الدواء ، ليغلي على نار قوية ، ثم يسخن لمدة 15-25 دقيقة على نار خفيفة.
- صب السائل ديكوتيون في نفس الحاوية كما في الخطوة 5.4.
- نقع و decoct 42 غرام من الجينسنغ بشكل منفصل ، مع مياه الشرب 3 سم أعلى من سطح الدواء ، لأنه مكلف.
- أداء ديكوتيون الأول من الجينسنغ غارقة عن طريق تسخينه على نار قوية لمدة 60 دقيقة.
صب السائل ديكوتيون في نفس الحاوية كما في الخطوة 5.4. - أداء ديكوتيون الثاني من الجينسنغ في مياه الشرب مع حجم يكفي فقط لغمر سطح الدواء ، عن طريق التدفئة على نار خفيفة لمدة 40 دقيقة. صب السائل ديكوتيون في نفس الحاوية كما في الخطوة 5.4.
ملاحظة: يجب أن تكون الحاويات المستخدمة في ديكوتيون مستقرة كيميائيا ، مثل الأوعية المقاومة للحرارة (الأكثر استخداما في الممارسة السريرية) والسيراميك والزجاج والفولاذ المقاوم للصدأ لتجنب التفاعلات الكيميائية المحتملة مع المواد الطبية. يجب وضع كل سائل ديكوتيون تم الحصول عليه من خطوات مختلفة في نفس الحاوية. - امزج وفلتر سائل ديكوتيون باستخدام ثلاث طبقات من الشاش مثبتة عند فم كوب قياس بأشرطة مطاطية.
- اغلي المرتقي المصفى على نار قوية في وعاء ، ثم قم بتغييره إلى نار خفيفة واحتفظ بالنار الخفيفة حتى الوصول إلى التركيز المستهدف (حجم نهائي 84 مل بتركيز نهائي 1.5 جم / مل).
- تحضير 21 مل من ديكوتيون مركزة وفقا للجرعة المطلوبة للإعطاء داخل المعدة لمدة 1 أسبوع ، وتخزين القسمة في الثلاجة في -20 درجة مئوية.
6. إدارة Gavage في الفئران باستخدام جهاز gavage
- ضع الماوس على سطح قفص الماوس أو أي سطح آخر أكثر خشونة.
- أمسك ذيل الماوس بالإبهام والسبابة من اليد اليمنى. ثم أمسك عنق الماوس بالإبهام والسبابة والإصبع الأوسط من اليد اليسرى.
- امسك ذيل الفأر بالإصبعين الآخرين من اليد اليسرى لجعل رأس الفأر ورقبته وجسمه في خط مستقيم.
ملاحظة: تأكد من إبقاء الماوس مسترخيا أثناء عملية الإمساك بأكملها. إذا استمر الماوس في النضال من أجل الحركة ، فيجب إجراء عملية الإمساك حتى يتم استرخاء الماوس. - امسك جهاز التزويج في اليد اليمنى وقم بتحميل 200 ميكرولتر من تركيبة ديكوتيون للماوس مع 20 جم من وزن الجسم (100 ميكرولتر من تركيبة ديكوتيون / 10 جم من وزن الجسم من الماوس).
- أدخل إبرة التجويف في الفم من الزاوية وادفع اللسان ضد الفك العلوي للماوس.
- حافظ على جسم الفأر في نفس الاتجاه وادفع إبرة التجويف برفق نحو المعدة على طول المريء حتى يتم ترك حوالي 10 مم من إبرة التجويف بالخارج.
ملاحظة: هناك شعور أجوف عندما تدخل إبرة التجويف إلى المريء. يجب قياس طول إبرة التجويف التي يتم إدخالها في الماوس إلى أعلى القص. يبلغ الطول الإجمالي لإبرة التجويف 60 مم (الشكل 3) ، لذلك يجب إدخال حوالي 50 مم من إبرة التجويف في جسم الفأر قبل حقن تركيبة ديكوتيون في معدة الفأر. - حقن صيغة ديكوتيون في المعدة من الماوس. إن مواجهة المقاومة أو السائل الخارج من زاوية الفم يعني وضع إبرة التجويف في غير مكانها ، والتي يجب تجنبها. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إبطاء سرعة الحقن إذا كانت تركيبة ديكوتيون سميكة.
- حرر الماوس وراقبه لمدة 10 دقائق. ينجح التجويف إذا لم يلاحظ أي خلل في التنفس وإعادة الماوس إلى القفص (الشكل 4).
7. مسار العلاج
- لاستكشاف الفعالية العلاجية ل Yiqi Jiedu decoction ، قم بإعداد مجموعة تحكم ومجموعة Yiqi Jiedu decoction. بالنسبة للفئران في المجموعة الضابطة ، يتم تطبيق محلول ملحي فسيولوجي ، مرة واحدة يوميا لمدة 28 يوما. بالنسبة للفئران في مجموعة Yiqi Jiedu decoction ، قم بإدارة Yiqi Jiedu ديكوتيون مرة واحدة يوميا لمدة 28 يوما.
8. ردود الفعل السلبية
- راقب عن كثب حالة الفئران بعد وضعها مرة أخرى في القفص ، بما في ذلك فقدان الوزن وانخفاض الحالة العقلية بسبب عدم قدرة الطعام على الدخول إلى المعدة.
- ستواجه الفئران صعوبة في التنفس وضيق في التنفس بسبب انسداد القصبة الهوائية الناجم عن الطعام وسوف تسعل في محاولة لإزالة القصبة الهوائية. إذا لوحظ أي من هذه الأعراض أثناء التزويج ، فقم بإيقاف التجويف على الفور والقتل الرحيم للفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحديد التأثير المثبط ل Yiqi Jiedu decoction على نمو الساركوما العظمية في الجسم الحي في نموذج فأر الساركوما العظمية داخل الظنبوب ، والذي تم تحضيره عن طريق حقن خلايا الساركوما العظمية 143B في قصبة الفئران الذئيمية. تم إعطاء ديكوتيون Yiqi Jiedu للفئران من مجموعة Yiqi Jiedu decoction عن طريق التزويج لمدة 28 يوما بدءا من اليوم الثاني من حقن 143B. أعطيت المياه المالحة الفسيولوجية للفئران في المجموعة الضابطة. تم القتل الرحيم لجميع الفئران بعد 28 يوما. أظهرت النتائج أن حجم الورم في مجموعة مغلي Yiqi Jiedu قد انخفض بشكل ملحوظ مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 5).
الشكل 1: مستهلكات ديكوتيون. يتكون الدواء الجاهز ديكوتيون من (أ) الجينسنغ ، (ب) Hedyotis diffusa ، (ج) عشب قلنسوة شائكة ، (د) كوب قياس متدرج ، (ه) الأربطة المطاطية ، (F) الشاش ، (ز) تثبيت ثلاث طبقات من الشاش عند فم كوب القياس بأشرطة مطاطية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد صيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي. (أ) الأدوية الجاهزة للديكوتيون باستثناء نقع الجينسنغ لمدة 30 دقيقة. (ب) نقع الجينسنغ بشكل منفصل لمدة 30 دقيقة. (ج) يتم فك الجينسنغ بشكل منفصل. (د) تصفية صيغة ديكوتيون من الطب الصيني التقليدي. (ه) تخزين تركيبة ديكوتيون مركزة من الطب الصيني التقليدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المواد الاستهلاكية Gavage. حقنة عادية سعة 1 مل بإبرة أصلية (اللوحة اليسرى) ، ومحقنة سعة 1 مل بإبرة أصلية يتم استبدالها بإبرة نضح معدي للمرفق رقم 12/55 مم لضبط جهاز التزويج (اللوحة اليمنى). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إجراء إعطاء التجويف في الماوس. (أ) الماوس على سطح القفص. ب: إمساك ذيل الفأر بيد واحدة. (ج-د) يتم إصلاح الماوس بيد واحدة. ه: إدخال إبرة من فم الفأر. (و) نهاية إدارة التزويج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التأثير المثبط للديكوتيون في نموذج فأر الساركوما العظمية. (أ) عينات الساركوما العظمية التي يتم جمعها من المجموعة الضابطة ومجموعة التدخل ديكوتيون Yiqi Jiedu. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n = 7) (B) اختبار t غير المزاوج لحجم الورم بين مجموعة التحكم (Ctrl) ومجموعة تدخل Yiqi Jiedu decoction. تدخل Yiqi Jiedu ديكوتيون لمدة 28 يوما يمنع بشكل كبير حجم الورم (p<0.05). تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n = 7). (ج) وزن جسم الفئران في مجموعة التزويج ديكوتيون Yiqi Jiedu ومجموعة التحكم طوال الفترة التجريبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ترتبط الفعالية السريرية للأعشاب الموصوفة في الطب الصيني التقليدي إلى حد كبير بالجرعة المعطاة وشكل الجرعة. لذلك ، فإن إنشاء استراتيجية ديكوتيون موحدة وعملية إدارة ماهرة ضرورية في الممارسة السريرية ، وكذلك في تحسين موثوقية النتائج التجريبية.
في هذه الدراسة ، قدمنا أولا استراتيجية مفصلة ل decoction موحدة من الأعشاب الصينية المستخدمة في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي ، والتي تسهل توجيه الناس إلى الأدوية decoct علميا ، كما يحسن عمليا نوعية صيغة ديكوتيون والفعالية السريرية للأدوية العشبية. لذلك ، بمجرد تحقيق التوحيد القياسي ، فإنه سيحسن دقة واتساق فعالية الأدوية العشبية في الممارسة السريرية.
تم تطبيق استراتيجية التزويج على نطاق واسع كطريقة تناول عن طريق الفم في الدراسات قبل السريرية وهي قابلة للتطبيق على التجارب المختلفة ، بما في ذلك الفئران والجرذان والأرانب ، والتي توفر بعض المزايا ، مثل سهولة الإعطاء ، والتحكم الدقيق في الجرعة ، والقدرة على تقليد المسار السريري لإدارة الدواء13. ومع ذلك ، فإن ستكافح إذا تم تجميدها في وضع غير صحيح دون تخدير ، مما قد يهدد صحة الباحثين ويقلل من موثوقية التجارب. لذلك ، فإن إنشاء طريقة موحدة للتجويف مهم لتقليل هذه الاحتمالات وتجنب دخول ديكوتيون إلى المريء عن طريق الخطأ أو التسبب في تلف المريء ، مما يؤدي بدوره إلى موت والفشل التجريبي.
هنا ، اخترنا طريق التزويج لتوصيل تركيبة ديكوتيون إلى الفئران النموذجية للساركوما العظمية ، حيث سمحت لنا بقياس الجرعة بدقة وضمان توصيل الدواء بشكل متسق طوال التجربة. لإعداد صيغة ديكوتيون ، قمنا أولا بحساب كمية الأدوية الجاهزة ديكوتيون للفأر على أساس نسبة 20 ضعف الكمية المستخدمة للبالغين الذين يبلغ وزن الجسم 60 كجم ؛ غارقة ، و deocted 2x عن طريق التسخين حتى الغليان ؛ مرشح مركزة ، وتخزين ديكوتيون في القسمة في -20 درجة مئوية. لإجراء إدارة التجويف ، قم بتحميل 200 ميكرولتر من تركيبة ديكوتيون المركزة في جهاز التجويف ، وأدخل إبرة التجويف في الفم ، وادفع إبرة التجويف برفق نحو المعدة وحقن تركيبة ديكوتيون في معدة الماوس. إحدى النتائج التي توصلنا إليها هي التثبيط الكبير لنمو الورم الذي لوحظ في المجموعة التي تتلقى صيغة ديكوتيون من Yiqi Jiedu decoction عن طريق التزويج. لاحظنا انخفاضا واضحا في حجم الورم في مجموعة ديكوتيون Yiqi Jiedu مقارنة بالمجموعة الضابطة. تشير هذه النتائج إلى أن استراتيجية التزويج توفر بشكل فعال المكونات النشطة لصيغة ديكوتيون إلى الموقع المستهدف ، مما يؤدي إلى تأثيرات قوية مضادة للورم. علاوة على ذلك ، قمنا بتقييم ملف تعريف السلامة لاستراتيجية التجويف من خلال مراقبة الحالة العامة ووزن الجسم للفئران طوال الفترة التجريبية. لم نجد فروقا ذات دلالة إحصائية في تغيرات وزن الجسم أو علامات السمية بين مجموعة التجويف Yiqi Jiedu decoction ومجموعة التحكم ، مما يشير إلى أن إدارة التجويف لصيغة ديكوتيون جيدة التحمل ولا تسبب آثارا ضارة واضحة.
على الرغم من أن استراتيجية التزويج أثبتت فعاليتها في تقديم تركيبة ديكوتيون لحيوانات التجارب ، فمن المهم إدراك ردود الفعل السلبية المحتملة وبعض القيود المرتبطة بطريقة الإدارة هذه. لتجنب انسداد القصبة الهوائية الناجم عن الطعام ، راقب عن كثب حالة الفئران أثناء وبعد التزويج ، مثل صعوبة التنفس وضيق التنفس والسعال. بمجرد ظهور أي منها ، أوقف التجويف على الفور وقم بإجراء ضغطات على الصدر على سطح مكتب صلب أفقي ؛ علاوة على ذلك ، المساعدة البيطرية الفورية ضرورية لأي حالة خطيرة. علاوة على ذلك ، نحتاج إلى إيلاء اهتمام وثيق للقيود التالية. أولا ، قد يؤدي التزويج إلى إجهاد ، مما قد يؤثر على فسيولوجيتها العامة واستجابتها للعلاج. ومع ذلك ، فقد اتخذنا إجراءات لتقليل الإجهاد باستخدام إبرة تغذية صغيرة والتعامل مع الفئران بلطف أثناء إجراء التزوير. علاوة على ذلك ، لا يمكن إجراء التزويج إلا من قبل شخص تم تدريبه وتأهيله بشكل خاص لضمان استخدام تقنية موحدة لتجنب الضرر المحتمل للحيوانات14. ثانيا ، لا تزال الآلية الدقيقة التي تمارس بها المكونات النشطة لصيغة ديكوتيون آثارها المضادة للورم غير واضحة. من الممكن أن تغير استراتيجية التزويج الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية للمركبات العشبية ، مما قد يؤثر على توافرها البيولوجي وفعاليتها العلاجية. يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على توضيح الآليات الدقيقة الكامنة وراء التأثيرات المضادة للورم لصيغة ديكوتيون التي يتم تسليمها من خلال التزجيج. علاوة على ذلك ، أفادت الدراسات أن تطبيق التخدير الأيزوفلوران أثناء التزويج على المدى الطويل يقلل من الابتلاع غير المكتمل للديكوتيون وموت بسبب تقنية التزويج غير الماهرة15. وفي الوقت نفسه ، فإن إضافة زيت الطهي إلى ديكوتيون يقلل من الإجهاد الحيواني المرتبطب 16.
في الختام ، قدمنا عملية ديكوتيون موحدة من الأعشاب الصينية واستراتيجية gavage الماهرة للفئران. هذه الجهود لا تتجنب فقط إصابات المريء المحتملة وموت الفئران التجريبية ، ولكن أيضا تجنب فيضانات المخدرات لضمان أن كل تجريبي يدير كمية متساوية من الأدوية العشبية ، وبالتالي تحسين دقة واتساق النتائج التجريبية ، وكذلك الآثار العلاجية. توضح دراستنا فعالية وسلامة استراتيجية التزجيج لإدارة تركيبة ديكوتيون الطب الصيني التقليدي في نموذج فأر الساركوما العظمية. تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانات طريقة التسليم هذه في علاج الساركوما العظمية وتضع الأساس لمزيد من البحث في تحسين استراتيجية التزويج لإدارة الطب الصيني التقليدي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تبحث الدراسات المستقبلية في آليات العمل الدقيقة للمكونات النشطة في صيغة ديكوتيون واستكشاف التأثيرات التآزرية المحتملة مع طرق العلاج الأخرى لتعزيز النتائج العلاجية في مرضى الساركوما العظمية. لذلك ، تلقي هذه النتائج الضوء على الفوائد والقيود المحتملة لطريقة الإدارة هذه وتوفر رؤى قيمة حول تطبيقها في علاج الساركوما العظمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم دعم العمل الحالي بمنح من (1) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408) ، (2) البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFE0201600) ، (3) مشروع بناء مركز شنغهاي للأبحاث ذات الأولوية القصوى (2022ZZ01009) ، (4) مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للتحول الصناعي لإعداد الطب الصيني التقليدي للمستشفى ، و (5) مشاريع بحثية ضمن ميزانية جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | Animal |
| Barbed skullcap herb | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 20230606 | Decoction-ready medicines |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm) | RWD Life Science Co., Ltd. | C21014-12 | Component of gastric perfusion device |
| Gauze | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | LC45 | Decoction filter |
| Ginseng | Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd. | 20220704-2 | Decoction-ready medicines |
| Hedyotis diffusa | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 2023071107 | Decoction-ready medicines |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| Rubber bands | Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd. | XPJ | Fixing gauze on the measuring cup |
| Syringe (1 mL ) | Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd. | SBM0040 | Component of gastric perfusion device |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
References
- Gao, S. Discussion on advantages and improvement of traditional Chinese medicine decoction. Chinese Community Physicians (Comprehensive Edition). (21), 12 (2005).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. , (2015).
- An, Y., et al. Interpretation on specification of traditional Chinese medicine decoction. Herald Med. 42 (11), 1648-1652 (2023).
- Chen, S., et al. Research strategies in standard decoction of medicinal slices. China J Chinese Materia Medica. 41 (8), 1367-1375 (2016).
- Luo, F. Effect of soaking traditional Chinese medicine before decoction on active components. Shanghai Yiyao. 40 (9), 63-64 (2019).
- Liu, F., Chen, M. On the standardization of decocting methods of modern decoction. Global Trad Chinese Med. 7 (5), 377-378 (2014).
- Li, X., et al. Influence of decocting times and instrument on the quality of decoction. J Trad Chinese Med. 50 (6), 550-552 (2009).
- Li, X., et al. Herbal decoctosome is a novel form of medicine. Sci China. Life Sci. 62 (3), 333-348 (2019).
- Lan, Y., Hu, Y., Huang, W., Tang, S. Reflections on PK - PD model based on animal experiments for study of Chinese medicine. Lishizen Med Materia Medica Res. 34 (2), 395-397 (2023).
- Li, Y., Bai, M., Song, Y., Guo, H., Miao, M. Research and reflection on standard decoction of Chinese materia medica. Chinese Trad Herbal Drugs. 49 (17), 3977-3980 (2018).
- Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers. , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/estimating-maximum-safe-starting-dose-initial-clinical-trials-therapeutics-adult-healthy-volunteers (2005).
- Chang, J., et al. Intratibial osteosarcoma cell injection to generate orthotopic osteosarcoma and lung metastasis mouse models. J Vis Exp. (176), 63072 (2021).
- He, C.
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Fronti Pedia. 2, 93 (2014).
- Jones, C. P., Boyd, K. L., Wallace, J. M. Evaluation of mice undergoing serial oral gavage while awake or anesthetized. J Am Assoc Lab Animal Sci. 55 (6), 805-810 (2016).
- Recena Aydos, L., et al. Nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in C57bl/6 models. Nutrients. 11 (12), 3067 (2019).
