Summary
Her beskriver vi en platform, der tillader ikke-invasiv in vivo-billeddannelse af leversfæroider indpodet i det forreste kammer i museøjet. Arbejdsgangen spænder fra generering af sfæroider fra primære leverceller til transplantation i museøjet og in vivo-billeddannelse ved cellulær opløsning ved konfokal mikroskopi.
Abstract
Biomedicinske undersøgelser af leveren hos pattedyr hindres af manglen på metoder til in vivo ikke-invasiv langsgående billeddannelse ved cellulær opløsning. Indtil nu er optisk billeddannelse af leveren in situ mulig ved intravital billeddannelse, som giver billeddannelse i høj opløsning på celleniveau, men ikke kan udføres flere gange og derfor i længderetningen i samme dyr. Ikke-invasive billeddannelsesmetoder, såsom bioluminescens, tillader gentagne billeddannelsessessioner på det samme dyr, men opnår ikke celleopløsning. For at løse dette metodehul har vi udviklet en platform til ikke-invasiv in vivo-billeddannelse af leversfæroider indpodet i det forreste kammer i museøjet. I arbejdsgangen beskrevet i denne undersøgelse genereres primære museleversfæroider in vitro og transplanteres ind i det forreste kammer i øjet hos modtagermus, hvor de transplanteres på iris. Hornhinden fungerer som et naturligt kropsvindue, hvorigennem vi kan afbilde de indpodede sfæroider ved konventionel konfokal mikroskopi. Sfæroiderne overlever i månedsvis i øjet, hvor cellerne kan studeres i sammenhænge med sundhed og sygdom, samt overvåges som reaktion på forskellige stimuli over gentagne billeddannelsessessioner ved hjælp af passende fluorescerende sonder. I denne protokol giver vi en oversigt over de nødvendige trin til implementering af dette billeddannelsessystem og forklarer, hvordan man bedst udnytter dets potentiale.
Introduction
Overvågningen af leverfunktionen hos pattedyr under sundhed og sygdom er begrænset af manglen på ikke-invasive in vivo-billeddannelsesteknikker med høj opløsning. Visualiseringen af dette organ hindres af dets utilgængelige placering, og for at sammensætte cellulære processer er in vivo-undersøgelser afhængige af ofring af dyr på forskellige tidspunkter. For at omgå denne billeddannelsesbegrænsning er meget arbejde afhængig af in vitro-modeller , hvor leverlignende mikrovæv visualiseres og studeres i et kontrolleret miljø.
I de senere år har udviklingen af tredimensionelle kultursystemer, såsom leversfæroider, hjulpet og avanceret leverforskning. Leversfæroider er flercellede aggregater, der efterligner mikromiljøet og komplekse celle-celleinteraktioner i levervæv til en vis grad1 og giver klare fordele i forhold til traditionelle enkeltlagskulturer 2,3. Leversfæroider bruges også som modeller for forskellige leversygdomme 4,5,6 og har været medvirkende til at forstå sygdomsmekanismer. Alligevel er de vigtigste begrænsninger ved de nuværende in vitro-levermodeller manglen på et fysiologisk in vivo-miljø og den begrænsede udnyttelsestid i kultur (ca. 20 dage)3. Leversfæroider er tidligere blevet transplanteret til forskellige steder in vivo, såsom under nyrekapslen7 eller intraperitonealt8, som ikke er tilgængelige for optisk billeddannelse. Intravital leverbilleddannelse er en avanceret teknik, der tilbyder celleopløsning i realtid. I øjeblikket er denne in situ leverbilleddannelse kun mulig på det udvendige organ, som er meget invasivt og ofte terminal9. Selvom montering af et abdominalt vindue ville tillade gentagne leverbilleddannelsessessioner, indebærer det kompleks kirurgi og efterbehandling.
For at udføre langsgående overvågning ved cellulær opløsning undersøgte vi transplantation af leversfæroider i det forreste kammer i øjet (ACE) hos mus, hvor det leverlignende væv er indpodet i et fysiologisk miljø, forbundet med kroppens stimuli og tilgængeligt for optisk billeddannelse. Hornhinden er et gennemsigtigt væv og fungerer som et vindue, hvorigennem mikrovæv indpodet på iris kan afbildes ikke-invasivt og langsgående ved konfokal mikroskopi. Her præsenterer vi en arbejdsgang for denne nyudviklede platform til in vivo-billeddannelse af leversfæroider10. Denne protokol er en trinvis vejledning til dens implementering, opdelt i (1) ekstraktion af primære museleverceller og in vitro-dannelse af leversfæroider, (2) transplantation af leversfæroider i ACE hos modtagermus og (3) in vivo-billeddannelse af indpodede leversfæroider i bedøvede mus. Desuden vil vi fremvise nogle af mulighederne og anvendelserne af denne billedbehandlingsplatform.
Protocol
Alle procedurer udført på dyr blev godkendt af Animal Experiment Ethics Committee på Karolinska Institutet.
1. Ekstraktion af primære museleverceller og generering af leversfæroider in vitro
- Præparation
- Til kanylering, leverresektion og isolering af primære leverceller fremstilles følgende sterile materialer eller engangsmaterialer ud over serologiske pipetter og centrifugeglas (figur 1A): peristaltisk pumpe, centrifuge med svingspand, absorberende pude, dissektionsmåtte, to buede pincet, kirurgisk saks, en 27 G sommerfuglenål, en 70 μm cellesi, en celleløfter, en 100 mm petriskål, celletællingskammer og 96-brønd, U-formede-bundmikroplader.
- Forbered de opløsninger, der anvendes i leverperfusion, isolering af primære leverceller og dannelse af leversfæroider som anført i tabel 1.
BEMÆRK: Fordøjelsesbufferen og gradientopløsningen skal tilberedes frisk. - Opsæt perfusionssystemet bestående af en peristaltisk pumpe, som leder opløsninger fra 42 °C vandbad til leveren (figur 1A). Vandbadets højere temperatur sikrer, at bufferne når leveren ved den optimale temperatur på 37 °C. Tilpas dette afhængigt af rørlængden og stuetemperaturen (RT).
- Til kanyleringen skal du montere en 27 G sommerfuglnål på enden af røret. Opbevar belægningsmediet, der blev brugt i de sidste isolationstrin, ved 4 °C.
- Procedure
- Følgende opløsninger forvarmes i 42 °C vandbad i 50 ml centrifugeglas: 40 ml PBS, 20 ml perfusionsbuffer og 12 ml fordøjelsesbuffer.
- For at rengøre og opvarme pumperørene cirkuleres ca. 20 ml af den forvarmede PBS.
- Skift slangen til perfusionsbufferen, prim røret og sommerfuglenålen, og indstil strømningshastigheden til 4 ml / min. Sørg for, at der ikke er bobler i slangen under bufferskift i hele protokollen.
- Aflive musen ved cervikal dislokation og brug nåle til at fastgøre lemmerne til dissekeringsbrættet.
- Våd mavepelsen med 70% ethanol og disseker den for at få adgang til fordøjelseskanalerne.
- Flyt tarmene til højre for at udsætte portalvenen og den ringere vena cava (figur 1B).
- Kannulere vena cava cirka halvvejs af dens længde med nålen i vandret position, sørg for, at den er stabil, og start pumpen.
- Når leveren begynder at blæse op, eller hvide prikker vises i de tættere lapper, skal du skære portalvenen for at lade blodet og perfusionsbufferen løbe ud.
- Leveren skal begynde at blanchere straks. Tilskynd rydning ved hjælp af buede tang til at klemme portalvenen med 5 s intervaller.
- Gentag trin 1.2.9, indtil leveren er gul og renset for blod (ca. 15-20 ml perfusionsbuffer).
- Stop den peristaltiske pumpe for at skifte slangen til fordøjelsesbufferen, og genstart pumpen. Når fordøjelsesbufferen når leveren, reduceres strømningshastigheden til 2,5 ml / min.
BEMÆRK: Den phenolrøde i fordøjelsesbufferen gør det muligt at skelne dens ankomst til leveren og muliggør justering af pumpeparametre under behandlingen. - For at tilskynde bufferen til at nå alle leverlobes og sikre korrekt fordøjelse, gentag trin 1.2.9 flere gange.
- Stop strømmen af den peristaltiske pumpe, når fordøjelsesbufferen er udtømt, eller leveren ser tilstrækkeligt fordøjet ud.
BEMÆRK: Fordøjelsesgraden kan overvåges visuelt ved forsigtigt at klemme leverlapperne med tang og kontrollere, om der vises små mærker på vævet. Leveren bliver også spinkel. - For at ekstrahere leveren skal du skære leverbåndene og forbindelserne i bughulen med det formål at fjerne det helt og placere det i petriskålen, der indeholder 10 ml koldbelægningsmedium (tabel 1).
- Efter fjernelse af galdeblæren skal du lave små klemmer på lapperne ved hjælp af tang og rive leverkapslen let. Ved at ryste leveren i skålen skal du observere celler, der hældes ud i mediet.
- Hold leveren stabil med tang, træk forsigtigt celleløfteren langs lapperne for at frigive cellerne.
BEMÆRK: Korrekt interlobulær fordøjelse vil føre til cellesuspension i medierne, ikke vævsfragmenter. - Ved hjælp af en serologisk pipette opsamles cellesuspensionen fra petriskålen og filtreres gennem 70 μm cellesien placeret på et 50 ml centrifugerør. Brug friske pletteringsmedier til at vaske skålen med fordøjede leverceller og overføre dem til filteret.
- Der centrifugeres ved 50 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere cellerne.
- Supernatanten fjernes, og der efterlades ca. 1 ml til at dække cellepelleten, hvirvles røret rundt for at resuspendere cellerne, og derefter tilsættes gradvist 10 ml koldbelægningsmedium.
- Tilsæt 10 ml gradientopløsning til cellesuspensionen og vend forsigtigt røret 10 gange.
- Der centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Pellet indeholder levedygtige leverceller beriget til hepatocytter, mens supernatanten indeholder døde celler og snavs. Supernatanten kasseres med en serologisk pipette, så der er ca. 1 ml tilbage, og pelletpen opslæmmes forsigtigt ved hvirvlende.
- Der tilsættes 20 ml koldbelægningsmedium til cellesuspensionen, og centrifuger ved 50 x g i 5 minutter ved 4 °C for at vaske gradientopløsningen af.
- Supernatanten fjernes, så der efterlades ca. 1 ml over pelletsen, og cellerne resuspenderes i 20 ml koldbelægningsmedium.
BEMÆRK: Her kan cellepillen komprimeres, så brug om nødvendigt en 10 ml serologisk pipette til forsigtigt at adskille cellerne. - Bestem manuelt cellenummeret og levedygtigheden ved hjælp af et celletællingskammer og Trypan Blue.
BEMÆRK: Hepatocytcellerne udfældes hurtigt i røret; For at resuspendere dem forsigtigt skal du vende røret et par gange. - Frø levercellerne i 200 μL / brønd af plating medium ved 1200 celler / godt ind i 96-brønd ultra-lav vedhæftningsplader.
BEMÆRK: Det optimale medievolumen pr. brønd er 200 μL; Det er dog muligt at så celler i 100 μL / brønd. - Drej pladerne ved 200 x g i 3 minutter for at samle cellerne i midten af brøndene.
- Inkuber cellerne (37 °C, 5% CO2) og lad dem danne sfæroider i 5 dage (figur 1C) naturligt.
- På dag 5 fjernes forsigtigt halvdelen af mediet i brønden og udskiftes med serumfrie vedligeholdelsesmedier (tabel 1). Gentag dette trin hver 48. time indtil dag 10, når leversfæroiderne er klar til at blive transplanteret.
BEMÆRK: Dannelsen af en kapsellignende struktur i dyrkede leversfæroider viser god aggregering og levedygtighed.
2. Transplantation af leversfæroider i øjets forreste kammer (ACE)
- Præparation
- Til transplantation af leversfæroider i ACE skal du sørge for at arrangere følgende ressourcer (figur 2A): stereomikroskop, isoflurananæstesienhed, induktionskammer, isofluran, varmepude, specialfremstillet metalbundplade, musehovedholder og gasmaske, tang fastgjort til det faste universalled, Hamilton 500 μL gevindstempelsprøjte, silikone, polyethylen og pumpeslange, specialfremstillet stump glaskanyle eller 24 G kateter, ethanol 70%, sterilt saltvand, sterile 23 G nåle, øjensalve (flydende paraffin og vaselin i forholdet 1:1), engangssprøjte på 1 ml og celleophængsskål 35 mm.
- Rengør Hamilton sprøjte, slange og kanyle ved at passere 70% ethanol og saltvand.
- Fyld Hamilton-sprøjten, slangen og glaskanylen med saltvand, og fastgør Hamilton-sprøjten til bænken i vandret position med tape (figur 2A).
- Brug en specialfremstillet stump glaskanyle.
- Forlæng en borosilikatglaskapillær ved hjælp af en totrins mikropipettetrækker til en indre diameter på >300 μm for at tillade aspiration af sfæroiderne.
- Affas og stump spidsen ved hjælp af en mikroelektrodefacetter, og udsæt kanylespidsen for en flamme i et par sekunder for at blødgøre kanterne.
BEMÆRK: Mikroelektrodefaskeren består af en roterende slibesten, der betjenes manuelt; Derfor er specifikke indstillinger ikke gældende.
- Alternativt konstrueres en kanyle ved hjælp af plastdelen af et 24 G-kateter (figur 2B).
- Forbered anæstesiisofluranenheden, og varm varmepuden op til 37 °C.
- Dæk spidserne af tangen, der er fastgjort til det faste universalled med et stykke polyethylenrør for at danne en løkke, som hjælper med at stabilisere øjet.
- Leversfæroiderne overføres fra 96-brøndpladen til en 35 mm celleopslæmningsskål med vedligeholdelsesmedier ved hjælp af en pipette og 200 μL spids.
- Procedure
- Bedøv musen i induktionskammeret med en dosis på 2,5% isofluran og 280 ml/min luft.
- Når musen er bevidstløs, sænk bedøvelsen til 1,8% isofluran og 280 ml / min luft, tilslut anæstesirøret til hovedholderen og overfør hurtigt dyret til varmepuden, placer næsen inde i hovedholderen.
- Immobiliser hovedet med skruerne, spring forsigtigt øjet ud af stikkontakten og fastgør det med tangen og læg en dråbe saltvand på begge øjne for at forhindre tørring.
- Brug Hamilton-sprøjten under stereoskopet til at aspirere og samle leversfæroiderne i spidsen af kanylen og lade dem hvile vandret på en ren overflade.
BEMÆRK: Aspirerende medier sammen med leversfæroiderne hjælper med at forhindre dem i at klæbe til kanylevæggene. - Punktering forsigtigt hornhinden med en 23 G nål og tør den sivende vandige humor med et væv. Hvis det er nødvendigt, for at gøre snittet bredere, skal du forsigtigt skubbe nålen sidelæns for at skære hornhinden.
BEMÆRK: En steril engangsnål bruges til at udføre hornhindepunktionen, så hornhinden desinficeres ikke før snit. - Tilsæt saltvandsdråber til øjet for at undgå tørring.
- Tag kanylen indeholdende leversfæroiderne og hold den lodret for at lade sfæroiderne trække mod spidsen af kanylen.
- Indsæt forsigtigt kanylen i hullet, og med skråningen rettet mod pupillen, brug Hamilton-sprøjten til langsomt at udvise leversfæroiderne i ACE (figur 2C).
BEMÆRK: Før kanylen fjernes, anbefales det at vente et par sekunder på, at væsketrykket i og uden for øjet justeres igen og undgår, at sfæroiderne slipper ud af øjet igen. - Fra ydersiden af hornhinden placeres leversfæroiderne omkring pupillen og væk fra snittet ved forsigtigt at stikke hornhinden med spidsen af kanylen (figur 2C).
- Vent ~ 5-10 minutter på, at leversfæroiderne sætter sig på iris, før du frigiver øjet fra tangen.
- Påfør vaselin øjensalve på det opererede øje, som hjælper med at smøre og helbrede hornhinden.
- Hvis det ønskes, fortsæt med at operere på det andet øje efter samme metode.
- Før du vækker musen, skal du administrere et smertestillende middel for at undgå postoperativt ubehag, for eksempel 0,1 mg / kg buprenorphin i sterilt saltvand, administreret subkutant.
BEMÆRK: Kun en dosis smertestillende midler blev administreret til musene, da de kom sig hurtigt efter denne lille procedure og ikke viste tegn på smerte eller ændret adfærd. Da denne procedure er meget hurtig (tager under 10 minutter) og kun forårsager mindre ubehag, kræver musene ingen postoperativ pleje, bortset fra den postoperative analgesi, der administreres, før dyret vækkes.
3. In vivo-billeddannelse af indpodede leversfæroider i ACE
- Præparation
- Forbered følgende materialer og instrumenter til ikke-invasiv in vivo-billeddannelse af leversfæroider indpodet i ACE (figur 3A): opretstående konfokalmikroskop, vanddyppemål med lang arbejdsafstand, isoflurananæstesienhed, induktionskammer, isofluran, varmepude, specialfremstillet metalbundplade, musehovedholder og gasmaske, tang fastgjort til det faste universalled, kunstig tåregel, øjensalve (flydende paraffin og vaselin i forholdet 1: 1).
- Valgfrie materialer omfatter injicerbare fluorescerende sonder, engangssprøjter og 27 G nåle til intravenøs haleinjektion.
- Procedure
- Bedøv musen i induktionskammeret med en dosis på 2,5% isofluran og 280 ml/min luft.
- Når musen er bevidstløs, sænk bedøvelsen til 1,8% isofluran og 280 ml / min luft, tilslut anæstesirøret til hovedholderen og overfør hurtigt dyret til varmepuden, placer næsen inde i hovedholderen.
- Immobiliser hovedet i hovedholderen ved hjælp af skruerne.
- Placer en dråbe kunstig tåregel på begge øjne for at forhindre tørring.
- På dette tidspunkt injiceres fluorescerende sonder intravenøst gennem halevenen og billedet umiddelbart efter.
- Vip hovedet, stik forsigtigt øjet ud af stikkontakten, og fastgør det med pincet og på plads under målet.
- Påfør en generøs mængde kunstig tåregel for at fylde mellemrummet mellem hornhinden og målet og fokusere på leversfæroiderne gennem okularet.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, skal du fjerne okularet på en af okularerne for at få ikke-forstørret syn og lettere lokalisere sfæroiderne på iris. - For at opnå billeddannelse i høj opløsning på trods af dyrets vejrtrækningsbevægelser skal du bruge 25x mål og følgende billedindstillinger: format 512 x 512 pixels, scanningshastighed på 600 Hz og en Z-stack tykkelse på 3 μm. Se detaljerede billedindstillinger i tabel 2.
BEMÆRK: Under hele billeddiagnostikken justeres anæstesikoncentrationen fra 1,6-2,2 ml/t isofluran for at opnå en lavvandet, kontrolleret vejrtrækningsrytme og derved minimere dyrets bevægelse. - Ved afslutningen af billedbehandlingssessionen behandles de afbildede øjne med vaselin øjensalve, før isofluran fjernes og dyret vækkes.
Representative Results
Primære leverceller, beriget til hepatocytter, blev isoleret fra museleveren ved to-trins kollaganaseperfusion ved hjælp af en peristaltisk pumpe til at cirkulere varme buffere gennem leveren ved at udnytte organets vaskulatur til at levere dissociationsenzymer til alle celler (figur 1A). Til dette blev den ringere vena cava kanyleret, og portalvenen blev skåret for at tillade gennemstrømning af buffere (figur 1B). Først blev en HBSS-baseret buffer skyllet gennem leveren for at rydde blodet. Hvis kanyleringen er vellykket, og der ikke er blodpropper, blancherer leveren og bliver gul inden for få sekunder. For det andet blev en fordøjelsesbuffer indeholdende Liberase enzymblandingen cirkuleret gennem leveren for at dissociere vævet til en enkeltcellesuspension. Cellerne blev manuelt talt og podet i 96-brønds ultra-lav-adhærens (ULA) plader, som muliggør selvmontering i sfæroider inden for få dage. På dag 5 dannes sfæroiderne, og den tynde kapsel, der grænser op til sfæroiderne, indikerer vellykket aggregering (figur 1C). Vi venter til dag 10 med at transplantere, hvorefter sfæroiderne er kompakte og har udviklet stærke celle-celleforbindelser. Antallet af seedede celler pr. brønd bestemte størrelsen af leversfæroiden med henholdsvis 1000, 1200 og 1500 celler/godt ydende sfæroider på henholdsvis 238 μm ± 10 μm, 248 μm ± 17 μm og 298 μm ± 19 μm (gennemsnit ± SD) diametre (figur 1C, D). Til transplantation vælger vi sfæroider med en diameter på ca. 250 μm af følgende grunde: (1) sfæroidernes størrelse bør ikke være for stor til at undgå hypoxi og nekrotisk kerne, men bør indeholde nok celler til at understøtte celle-cellekommunikation og tillade transplantatombygning i øjet, (2) vægten af sfæroider af denne størrelse giver dem mulighed for at drage mod iris og forbedre deres engraftment, (3) Denne størrelse er passende i forhold til transplantation af 5-10 sfæroider pr. museøje.
Transplantationsoperationen kræver en manuel gevindsprøjte forbundet til en glaskanyle (figur 2A). Glaskanylen består af en borosilikatglaskapillær, der er modificeret internt for at have en fin stump spids ved hjælp af en mikropipettetrækker og affasker. En enklere alternativ kanyle kan oprettes ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt plastkateter, der er forbundet med sprøjteslangen og stabiliseret i en pipettespids (figur 2B). Operationen består af podning af leversfæroider i ACE gennem et snit i hornhinden (figur 2C). Sfæroiderne blev placeret på pupillens grænser for at gøre dem bedre tilgængelige for billeddannelse og undgå, at de bevæger sig ind i øjenvinklen. Albinomus blev brugt til transplantation, da deres ikke-pigmenterede iris tillader in vivo-billeddannelse af de indpodede leversfæroider. Modtagermus blev transplanteret i begge øjne med 7-10 sfæroider / øje, og stereoskopiske billeder blev taget 3 dage efter transplantation (post-Tx) samt 1 uge og 1 måned efter Tx for at dokumentere hornhindeheling og sfærisk engraftment succes (figur 2D). Det skal bemærkes, at ændringen i udseendet af leversfæroiderne i ACE mellem når de er nytransplanterede og fuldt indpodede, skyldes afviklingen af transplantatet på iris såvel som væksten af et monolag af irisceller over sfæroiden. Engraftment succesrate for leversfæroider i ACE er 70% (n = 9 øjne hos både mandlige og kvindelige mus) (figur 2E). De første dage efter Tx er de mest kritiske for overlevelse og indgravering, sandsynligvis på grund af modtagerdyret, der gnider øjnene og løsner sfæroiderne, før hornhinden er helet. Størrelsen af leversfæroiderne adskiller sig ikke signifikant efter Tx, og ændringer i form tilskrives transplantatombygning og engraftment (figur 2F). Ved 1 måned efter Tx blev alle indpodede sfæroider, der var til stede på iris, vaskulariseret og innerveret, som vist ved immunofluorescensfarvning (figur 2G).
Ikke-invasiv in vivo-billeddannelse udføres på bedøvede modtagermus ved hjælp af et opretstående konfokalmikroskop og langdistancedyppemål (figur 3A, tabel 2). Fluorescensbilleddannelsen i ACE kan opnås gennem forskellige tilgange, som vist i figur 3B. Injektionen af fluorescerende sonder i cirkulationen af modtagermusen tillader visualisering af forskellige celletyper og strukturer inden for sfæroiderne. Vi brugte lectin til at markere blodkar (figur 3C), CMFDA til at observere galdekanaliculi-netværket (figur 3D) og pHrodo-LDL, som bekræftede aktiv LDL-optagelse i sfæroidceller (figur 3E). Leversfæroider genereret fra reportermusemodeller kan også bruges. Albumin-Cre: tdTomatsfæroider tillod mærkning og sporing af hepatocytter (figur 3F), og sfæroider, der udtrykte biosensoren Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI), blev brugt til at visualisere cellecyklusdynamik ved enkeltcelleopløsning (figur 3G). Endelig kan leversfæroider genetisk modificeres in vitro før transplantation, og i tilfælde af adeno-associeret virus (AAV)-GFP-transduktion blev ekspressionen observeret in vivo i over 6 måneder (figur 3H).
Figur 1: Dyrkning af primære musehepatocytter og dannelse af leversfæroider. A) Materiale og udstyr, der anvendes til isolering af primære hepatocytter hos mus: 1. Isolationsbuffere; 2. Vandbad; 3. Peristaltisk pumpe; 4. Petri skål; 5. Celle sil; 6. Absorberende pude; 7. Dissektionsmåtte; 8. Celleløfter; 9. Sommerfuglnål 27 G; 10. Dissektionsværktøjer. (B) Bughulen under operationen: vena cava kanyleres og perfuseres, og portalvenen skæres for at tillade gennemstrømning af bufferne. (C) Brightfield-billeder af dannelsen af hepatiske sfæroider in vitro ved 0 (d0), 5 (d5) og 10 (d10) dage efter såning, skalastænger = 200 μm. (D) Leversfæroidstørrelse ved forskellige cellesåningskoncentrationer, n = 21 sfæroider. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Transplantation og indkapsling af leversfæroider i ACE hos mus. A) Materialer og udstyr, der anvendes til transplantation (Tx) af leversfæroider i ACE: 1. Leversfæroider i kulturskål; 2. Sterilt saltvand; 3. Øjensalve; 4. Nåle 23 g; 5. Kanyle; 6. Hamilton sprøjte; 7. Anæstesi gasrør; 8. Hovedholder og gasmaske; 9. Varmepude; 10. Specialfremstillet metalbundplade; 11. Tang og fast universalled. (B) Opsætning af kanyle og Hamilton-sprøjte: 1. Glaskanyle forbundet til Hamilton-sprøjten via Portex-slange og en 27G-nål; 2. Glaskanyle er forbundet til Portex-slangen via yderligere segmenter af silikonerør og PharMed-slanger; 3. Alternativ samlet plastkanyle; 4. Dele, der danner plastkanylen: 24G BD Insyte plastkateter forbundet via PharMed-rør og beklædt med en afskåret 10 μl pipettespids for stabilitet og greb. (C) Illustration af Tx-kirurgiske trin: 1. Sfæroider opsamles i kanylen; 2. Hornhinden punkteres med en nål; 3. Kanylen indsættes i snittet, og sfæroiderne frigives i ACE; 4. Fra ydersiden af øjet er sfæroiderne placeret tæt på eleven og væk fra snittet. (D) Stereoskopiske billeder af leversfæroider (sph) i museøjet på operationsdagen og 3-, 7- og 30-dage efter Tx. Pile angiver levedygtige sfæroider. (E) Leversfæroid (størrelse på 1200 celler / brønd) engraftment rate post-Tx, n = 9 øjne i 6 modtagemus. (F) Størrelsen af leversfæroider i kultur før transplantation (in vitro, n= 20 sfæroider fra et enkelt præparat) og 1 måned efter Tx i ACE (in vivo, n= 16 sfæroider i 3 recipientmus), beregnet ved gennemsnit af lodrette og vandrette diametre. (G) Immunofluorescensfarvning af indpodede leversfæroider 2 måneder efter Tx, der viser vaskularisering (CD31, lyserød, stiplet linje afgrænser sfærisk masse) og sympatisk innervering (tyrosinhydroxylase (TH), orange), skalabjælke = 100 μm. Data for panel F er tilpasset med tilladelse fra Lazzeri-Barcelo et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Noninvasiv intraokulær in vivo-billeddannelse af indpodede leversfæroider. A) Materiale og udstyr, der anvendes til in vivo ACE-billeddannelse: 1. Opretstående laserscanning konfokalmikroskop; 2. Mørk boks; 3. Motoriseret XYZ-trin; 4. Dypningsmål; 5. Hovedholder og gasmaske; 6. Tang og fast universalled; 7. Varmepude; 8. Specialfremstillet metalbundplade. (B) Diagram, der viser forskellige metoder, der anvendes til in vivo-billeddannelse af fluorescerende aflæsninger i leversfæroider, der er podet i øjet. (C-H) Repræsentative billeder af ACE-leversfæroider under in vivo-billeddannelse ved konfokal mikroskopi. Backscatter-signalet bruges til at observere sfæroidvolumen og struktur; (C) Blodkar mærket ved i.v. injektion af fluorescerende lectin, skalastang = 100 μm; D) Galdecanaliculi-netværk mærket ved injektion af fluorescerende CMFDA, skalastang = 50 μm E) LDL-optagelse ved injektion af fluorescerende pHrodo-LDL-sonde, skalastang= 100 μm (F) Td-tomatekspressive hepatocytter, pilespidser angiver kerner og stjerner indikerer intrasfærisk vaskulatur, skalabjælke = 50 μm; (G) Overvågning af cellecyklusdynamikken i FUCCI-ekspressive leversfæroider, skalastænger = 50 μm (hovedbillede) og 20 μm (opblæsning). (H) leversfæroider transduceret in vitro med AAV8-GFP før Tx og afbildet i øjet 6 måneder efter Tx, skalabjælke = 50 μm. Billedet i panel G er tilpasset med tilladelse fra Lazzeri-Barcelo et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Opløsninger anvendt til isolering af primære musehepatocytter. Sammensætning af opløsninger og buffere, der er nødvendige til isolering af musehepatocyt. Komponenterne Fordøjelsesbuffer og Gradientopløsning skal blandes friske på isolationsdagen. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2. Konfokale Leica SP5-mikroskopindstillinger, der anvendes til intraokulær in vivo-billeddannelse af leversfæroider. Tabellen er tilpasset med tilladelse fra Lazzeri et al.10. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Denne protokol beskriver en ny platform til intraokulær in vivo-billeddannelse af leversfæroider indpodet i ACE. ACE er tidligere blevet brugt som transplantationssted for andre organafledte mikrovæv, såsom bugspytkirteløer11,12, på grund af dets unikke engraftment-mikromiljø, der er rig på kar, nerver og ilt og adgangen til billeddannelse gennem hornhinden. Mens intravital leverbilleddannelse muliggør visualisering af celler og processer in situ, er langsgående overvågning ikke mulig. Leverbilleddannelse gennem et abdominalvindue indebærer kompleks kirurgi, og organets bevægelse i kroppen gør enkeltcellesporing over tid vanskelig. Derfor muliggør denne nye billeddannelsesmetode ikke-invasiv, langsgående overvågning af leverceller ved enkeltcelleopløsning.
Denne protokol er opdelt i tre dele. For det første er isoleringen af primære hepatocytter via to-trins kollagenaseperfusion, tilpasset fra Charni-Natan et al.13, med den forskel, at vi udfører leverperfusionen på den døde mus i stedet for de bedøvede levende dyr. Denne variation giver visse fordele, såsom færre etiske overvejelser og undgåelse af anæstesirester i organismen. I dette arbejde genererer vi leversfæroider fra den hepatocytberigede fraktion af isolationen, men dette udelukker ikke potentialet til at isolere andre ikke-parenkymale cellepopulationer ved hjælp af andre specialiserede protokoller til fremstilling af cokultursfæroider med forskellig sammensætning14,15.
Den anden del af denne protokol involverer transplantation af leversfæroiderne i ACE hos modtagermus. Dette er en hurtig (under 10 min) og simpel operation udført på bedøvede mus og kræver ingen postoperativ behandling. Hornhinden punkterer sig selv og heler over 3-5 dage. Lejlighedsvis, under helingsprocessen, observeres en vis tåge omkring snittet, men dette rydder inden for få dage. Vi har ikke oplevet tilfælde af anterior synechia i operationshavenes øjne. Vi udfører transplantationsprocedurerne i et rent, men udendørs laboratorium og uden problemer med infektioner i de opererede øjne. Podning og indkapsling af sfæroider i øjet kompromitterer ikke synet eller ændrer modtagerdyrets adfærd. I denne protokol bruger vi isofluranbedøvelse til både transplantationskirurgi og in vivo-billeddannelse , hvilket tolereres godt hos mus. På grund af sin dosisafhængige virkning kan den let justeres gennem procedurerne og giver fordelen ved at reducere sove- og opvågningstider. Imidlertid kan alternative injicerbare anæstetika anvendes. Efter transplantation tillader vi generelt 1 måned for sfæroider at transplantere fuldt ud, blive vaskulariseret og innerveret, før vi udfører behandlingsinterventioner og in vivo-billeddannelse . Vi har også vist, at transplantation og engraftment er mulig ved hjælp af humane leversfæroider og immunkompromitterede modtagermus10.
Den tredje del af denne metode er in vivo-billeddannelse af de indpodede leversfæroider i ACE. Denne protokol beskriver in vivo-billeddannelsesopsætningen, der bruger mikroskopiudstyr, der almindeligvis findes i forskningsbilleddannelsesfaciliteter. Desuden er de specialiserede materialer, såsom musehovedholderen og plastkanylen, nu kommercielt tilgængelige. Med denne billeddannelsesopsætning er vi i stand til at fange z-sektioner og opnå en tredimensionel rekonstruktion af sfæroidarkitekturen, afhængigt af dybden af laserpenetration og fluorescensdetektion. Overvågning af cellulær funktion i de indpodede leversfæroider er afhængig af visualisering af fluorescerende proteiner, der rapporterer om celletyper, cellulære funktioner og dynamik. Således kan denne billeddannelsesplatform udnyttes ved hjælp af forskellige modaliteter, alene eller i kombination: (1) Fluorescerende sonder kan administreres intravenøst, fx antistoffer til mærkning og sporing af celler samt funktionelle farvestoffer; (2) Leversfæroider kan genereres fra celler isoleret fra reportermusemodeller, der udtrykker leverspecifikke fluorescerende proteiner, f.eks. FUCCI-leversfæroider, der rapporterer om cellecyklusdynamik; (3) Dannelsen af leversfæroider in vitro kan kombineres med transfektion eller transduktion for at udstyre sfæroiderne med fluorescerende proteiner og biosensorer. F.eks. adeno-associerede vira. I vores eksperimentelle indstillinger og ved at bruge en enkelt foton til excitation er billeddybden, der er mulig at opnå, ca. 60-100 μm. Dette afhænger imidlertid af lasereffekten og multifotonbilleddannelsens tilgængelighed, fluorescenssondens emissionsegenskaber og følsomhed af detektorerne samt øjenvinklen, hvori sfæroiden er indpodet. Efter billedbehandling erhvervelse, downstream billedanalyse kan udføres ved hjælp af populære programmer som Image J og Imaris. For eksempel i tilfælde af FUCCI-reporteren kan cellecyklusaktive celler i grønt tælles og kontrasteres til antallet af samlede røde blodlegemer for at vurdere cellecyklusaktivitet inden for den indpodede sfæroide. Derudover tillader ACE-billeddannelsesplatformen, at stoffer påføres øjet (i form af øjendråber) eller injiceres direkte i ACE for at behandle transplantatet og overvåge dets reaktion. Post mortem kan de transplanterede sfæroider let udtages ved manuel mikrodissektion og kan give værdifuld information ved ex vivo-teknikker, såsom immunofluorescensfarvning, transkriptomisk analyse osv.10.
Denne teknik har visse begrænsninger. Den første er, at fra vores erfaring skal modtagermusene være albino, dvs. have ikke-pigmenteret iris. Ved indgravering bliver leversfæroiderne dækket af et monolag af irisceller, hvilket ikke påvirker sfæroidernes levedygtighed eller funktion, men pigmentet i iriscellerne forhindrer billeddannelse. En anden overvejelse er stabiliteten under intraokulær billeddannelse hos bedøvede mus. Under in vivo-billeddannelsessessionerne skal dyrets anæstesikoncentration og vejrtrækning overvåges nøje for at minimere bevægelse. Ikke desto mindre er vi ved hjælp af de billedindstillinger, der er angivet her, i stand til at opnå billeddannelse i høj opløsning på enkeltcelleniveau.
For at opsummere beskriver denne protokol implementeringen af en ikke-invasiv in vivo-billeddannelsesplatform af leverlignende væv indpodet i musens øjne. Vi bruger nemme procedurer, fælles udstyr og materialer til overkommelige priser, hvilket gør det til en opnåelig tilgang for mange efterforskere. Denne model kombinerer fordelene ved in vitro 3D-leversfæroider med in vivo-miljøet og optisk tilgængelighed fra ACE for at skabe en værdifuld platform til at studere leverfysiologi og patologi i grundforskning og prækliniske indstillinger.
Disclosures
P-OB er medstifter og administrerende direktør for Biocrine AB, IBL, og BL er konsulenter for Biocrine AB.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den svenske diabetesforening, midler fra Karolinska Institutet, Det svenske forskningsråd, Novo Nordisk Foundation, The Family Erling-Persson Foundation, Strategic Research Program in Diabetes ved Karolinska Institutet, The Family Knut and Alice Wallenberg Foundation, The Jonas & Christina af Jochnick Foundation, Swedish Association for Diabetology og ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. Figurtegningerne blev skabt af FL-B ved hjælp af BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
| AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
| Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
| Absorbent pad | Attends | 203903 | |
| Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
| BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
| Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
| Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
| FBS | Gibco | N/A | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
| Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
| HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| Isoflurane | Baxter | N/A | |
| Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
| Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
| Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
| Oculentum simplex | APL | N/A | |
| PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
| PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
| PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
| pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
| Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
| Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
| Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
| Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
| Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
| Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
| Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
| Viscotears | Novartis | N/A | |
| William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |
References
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Sci Rep. 6, 25187 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Oliva-Vilarnau, N., Vorrink, S. U., Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. A 3D cell culture model identifies Wnt/beta-catenin mediated inhibition of p53 as a critical step during human hepatocyte regeneration. Adv Sci (Weinh). 7 (15), 2000248 (2020).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Sci Rep. 8 (1), 14297 (2018).
- Lauschke, V. M., Shafagh, R. Z., Hendriks, D. F. G., Ingelman-Sundberg, M. 3D primary hepatocyte culture systems for analyses of liver diseases, drug metabolism, and toxicity: Emerging culture paradigms and applications. Biotechnol J. 14 (7), e1800347 (2019).
- Shibuya, K., et al. The efficacy of the hepatocyte spheroids for hepatocyte transplantation. Cell Transplant. 30, 9636897211000014 (2021).
- Hamazaki, K., Doi, Y., Koide, N. Microencapsulated multicellular spheroid of rat hepatocytes transplanted intraperitoneally after 90% hepatectomy. Hepatogastroenterology. 49 (48), 1514-1516 (2002).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Lazzeri-Barcelo, F., et al. Intraocular liver spheroids for noninvasive high-resolution in vivo monitoring of liver cell function. Nat Commun. 15 (1), 767 (2024).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Baze, A., et al. Three-dimensional spheroid primary human hepatocytes in monoculture and coculture with nonparenchymal cells. Tissue Eng Part C Methods. 24 (9), 534-545 (2018).
- Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).
