Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Modellering af ligander til kort afledt af elektronkryomikroskopi

Published: July 19, 2024 doi: 10.3791/66310
Automatic Translation
*1, *2, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol introducerer de tilgængelige værktøjer til modellering af småmolekyleligander i cryoEM-kort over makromolekyler.

Abstract

Dechifrering af protein-ligand-interaktionerne i et makromolekylært kompleks er afgørende for at forstå den molekylære mekanisme, underliggende biologiske processer og lægemiddeludvikling. I de senere år er kryogen prøveelektronmikroskopi (cryoEM) dukket op som en kraftfuld teknik til at bestemme makromolekylers strukturer og til at undersøge ligandbindingstilstanden ved næsten atomar opløsning. Identifikation og modellering af ikke-proteinmolekyler i cryoEM-kort er ofte udfordrende på grund af anisotropisk opløsning på tværs af molekylet af interesse og iboende støj i dataene. I denne artikel introduceres læserne til forskellige software og metoder, der i øjeblikket bruges til ligandidentifikation, modelopbygning og forfining af atomare koordinater ved hjælp af udvalgte makromolekyler. En af de enkleste måder at identificere tilstedeværelsen af en ligand på, som illustreret med enolase-enzymet, er at trække de to kort opnået med og uden liganden. Den ekstra tæthed af liganden vil sandsynligvis skille sig ud i forskelskortet selv ved en højere tærskel. Der er tilfælde, som vist i tilfældet med metabotrop glutamatreceptor mGlu5, hvor sådanne simple forskelskort ikke kan genereres. Den nyligt introducerede metode til at udlede Fo-Fc udeladelseskortet kan tjene som et værktøj til at validere og demonstrere tilstedeværelsen af liganden. Endelig, ved hjælp af den velundersøgte β-galactosidase som eksempel, analyseres effekten af opløsning på modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i cryoEM-kort, og et syn på, hvordan cryoEM kan bruges til lægemiddelopdagelse, præsenteres.

Introduction

Celler udfører deres funktioner ved at udføre utallige kemiske reaktioner samtidigt og uafhængigt, hver omhyggeligt reguleret for at sikre deres overlevelse og tilpasningsevne som reaktion på miljømæssige signaler. Dette opnås ved molekylær genkendelse, som gør det muligt for biomolekyler, især proteiner, at danne forbigående eller stabile komplekser med andre makromolekyler såvel som små molekyler eller ligander1. Således er protein-ligand-interaktioner grundlæggende for alle processer i biologien, som omfatter regulering af proteinekspression og aktivitet, enzymers genkendelse af substrater og cofaktorer, samt hvordan celler opfatter og videresender signaler 1,2. En bedre forståelse af de kinetiske, termodynamiske og strukturelle egenskaber af protein-ligand-komplekset afslører det molekylære grundlag for ligandinteraktion og letter også rationelt lægemiddeldesign ved at optimere lægemiddelinteraktion og specificitet. En økonomisk og hurtigere tilgang til at studere protein-ligand-interaktion er at bruge molekylær docking, som er en beregningsmetode, der virtuelt screener en bred vifte af små molekyler og forudsiger bindingstilstanden og affiniteten af disse ligander til målproteiner3. Imidlertid giver eksperimentelle beviser fra højopløselige strukturer bestemt ved røntgendiffraktion (XRD), kernemagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) det væsentlige bevis for sådanne forudsigelser og hjælper med udviklingen af nyere og mere effektive aktivatorer eller hæmmere for et givet mål. Denne artikel bruger forkortelsen 'cryoEM', som teknikken almindeligvis omtales. Der er dog en igangværende debat om valg af den korrekte nomenklatur, og for nylig er udtrykket kryogeniskprøve Electron Microscopy (cryoEM) blevet foreslået for at indikere, at prøven er ved kryogen temperatur og afbilledet med elektroner4. På samme måde er kortene afledt af cryoEM blevet kaldt elektronpotentiale, elektrostatisk potentiale eller Coulomb-potentiale, og for nemheds skyld bruger vi her cryoEM-kort 5,6,7,8,9,10.

Selvom XRD har været guldstandardteknikken til højopløsningsstrukturbestemmelse af protein-ligandkomplekser, har11 cryoEM efter opløsningsrevolution taget fart, som indikeret af stigningen i Coulomb-potentialekort eller kryoEM-kort deponeret i Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 i løbet af de sidste par år14. På grund af fremskridt inden for prøveforberedelse, billeddannelse og databehandlingsmetoder steg antallet af Protein Data Bank (PDB)14-aflejringer, der anvender cryoEM, fra 0,7 % til 17 % mellem 2010 og 2020, hvor ca. 50 % af de rapporterede strukturer i 2020 blev bestemt ved 3,5 Å opløsning eller bedre15,16. CryoEM er hurtigt blevet vedtaget af det strukturelle biologiske samfund, herunder medicinalindustrien, da det tillader undersøgelse af fleksible og ikke-krystallinske biologiske makromolekyler, især membranproteiner og multiproteinkomplekser, ved næsten atomar opløsning, overvinde krystallisationsprocessen og opnå veldiffrakterende krystaller, der kræves til højopløsningsstrukturbestemmelse ved XRD.

Nøjagtig modellering af liganden i cryoEM-kortet er altafgørende, da det fungerer som en plan for protein-ligandkomplekset på molekylært niveau. Der er flere automatiserede ligandbygningsværktøjer, der bruges i røntgenkrystallografi, der afhænger af formen og topologien af ligandtætheden for at passe eller bygge liganden ind i elektrontætheden 17,18,19,20. Ikke desto mindre, hvis opløsningen er lavere end 3 Å, har disse tilgange en tendens til at give mindre ønskværdige resultater, fordi de topologiske træk, som de er afhængige af for at blive anerkendt og opbygget, bliver mindre definerede. I mange tilfælde har disse metoder vist sig at være ineffektive til nøjagtig modellering af ligander til kryoEM-kort, da disse kort er blevet bestemt i området lav til medium opløsning, typisk mellem 3,5 Å-5 Å17.

Det første trin i 3D-strukturbestemmelse af et protein-ligandkompleks ved cryoEM involverer enten samoprensning af liganden med proteinet (når liganden har en høj bindingsaffinitet til proteinet) eller inkubering af proteinopløsningen med liganden i en bestemt varighed før gitterforberedelse. Efterfølgende placeres et lille prøvevolumen på et plasmarenset hullet TEM-gitter, efterfulgt af flashfrysning i flydende ethan og til sidst billeddannelse med en kryo-TEM. 2D-projektionsbillederne fra hundredtusinder til millioner af individuelle partikler er gennemsnittet for at rekonstruere et 3-dimensionelt (3D) Coulomb-potentialekort over makromolekylet. Identifikation og modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i disse kort udgør betydelige udfordringer i mange tilfælde på grund af den anisotrope opløsning på tværs af kortet (dvs. opløsningen er ikke ensartet på tværs af makromolekylet), fleksibilitet i det område, hvor liganden er bundet, og støjen i dataene. Mange af de modellerings-, forfinings- og visualiseringsværktøjer, der blev udviklet til XRD, bliver nu tilpasset til brug i cryoEM til samme formål 18,19,20,21. I denne artikel præsenteres en oversigt over forskellige metoder og software, der i øjeblikket bruges til at identificere ligander, bygge modeller og forfine koordinaterne afledt af cryoEM. En trin-for-trin protokol er blevet leveret for at illustrere de processer, der er involveret i modellering af ligander ved hjælp af specifikke protein-ligandkomplekser med varierende opløsning og kompleksitet.

Det første trin i modellering af ligander i cryoEM-kort inkluderer identifikation af ligandtætheden (ikke-protein) i kortet. Hvis ligandbinding ikke inducerer nogen konformationsændring i proteinet, så fremhæver beregning af et simpelt forskelskort mellem protein-ligandkomplekset og apo-proteinet i det væsentlige regionerne med ekstra tæthed, hvilket tyder på tilstedeværelsen af liganden. Sådanne forskelle kan observeres med det samme, da det kun kræver to kort, og selv mellemliggende kort under 3D-forfiningsprocessen kan bruges til at kontrollere, om liganden er til stede. Derudover, hvis opløsningen er høj nok (<3,0 Å), kan forskelskortet også give indsigt i placeringen af vandmolekyler såvel som ioner, der interagerer med liganden og proteinresterne.

I mangel af apo-protein-kortet er det nu muligt at bruge Servalcat22, som er tilgængeligt som et selvstændigt værktøj og også er blevet integreret i CCP-EM-softwarepakken23,24 som en del af Refmac-forfiningen og i CCP4 8.0 version25,26. Servalcat tillader beregning af et FSC-vægtet forskelskort (Fo-Fc) ved hjælp af de uskarpe halvafbildninger og apoproteinmodellen som input. Fo-Fc udeladelseskortet repræsenterer forskellen mellem det eksperimentelle kort (Fo) og det kort, der er afledt af modellen (Fc). I mangel af en ligand i modellen antyder en positiv tæthed i et Fo-Fc-kort, der overlapper med det eksperimentelle EM-kort, typisk tilstedeværelsen af liganden. Antagelsen her er, at proteinkæden passer godt ind på kortet, og den resterende positive tæthed angiver ligandens placering. Det er dog vigtigt omhyggeligt at undersøge, om den positive tæthed stammer fra modelleringsunøjagtigheder, såsom den forkerte rotamer af en proteinsidekæde.

Det andet trin involverer opnåelse eller oprettelse af en kartesisk koordinatfil af liganden med veldefineret geometri fra den tilgængelige kemiske information. Standardligander (f.eks. ATP og NADP+), der allerede er tilgængelige i CCP4-monomerbiblioteket, kan bruges til forfining ved at hente koordinat- og geometrifilerne via deres monomertiltrædelseskode. For ukendte eller ikke-standardiserede ligander er der dog forskellige værktøjer til rådighed til at oprette geometrifilerne. Nogle af eksemplerne omfatter eLBOW27 - (elektronisk ligandbygger og optimeringsarbejdsbord) i Phoenix28, Lidia - et indbygget værktøj i Coot29, JLigand/ACEDRG 30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-et modul af Glide i Schrödinger-pakken. Ligandkoordinatfilen monteres derefter i tætheden, styret af både det eksperimentelle kryoEM-kort og differenskortet i Coot. Dette efterfølges af forfining i det virkelige rum i Phoenix28 eller gensidig forfining i Refmac33. En Linux-arbejdsstation eller en bærbar computer udstyret med et godt grafikkort og ovennævnte software er påkrævet. De fleste af disse programmer er inkluderet i forskellige suiter. CCP-EM24 og Phenix28 er frit tilgængelige for akademiske brugere og inkluderer en række værktøjer, der bruges i denne artikel, herunder Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine osv. På samme måde giver Chimera37 og ChimeraX38 gratis licenser til akademiske brugere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Modellering af phosphoenolpyruvat (PEP) i enolase fra Mycobacterium tuberculosis

  1. Identifikation af ligandtæthed i kryoEM-kortet over PEP-enolase-komplekset
    1. Download de uskarpe halvkort (emd_30988_additional_1.map og emd_30988_additional_2.map) af apo-enolase fra de yderligere data i EMDB (se materialefortegnelsen).
    2. Åbn ChimeraX (se materialefortegnelsen). Åbn halvkortene af apo-enolase ved at klikke på Åbn fra værktøjslinjen og vælge filnavnene. Skriv vop add #1 #2 i kommandolinjen for at kombinere begge halvkort for at få det apo-enolase uskarpe kort.
      BEMÆRK: #1 og #2 betegner de to halve afbildninger for apo-enolase-enzymet, som nævnt i trin 1.1.1.
    3. Omdøb det kombinerede kort (ChimeraX-kort-id: #3) ved at skrive omdøb #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Farvelæg kortet gråt fra modelpanelet. Kortet indikerer, at enolase er oktamerisk i opløsningen med D4-symmetri.
    4. Gentag trin 1.1.1-1.1.3 ved hjælp af følgende halvkort emd_30989_additional_1.map (kort-ID: 4) og emd_30989_additional_2.map (kort-ID: 5) for at opnå PEP-enolase-unsharpened-map (kort-ID: #6).
    5. For at beregne et forskelskort skal du først tilpasse de to kort (PEP-enolase og apo-enolase uskarpe kort fra trin 1.1.3 og trin 1.1.4) på hinanden ved at klikke på Tilpas (kort i kort) i kortpanelet (værktøjslinjen) i ChimeraX.
      BEMÆRK VENLIGST: Normalisering udføres ikke mellem de to kort. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt med normalisering for at bringe kortene i samme skala.
    6. Træk PEP-enolase-kortet fra apo-enolase-kortet ved at skrive vop subtract #6 #3 på kommandolinjen.
      BEMÆRK: #6 = PEP-enolase uskarpt kort, #3 = Apo-enolase uskarpt kort.
    7. Farvelæg det subtraherede kort (kort-ID:7) med grønt, der angiver positiv tæthed (i henhold til konventionen i røntgenkrystallografi)39.
    8. Download koordinaterne for M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) fra Protein Data Bank (PDB), klik på åbn fra værktøjslinjen, og vælg filnavnet.
    9. Omdøb modellen til 7e4x.pdb ved at skrive omdøb #8 Apo_enolase.pdb på kommandolinjen. #8 betegner Apo_enolase.pdb i ChimeraX.
    10. Vælg modellen i modelpanelet. Klik på Højre mus fra værktøjslinjen. Klik på Flyt molekyle for at placere modellen i nærheden af PEP-enolase-kortet (#6) og justere modellen i forhold til kortet. Tilpas denne model til PEP-enolase-unsharpened-map ved at skrive fit #8 i #6 på kommandolinjen. Her er kortet nummereret 6, og modellen er nummereret 8.
      BEMÆRK VENLIGST: I nogle tilfælde er den lokale pasform i ChimeraX muligvis ikke nok til at justere modellen. I disse tilfælde kan et yderligere trin af global tilpasning (DockinMap, se materialetabel) udføres i Phenix.
    11. Gem den monterede model ved at skrive save Apo-enolase.pdb #8 på kommandolinjen.
  2. Modellering og forfining af PEP i det B-faktorskærpede kryoEM-kort over PEP-enolase-komplekset
    1. Åbn "coot" (se materialefortegnelse) fra terminalen ved at skrive ./Coot &.
    2. Vis "Apo-enolase.pdb" ved at klikke på Fil > åbne koordinater Apo-enolase.pdb. Koordinatfilen vises med bindinger (farve for atom).
    3. Download det PEP-bundne Enolase-skærpede kort, dvs. emd_30989.map fra EMDB. Vis det samme ved at klikke på Filer > Åbn kort > emd_30989.map . Indstil tærsklen til 7.00 σ ved at rulle den midterste museknap.
    4. Find ikke-modellerede blobs ved at klikke på Valider > ikke-modellerede blobs > Find blobs.
    5. Find den umodellerede ligandtæthed nær resterne af det aktive sted, Ser 42, Lys-386 og Arg-364 i enolasemodellen.
    6. Hent PEP-monomermodelfilen fra Coot-monomerbiblioteket ved at klikke på File > Get Monomer og indtaste PEP som 3-bogstavskode.
    7. Flyt PEP-molekylet til tætheden ved hjælp af indstillingen Roter/Oversæt-zone/Kæde/Molekyle i sidebjælkemenuen. Brug real-space raffinement i Coot til at tilpasse PEP-molekylet i tætheden ved at klikke på Real Space Refine Zone i sidebjælkemenuen. Flet den monterede ligand med Apo-enolase.pdb ved at bruge fletmolekyleindstillingen på redigeringsfanen . Gem modellen som PEP-Enolase.pdb.
      BEMÆRK VENLIGST: Man kan også bruge ligand> Jiggle-Fit Ligand mulighed for også at passe til liganden.
    8. For at tilføje ligander til resten af monomererne i koordinatfilen skal du klikke på Beregn > NCS-værktøjer > NCS-ligander. Et separat vindue med navnet Find NCS-relaterede ligander vises. For indstillingen Protein med NCS skal du vælge koordinatfilen Apo-enolase.pdb og Kæde-ID A som NCS-masterkæde.
      1. For det molekyle, der indeholder ligand, skal du vælge Apo-enolase.pdb som koordinatfil og kæde-ID, J og restnummer 1 til 1. Klik på Find kandidatstillinger. Et vindue med navnet Fitted Ligands vises med en liste over kandidatstillinger. Evaluer tilpasningen ved at klikke på de enkelte kandidatligander og analyser pasformen visuelt.
        BEMÆRK: I Servalcat/Refmac kan der kun leveres en monomermodel, og den symmetri, der bruges i rekonstruktionen, kan gives for at opnå en udvidet model.
    9. Yderligere tæthed for opløsningsmiddelmolekylerne blev også observeret nær liganden. Højopløselige krystalstrukturer af enolase fra forskellige homologer tyder på tilstedeværelsen af to Mg2+ ioner40,41, hvilket sandsynligvis stabiliserer den negative ladning af reaktionsmellemproduktet. Modeller to Mg2+ ioner i den aktive stedtæthed ved at klikke på placer atom ved markøren og vælge MG fra Pointer Atom typelisten.
      BEMÆRK VENLIGST: Bindingsgeometrien og afstanden kan bruges som en guide til at vælge metalionen. I tilfælde af Mg2+ bundet til oxygenatomer i proteinrester varierer bindingsafstanden mellem 2,1 Å -2,4 Å, med en oktaedrisk geometri. I tilfælde af kort med lav opløsning er koordinationssfæren imidlertid ofte ufuldstændig, og afstanden kan også variere på grund af begrænsninger i opløsningen.
    10. Trin 1.2.8 gentages for at tilføje Mg2+- ionerne i de symmetrirelaterede monomerer.
    11. Gem modellen ved at klikke på Filer > Gem koordinater > Vælg filnavn > og skrive Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. Åbn Phenix GUI (se materialefortegnelsen). Kør et reelt rumforbedringsjob med Enolase+PEP+Mg.pdb og emd_30989.map som henholdsvis inputmodel og kort ved hjælp af standardparametre. Dette trin udføres iterativt med Coot for at opnå god pasform og geometri i kortmodellen.
      BEMÆRK VENLIGST: Det uskarpe forskelskort bruges til at demonstrere tilstedeværelsen af ligand, såsom i en figur. Til modelleringsformål er B-faktorskærpet kort blevet brugt og anbefales. Det B-faktorskærpede kort kan også bruges til at beregne forskelskortet til demonstrationsformål i modsætning til det uskarpe kort. Men hvis opløsningen er lavere i det område, hvor liganden er bundet, så afslører den enkelte B-faktor, der bruges til at skærpe hele kortet, muligvis ikke tydeligt ligandtætheden.
  3. Visualisering og figurgenerering af den modellerede ligand
    1. Åbn den raffinerede Enolase+PEP+Mg-model fra det endelige Phenix-forfiningsjob i PyMOL42 (se materialefortegnelsen) ved at klikke på Fil > Åbn og vælge filnavnet.
    2. Indlæs emd-30989.map (PEP-bundet skarpt kort) ved at klikke på Fil > Åbn og vælge filnavnet.
    3. Omdøb kortet til PEP-skærpet ved at klikke på handlinger > omdøbe mod det emd_30989 objekt og skrive PEP-skærpet.
      BEMÆRK: I de fleste tilfælde, f.eks. enolase, normaliseres kortene, når de åbnes i pymol, da normaliseringskortindstillingen er markeret som standard i pymol. Da cryoEM-kort er centreret på en større boks, vil normaliseringen omfatte alt i boksen. Således kan normalisering slås fra, før åbning i pymol.
    4. Vælg liganderne ved at klikke på display > sekvens.
    5. Skriv isomesh mesh_ligands, PEP-spidset, 6.0, sele, carve=3.0 i kommandolinjen og tryk enter.
    6. Farvelæg mesh_ligand blå ved at klikke på det sidste felt, C, ved siden af det mesh_ligand objekt.
    7. Vis resterne af det aktive sted, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 og Lys-386, der interagerer med PEP og Mg2+ i henholdsvis pind- og kuglerepræsentation, og enolase-enzymet i tegneserierepræsentation.
    8. Strålesporing ved at skrive stråle 3600, 3600 for at generere billeder i publikationskvalitet og gemme som en png-fil ved at klikke på Filer > gemme og vælge PEP.png som filnavn.

2. Modellering af ligander i metabotrop glutamatreceptor mGlu5

  1. Identifikation og modellering af ligandtætheden i kryoEM-kortet over agonist og antagonistbundet mGlu5
    1. Download de to halvkort sammen med deres tilsvarende koordinatfiler for hvert af de agonistbundne (EMD-31536, 7fd8.pdb) og antagonistbundne (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5-komplekser .
    2. Åbn ChimeraX
      1. Åbn koordinatfilen, 7fd8.pdb ved at klikke på åbn og vælge 7fd8.pdb.
      2. Skriv delete ligand på kommandolinjen, og tryk på Enter.
      3. På samme måde skal du bruge kommandoen delete/B til at slette kæden B.
        BEMÆRK VENLIGST: Ligander og kæder kan slettes ved at bruge rullemenuen øverst ved hjælp af vælg og handlinger > atomer/bindinger > slet.
      4. Gem den uligandide pdb ved at skrive følgende på kommandolinjen: gem 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 angiver model-id'et.
      5. Gentag trin 2.1.2.1-2.1.2.4 for 7fd9.pdb.
    3. Åbne CCP-EM. Opret et nyt projekt med navnet mGlu5 , og angiv projektmappen og brugernavnet.
      1. Åbn Relion fra indstillingerne i venstre panel.
        1. Gå til fanen Oprettelse af maske .
        2. Angiv et af halvkortene for EMD-31536 som input.
          BEMÆRK: Relion accepterer kort med .mrc som suffiks, og EMD-kortene har .map-suffiks. Kortfilerne kan åbnes i ChimeraX til undersøgelse og gemmes i .mrc-formatet.
        3. På fanen maske skal du angive pixelstørrelse som 0,89 Å og indledende binariseringstærskel som 0,007.
        4. Kør jobbet med aliaset 31536 (eller et andet navn, der er let at følge).
        5. På samme måde skal du oprette en maske til EMD - 31537 halvkortet.
      2. Åbn Refmac Servalcat-programmet fra indstillingerne i venstre panel i CCPEM.
        1. Angiv navnet som mGlu5_agonist.
        2. Importer den 7fd8_noligand_chainA .pdb-fil som beskrevet i modelafsnittet 2.1.2.4. Angiv placeringen af de to halve kort og den tilsvarende maske, der er oprettet i Relion.
        3. Angiv opløsningen som 3,8 Å.
        4. Gå til forfiningsindstillinger > Strict Symmetry og nævn C2 som Relion-punktgruppesymmetrien.
        5. Start programmet ved at trykke på startknappen øverst.
    4. Når jobbet er færdigt, skal du åbne resultatet i Coot (mulighed tilgængelig øverst i resultatsektionen). Dette vil som standard vise en diffmap.mtz i Coot, hvor farverne rød og grøn angiver henholdsvis negative og positive tætheder.
      1. Gå til Skærmstyring > egenskaber for forskelskortet mærket DELFWT PHDELWT og skift konturniveauet til 4.0 (absolut værdi).
        BEMÆRK VENLIGST: Valget af tærskel afhænger af kortet og opløsningen.
      2. Skjul kortet mærket FWT PHWT og molekylet mærket refined.pdb.
      3. Flyt kortet rundt ved hjælp af musen for at visualisere den positive tæthed (farvet grøn) og bringe den større klat til midten.
      4. Gå til Filer > Hent monomer, skriv QUS, og tryk på enter.
      5. Gå til Beregn > modellering > Rigid Body Fit-molekyle , og dobbeltklik på QUS-monomeren for at justere molekylet, så det passer ind i Fo-Fc-tætheden.
      6. Brug indstillingen flet molekyle på redigeringsfanen for at tilføje QUS-molekylet til koordinatfilen, refined.pdb.
      7. Gentag trin 2.1.4.3-2.1.4.6 for at tilpasse liganden med monomerkode NAG og CHS i den mindre klat i henholdsvis det ekstracellulære og øverst i det transmembrane domæne.
      8. Gem koordinaten som refined_ligands.pdb.
        BEMÆRK: Opløsningen af transmembrandomænet (TM) er lavere, og det diskuteres derfor ikke her.
  2. Forfining af den mGlu 5-liganderede struktur
    1. Åbn CCPEM , og klon det forrige finjusteringsjob (trin 2.1.3.2), og kør det med refined_ligands.pdb og skarpere kort (emd. 31536.mrc) som input ved hjælp af standardparametre og C2-symmetri.
      BEMÆRK: Hvis programmet ikke genkender liganden, skal CIF-filerne leveres. Disse CIF-filer kan downloades fra PDB eller genereres ved hjælp af forskellige programmer (se trin 3.1.1 for detaljer).
  3. Visualisering og figurgenerering i PyMOL
    1. Åbn refined_expanded.pdb-modellen fra det seneste Refmac-finjusteringsjob i PyMOL.
    2. Gå til Filer > Åbn og gå til Refmac-jobmappen for at indlæse filen diffmap_normalised_fofc.mrc (forskelskort fra Servalcat-job i trin 2.1.3.2).
      BEMÆRK: Hvis filtypenavnet .mrc files ikke er synlige, mens du browser, skal du ændre filtypen til alle files og gennemse.
    3. Vælg liganderne ved hjælp af display > rækkefølge.
    4. Gå til knappen Handlinger og omdøb markeringen til ligander.
    5. Skriv følgende på kommandolinjen og tryk enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligander, carve=2.5.
      BEMÆRK VENLIGST: Maskebredden kan justeres. Her bruges 0,2 maskebredde, og dette indstilles ved hjælp af følgende kommando: sæt mesh_width=0,2.
    6. Højreklik på en af monomererne og gå til kæde > farve for at angive farven på hver monomer. Farvelæg liganden og masken ved hjælp af den sidste boks mærket c i liganden og mesh_ligands objekter. mGlu 5-receptordimeren er vist i tegneserierepræsentation, og monomererne er farvet i blågrøn og hvede. Ligander er vist i pind, og masken, der konturerer liganderne, er farvet grøn.
    7. Brug handlingerne > orientere/centrere/zoome mod objekterne og justere manuelt for at visualisere nettet og tydeligt. Vælg de nærliggende rester, der kan interagere med liganden, f.eks. Tyr64, Trp100 for QUS, og vis efter behov deres sidekæde eller hovedkæde eller begge dele som pindrepræsentation.
    8. Ray trace for at generere billeder i høj opløsning og gemme dem som en png-fil.
      BEMÆRK: Ovenstående trin gentages for det antagonistbundne kort EMD-31537 og den tilsvarende koordinatfil PDB-7fd9.

3. Modellering af inhibitoren, deoxygalacto-nojirimycin (DGN) og opløsningsmiddelmolekyler i et højopløseligt skærpet kort over β-galactosidase

  1. Identifikation af liganden, DGN, ved hjælp af halvkortene fra cryoEM
    1. Forberedelse af ukendt ligandordbog til modellering [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      BEMÆRK: Deoxygalacto-nojirimycin ordbogsfilen er inkluderet i CCP4 monomerbiblioteket som DGJ (3 bogstavs ligand-ID). Ikke desto mindre betragtes det her som en ny og ukendt ligand for at illustrere processen med at generere ordbogsfiler for ukendte ligander, DGN bruges som 3-bogstavskoden.
      1. Åbn stofresuméet for deoxygalacto-nojirimycin (DGN) på PubChem-websiden, og kopier smilestrengen for forbindelsen deoxygalacto-nojirimycin.
      2. Åbn Phenix > Ligands > eLBOW.
      3. Angiv smilestrengen som input.
      4. Angiv passende metode til optimering af ligandbygning. Her bruges simpel optimering.
      5. Indsæt den kemiske smilestreng i liganddefinitionssektionen.
      6. Angiv en jobtitel, outputfilpræfiks og ligand-id korrekt, og tryk på kør.
        BEMÆRK: Outputtet fra jobbet indeholder en koordinatfil, DGN.pdb, og en ordbogsfil, DGN.cif-fil. Jligand29 kan også bruges til at lave cif-filen.
    2. Download β-galactosidase-koordinatfilen (6tsh.pdb) fra PDB'en og fjern koordinaterne for proteinkæderne (B, C, D), ligand, DGN og andre opløsningsmiddelmolekyler ved at bruge en teksteditor eller slet kæde/zone i Coot. Gem koordinatfilen som apo-betaGal_chainA.pdb.
      BEMÆRK VENLIGST: ChimeraX eller Pymol kan også bruges til at fjerne ligand/opløsningsmiddelmolekylet.
    3. Download halvkortene (emd_10563_half_map_1.map og emd_10563_half_map_2.map) fra yderligere data i EMD-10563-posten fra EMDB.
    4. Åbn CCPEM, og brug Relion til at oprette masken til kortet ved en tærskel på 0,01 (som beskrevet i trin 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. Kør Servalcat (inden for CCPEM-pakken som beskrevet i trin 2) med de halve afbildninger opnået i trin 3.1.3 og apo-modellen i trin 3.1.2 og D2-symmetri.
      BEMÆRK VENLIGST: Modellen skal justeres til et af halvkortene eller hele kortene for at lokalisere ligandtætheden. Dette kan gøres ved at tilpasse modellen til kortet ved hjælp af ChimeraX og derefter gemme koordinaterne i forhold til halvkortet. I dette eksempel har halvkort og det primære kort i EMDB forskellige boksstørrelser/gitre, og modellen skal placeres i halvkortet.
    6. Åbn Coot.
      1. Åbn DGN.cif for ligandordbogen som genereret i trin 3.1.1 med Phenix eLBOW. Dette gøres ved at gå til File > Import CIF-ordbogen og gennemse eLBOW-jobmappen.
      2. Åbn protein- og ligandkoordinatfilerne, apo-betaGal_chainA.pdb fra henholdsvis trin 3.1.2 og DGN.pdb fra trin 3.1.6.
      3. Åbn automatisk filen diffmap.mtz fra Servalcat-jobbet (trin 3.1.5) og visualiser kortet mærket DELFWT PHDELWT i Coot. Konturer kortet ved en tærskel på ~ 4 absolut værdi.
        BEMÆRK: Det er vigtigt at tjekke kortstatistikken ved at skrive header map.mrc eller bruge værktøjer i Chimera. Alle de nødvendige oplysninger om pixelstørrelse, boksstørrelse, minimum, gennemsnit og maksimal tæthed og rms-afvigelse fra middeltæthed kan opnås. Det er afgørende at kontrollere pixelstørrelsen og boksstørrelsen på kryoEM-kortene. 3D-kortet repræsenterer protein-ligand-kortvolumen i et gitter af 3D-voxels. I hver voxel lagres elektronpotentialværdien eller sandsynligheden for at finde elektronen på det pågældende sted. Når en bestemt tærskel vælges, sættes voxelerne, som har en tæthed lavere end den angivne værdi, til nul. Dette hjælper med at minimere den eksperimentelle støj i kortet og visualisere kortfunktionerne bedre43. Kortet skal således kontureres ved en tærskel, hvor kortfunktionerne er let synlige, og støjen på kortet er minimal.
      4. Gå til Ligand > find ligander. I det nye vindue, der vises, skal du vælge ligand, differencetilknytningen og apo-betaGal_chainA.pdb-modellen. Lad de andre muligheder være i deres standardindstillinger, og klik på Find ligander for at starte søgningen.
      5. En liste over tophits, der viser potentiel ligandtæthed, vises med en kopi placeret i hver af tæthederne. Kontroller manuelt alle de hits, hvor liganden er placeret. Behold de mest sandsynlige hits og fjern de tvetydige.
        BEMÆRK: Forskellen i korttæthed ved en høj tærskel antyder tydeligt tilstedeværelsen af liganden på det aktive sted.
  2. Modellering af liganden DGN og opløsningsmiddelmolekyler
    1. Udfør en reel rumforfining i Coot for at tilpasse liganden (DGN.pdb) i differenstæthedskortet, og flet derefter ligandkoordinaterne med apo-betaGal_chainA.pdb og gem den som betaGal_chainA+ligand.pdb.
      BEMÆRK: De ligander, der er blevet placeret i områder i andre kæder, kan fjernes og flettes ikke, mens den flettede koordinatfil gemmes. Liganderne i andre kæder kan genereres af NCS-ligander som vist i eksempel 1, trin 1.2.8 eller i Refmac/Servalcat ved hjælp af symmetriudvidelse.
    2. Kør et andet Servalcat-job som ovenfor (trin 3.1.5) med betaGal_chainA+ligand.pdb som inputmodel og halvmapperne (fra trin 3.1.3) med D2-symmetri.
    3. Forskelstæthed (fra Servalcat-jobbet i trin 3.2.2) omkring den modellerede ligand antyder tilstedeværelsen af opløsningsmiddelmolekylerne, der koordinerer med ligandmolekylet. Den centrale tæthed tæt på liganden ser ud til at være for stor til vandmolekyler.
    4. Baseret på tidligere biokemiske og strukturelle data, der indikerer tilstedeværelsen af Mg2+ på den position, modelleres Mg2+-ionen her ved at klikke på placeringsatomindstillingen og angive atomet som MG.
    5. Modeller vandmolekyler i forskelstætheden på det aktive sted, der indikerer tilstedeværelsen af opløsningsmiddelmolekyle ved at klikke på stedatomet ved markøren og vælge vand.
      BEMÆRK VENLIGST: Coot har også mulighed for at plukke vandmolekyler automatisk. Her, da fokus kun er på det aktive sted, tilsættes vandmolekyler manuelt.
    6. Flet koordinaterne for Mg2+ og vand med filen betaGal+ligand.pdb, og gem den som betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. Med betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb skal du udføre Refmac-forfining i Servalcat med D2-symmetri.
      BEMÆRK: Outputforskelskortet fra dette job kan tjene som et middel til at validere, om liganden er blevet nøjagtigt modelleret, da forskelskortet skal vise minimal resterende positiv eller negativ tæthed.
  3. Visualisering og figurgenerering med PyMOL
    BEMÆRK VENLIGST: De trin, der er skitseret nedenfor, giver et par eksempler på fremstilling af figurer ved hjælp af modeller og kort, der kan bruges til at illustrere tilstedeværelsen af ligander og opløsningsmidler.
    1. Åbn refined_expanded.pdb fra det sidste Servalcat-job (trin 3.2.6) med liganden og opløsningsmidlet modelleret.
    2. Vælg forskellige kæder separat for at farve dem magenta, gul, grøn og blågrøn, som beskrevet i eksempel 2.
    3. Gå til Vis > sekvens, foretag separate valg for vandmolekylerne, magnesium og DGN, og omdøb objekterne til henholdsvis vand, MG og DGN.
    4. Vis MG og vandmolekyler som kugler ved at vælge objekterne, højreklikke og vise > kugle. På samme måde skal du vise liganden i pinderepræsentation og farve liganderne og opløsningsmidlerne korrekt. I dette tilfælde er liganden blevet farvet gul af et heteroatom, magnesiumionen er farvet lilla, og vandmolekyler er farvet røde.
    5. Vælg DGN-, MG- og vandmolekyler. Højreklik og vælg handlinger, > kopierer til objekt, og navngiv det som ligander.
    6. Åbn diffmap_normalised_fo.mrc fra Servalcat-jobbet i trin 3.2.6, og omdøb til ligand_fo.mrc. Skriv følgende kommando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligander, carve=2.
      BEMÆRK: Udskæringsmuligheden på 2 Å anvendes omkring atomerne, og afhængigt af kortenes opløsning og kvalitet kan værdier på 3-5 bruges. Når du åbner cryoEM-kort i PyMOL, er det desuden tilrådeligt at sætte normalize_ccp4_maps til slukket.
    7. Brug handlingerne > orientere/zoome og justere manuelt for at visualisere liganderne og nærliggende interagerende rester (hvor det er relevant) som vist i trin 2.3.7.
    8. Ray trace disse scener for at gemme billeder i høj opløsning ved hjælp af kommandoen ray 3600, 3600.
    9. Gem scenen som .png fil.
      BEMÆRK VENLIGST: Følgende trin er valgfrie og skitserer processen til at visualisere (1) differenstætheden (Fo-Fc) for den umodellerede ligand, DGN, (2) densiteten (Fo) af den modellerede ligand, DGN samt differenstætheden (Fo-Fc) for umodellerede opløsningsmidler og endelig for (3) densiteten (Fo) for den modellerede ligand, DGN og opløsningsmiddelmolekylerne i det aktive sted.
    10. For at demonstrere tilstedeværelsen af liganden, DGN og de omgivende opløsningsmiddelmolekyler ved hjælp af differenskortet, skal du åbne diffmap_normalised_fofc.mrc fra Servalcat-jobbet i trin 3.1.5. Omdøb tilknytningsfilen til unliganded_fofc.mrc ved at klikke på handlinger > omdøbe ud for tilknytningsobjektet. Skriv følgende på kommandolinjen: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligander, niveau=6, carve=2.
    11. For at demonstrere tætheden af den modellerede ligand, DGN og den omgivende umodellerede opløsningsmiddeltæthed, skal du åbne diffmap_normalised_fo.mrc samt diffmap_normalised_fofc.mrc fra servalcat-jobbet i trin 3.2.2. Omdøb diffmap_normalised_fo.mrc til DGN_fo og diffmap_normalised_fofc.mrc til DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. Vælg MG og vand fra Display > Sequence, højreklik og vælg handlinger, > kopierer til objekt, og navngiv dem som opløsningsmidler.
    13. Indtast følgende i kommandolinjen: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, niveau=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, opløsningsmidler, niveau=6, carve=2.
      BEMÆRK VENLIGST: mesh_DGN_fo vil vise ligandens tæthed, og mesh_solvent_fofc vil vise den udeladte tæthed for MG og vand.
    14. Til sidst, for at visualisere de modellerede ligander såvel som de omgivende opløsningsmiddelmolekyler i det aktive sted, skal du åbne diffmap_normalised_fo.mrc fra Servalcat-jobbet i trin 3.2.6 og omdøbe det til ligand_fo.mrc.
    15. Skriv følgende på kommandolinjen: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligander, level=3, carve=2.
      BEMÆRK: Her brugte vi diffmap_normalised_fo.mrc, men det endelige skærpede kort kan bruges til at vise tætheden af ligander og de omgivende rester. Det er en god praksis at nævne den anvendte type kort, B-faktor skarphedsværdier i figurforklaringen.
    16. Maskebredden og kuglestørrelsen kan indstilles ved at skrive følgende kommandoer: sæt mesh_width=0.2 og sæt sphere_scale=0.25 for at gøre kuglestørrelsen mindre.
    17. Farve fo-nettet blåt og fofc-nettet grønt.
    18. Brug handlingerne > orientere/zoome og justere manuelt for at visualisere liganderne og nærliggende interagerende rester (hvor det er relevant), som vist i trin 2.3.7.
    19. Ray trace disse scener for at gemme billeder i høj opløsning ved hjælp af kommandoen ray 3600, 3600.
    20. Gem de enkelte scener som .png filer.

4. Effekt af opløsning på ligandmodellering i β-galactosidase

  1. Åbn Terminal og gå til biblioteket, der indeholder de to halvkort.
  2. Åbn de to halvkort (trin 3.1.3) i .map-format i ChimeraX, visualiser dem og gem dem som emd10563_half1_1_unfil.mrc og emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. Masken, der blev oprettet i trin 3.1.4, kan bruges som input.
  4. Kør et PostProcessing-job i Relion ved hjælp af halve afbildninger og masker fra trin 4.2-4.3 med standardparametrene.
  5. Gentag trin 4.4, nu med en Spring over FSC-vejning aktiveret og med angivelse af et ad-hoc lavpasfilter på 3 Å.
  6. Gentag trin 4.4 med et ad-hoc lavpasfilter på 3,5 Å.
  7. Åbn kortene (postprocess.mrc) fra trin 4.4-4.6, filtrer med forskellige opløsninger og modelkoordinaten, 6tsh.pdb (justeret til halvkortene i ChimeraX) fra trin 3.1.2 i PyMOL. Omdøb de forskellige kort til 3.0, 3.5 og 2.3 som defineret af deres opløsninger.
    BEMÆRK: Man kan bekræfte lavpasfiltreringen af kortene ved at visualisere dem i ChimeraX eller Coot.
  8. Visualiser effekten af opløsning på tætheden af ligand- og opløsningsmiddelmolekyler ved at skabe et net på 2 Å omkring ligand- og opløsningsmiddelmolekylerne ved en tærskel på 6σ som beskrevet i trin 3.3.6 med kort filtreret til forskellige opløsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempel 1
Enzymet enolase fra M. tuberculosis katalyserer det næstsidste trin i glykolyse og omdanner 2-phosphoglycerat til phosphoenolpyruvat (PEP), som er et essentielt mellemprodukt for flere metaboliske veje44,45. CryoEM-data for apo-enolase- og PEP-bundne enolase-prøver blev indsamlet ved samme pixelstørrelse på 1,07 Å, og billedbehandling blev udført med Relion 3,146,47. Apo-enolase- og PEP-enolase-strukturerne blev bestemt til henholdsvis 3,1 Å og 3,2 Å,48. Kortene og modellerne blev deponeret i EMDB og PDB49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x og PDB-7e51). KryoEM-kortet over enzymet viser, at det er en oktmer i opløsningen (figur 1A). For at identificere ligandtætheden i PEP-enolase-kortet blev de uskarpe kort af apoenzymet og PEP-bundet enzym udvalgt, og et differenskort blev beregnet i ChimeraX ved at trække PEP-enolase-kortet fra apoenzymkortet. En tydelig tæthed (grøn) ved en høj tærskel blev observeret, hvilket tydede på tilstedeværelsen af liganden (figur 1B). Modellering af proteinkæden i det uskærpede kort viste tydeligt, at den ekstra tæthed er til stede i proteinets aktive sted (figur 1C). Liganden, PEP, blev derefter modelleret i B-faktor-skærpede kort ved hjælp af Coot, og protein+ligand-modellen blev forfinet i det virkelige rum med Phenix. To Mg2+ ioner blev modelleret i den tæthed, der blev observeret i nærheden af liganden (figur 1D). Liganden, PEP, antager en lignende orientering som observeret i andre enolase-homologer, og flere aktive rester, såsom Lys-386, Arg-364, danner hydrogenbindingsinteraktioner med liganden PEP. Mg2+-ionerne danner metalkoordinationsbindinger med Asp-241, Glu-283, Asp-310 og fosfatet af PEP (figur 1D).

Eksempel 2
I mangel af en tilgængelig apo-proteinstruktur, eller hvis proteinet gennemgår en stor konformationsændring, er det ikke muligt at beregne differenskortene som beskrevet ovenfor. I 2021 introducerede Garib Murshudovs gruppe ved Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Servalcat22, som implementerer en forfiningsarbejdsgang ved hjælp af Refmac og også beregner et Fo-Fc-forskelskort efter forfining. En positiv Fo-Fc-forskelstæthed antyder tilstedeværelsen af molekyler/ligander, der ikke var inkluderet i modellen under forfiningen, i det væsentlige et udelade kort. Det anbefales dog først at vurdere modellens tilpasning til kortet generelt og derefter evaluere kortet over forskelstæthed.

For at illustrere brugen af Servalcat/Refmac blev mGlu5, en dimer G-protein-koblet receptor, der binder til neurotransmitteren, L-Glutamat valgt. Ved binding af agonisten, L-quisqualate, omorienteres det ekstracellulære domæne, hvilket udløser rotationen af 7TM, hvilket bringer dem tættere på for at stabilisere den aktiverede tilstand. Der er således observeret en stor konformationsændring mellem apo/antagonisten vs. agonistbundne tilstande51 (Figur 2A og Figur 2E). De to halvkort for både agonisten (EMD-31536) og antagonisten (EMD-31537) bundne komplekser blev opnået fra EMDB, og kryoEM-kortene viser varieret opløsning på tværs af molekylet og bedre opløst ekstracellulært domæne. Efterfølgende blev disse brugt som input i Servalcat sammen med apo-proteinet som model til at beregne forskellen eller Fo-Fc-kortet for hvert datasæt. Dette kort viste tydeligt tilstedeværelsen af forskellige ligandmolekyler (ikke-protein). Opløsningen estimeret ved FSC (Fourier Shell-korrelation) for de agonist- og antagonistbundne komplekser var henholdsvis 3,8 Å og 4,0 Å. I tilfældet med den agonistbundne mGlu5 viste Servalcat Fo-Fc-forskelskortet tilstedeværelsen af både agonisten (L-quisqualate) (figur 2B) og N-acetylglucosamin (NAG) (figur 2C) i receptorens ECD (på grund af lavere opløsning af TMD, her fokuserer vi kun i ECD og toppen af TMD). Proteinrester, herunder Tyr-64, Trp-100, Ser-151 og Thr-175, ses at interagere med agonisten. Densitet nær Asn-210-resten antydede tilstedeværelsen af N-acetylglucosamin (figur 2C). En densitet i overensstemmelse med cholesterylhemisuccinat, som blev tilsat under oprensningen af mGlu5, blev observeret nær toppen af transmembranhelix 1 (figur 2D). Da opløsningen er moderat, og liganden, L-quisqualate, kan placeres i forskellige retninger, blev den forudgående struktur af det ekstracellulære domæne med liganden (PDB-6N50) brugt som en guide til at modellere liganden. Antagonistbinding stabiliserer receptorens åbne eller hviletilstand (figur 2E). En tæthed i overensstemmelse med antagonisten LY341495 blev observeret ved hængslet af lobe I og lap II af venusfluefældedomænet i ECD. Antagonisten interagerer med rester, der ligner agonistens. Stablingsinteraktion mellem Tyr-223 i lobe II med antagonisten stabiliserer receptoren i åben tilstand (figur 2F). I lighed med agoniststrukturen blev glykosylering eller tilstedeværelsen af N-acetylglucosamindel observeret nær Asn-210 (figur 2G).

Eksempel 3
Det tredje eksempel belyser protokollen til modellering af fragmentstore eller små ligander og opløsningsmiddelmolekyler i højopløselige CryoEM-kort. Fragment-baseret lægemiddelopdagelse (FBDD) er dukket op som en kraftfuld og innovativ metode i udviklingen af målbaserede nye terapier inden for forskellige sygdomsområder, hvilket gør det til en lovende vej inden for farmaceutisk forskning og -udvikling 52,53. FBDD begynder med screening og omhyggelig udvælgelse af små, meget opløselige, lavmolekylære fragmenter af molekyler, der binder til specifikke målproteiner eller biomolekyler af interesse. Bestemmelse af strukturerne af disse proteinfragmentkomplekser afslører bindingsmåden af disse fragmenter, som tjener som en guide til at designe større og mere komplekse lægemiddellignende molekyler med stigende affinitet og specificitet over for målproteinet54. Denne metode kræver dog en ligandtæthed med høj opløsning for nøjagtigt at bestemme posituren og placere de funktionelle grupper af ligandenkorrekt 15.

β-galactosidase, en af de første højopløsningsstrukturer, der er blevet bestemt ud fra fremskridtene inden for cryoEM-teknologi, er et velundersøgt 450kDa homotetramert enzym, der katalyserer hydrolysen af laktose til glukose og galactose55. For at demonstrere brugen af cryoEM i FBDD bestemte Astex, Storbritannien, strukturen af β-galactosidase med en fragmentstørrelse hæmmer, deoxygalacto-nojirimycin (DGN) bundet i det aktive sted (EMDB-10563, PDB:6tsh)56. Dette datasæt bruges til at illustrere protokollen til at modellere ligander og opløsningsmidler utvetydigt i kort i høj opløsning. For at vise effekten af opløsning på ligandmodellering og visualisering blev kortene filtreret til 3,0 Å og 3,5 Å i efterbehandlingstrinnet i Relion. Dette fremhæver kvaliteten af korttætheden ved forskellige opløsninger og understreger behovet for højere opløsning til modellering af ligander og opløsningsmidler.

Enzymet er en tetramer med D2-symmetri i opløsning (figur 3A). Forskelskort (mellem kort og model), som beregnet af Servalcat, antydede tilstedeværelsen af DGN og flere opløsningsmiddelmolekyler i enzymets aktive sted (figur 3B). Ved en estimeret opløsning på 2,3 Å viste densiteten højopløsningsfunktioner, som hjalp med den nøjagtige modellering af inhibitoren i proteinets aktive sted. Interaktioner mellem DGN og Tyr-503 og His-540 blev observeret (figur 3C). Forskelstætheden antydede også tilstedeværelsen af opløsningsmiddelmolekyler, der interagerer med DGN såvel som proteinresterne. Mg2+ og flere vandmolekyler blev modelleret i densiteten (figur 3D). Metalkoordinationsbindinger mellem Mg2+ og Glu-416, Glu-461 og flere vandmolekyler observeres (figur 3D). Mg2+ blev set at interagere med DGN via et vandmolekyle.

Ved en lavere opløsning på 3,5 Å og 3,0 Å ligner ligandtætheden en klat og mangler højopløsningsfunktioner, der er afgørende for nøjagtig modellering af liganden (figur 4A,B). Densiteten for vandmolekyler var næsten ikke-eksisterende ved disse opløsninger. Sammenfattende gjorde densiteten det muligt at modellere et større antal vandmolekyler med stigende opløsning, især højere end 3,0 Å. Den korrekte placering af ligandens kirale centrum blev opnåelig ved ~2,3 Å (figur 4C,D) på grund af tilstedeværelsen af distinkte træk på kortet, der styrede placeringen samt modellering af vandmolekyler og Mg2+. Til sammenligning forblev tætheden for Mg2+ mærkbar over opløsningsområdet (figur 4A-C).

Figure 1
Figur 1: Modellering af ligandphosphoenolpyruvat i M. tuberculosis enolase. (A) viser B-faktorskærpet kort over det PEP-bundne enolase-enzym. Kortet antyder, at enolase er oktamerisk i opløsning, og hver monomer på kortet er farvet forskelligt. (B) viser et uskarpt kryoEM-kort over apo-enolase-enzymet i gråt med forskelskortet (mellem PEP-bundne og apo-enolase uskarpe kort) overlejret i grønt, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ligand, PEP. Dette er et demonstrationskort for at vise tilstedeværelsen af ligander. (C) viser tilpasningen af enolase-modellen i det uskarpe kryoEM-kort, der fremhæver placeringen af forskelstætheden i forhold til proteinet. Proteinmodellen er vist i tegneserierepræsentation og farvelagt i Chainbow. Denne figur viser, at den ekstra tæthed (grøn) er til stede i det aktive sted for hver monomer. (D) viser liganden, PEP, indkapslet i B-faktorens skærpede kort, farvet blå. Derudover blev der også observeret densitet for to Mg2+ ioner, som danner metalkoordinationsbindinger med flere aktive rester, herunder Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 og ligandatomer. Liganden laver hydrogenbindingsinteraktioner med Lys-386, Lys-335 og Arg-364. Proteinresterne er vist i pinderepræsentation, og Mg2+ ioner er vist som lilla kugler. Figurerne i paneler (A-D) er genereret med Pymol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Identifikation, modellering og visualisering af forskellige ligander i mGlu5-receptoren. Fo-Fc udeladelseskortene blev opnået ved hjælp af Servalcat. (A) viser mGlu 5-receptordimerstruktur (PDB-7fd8) i tegneserierepræsentation, hvor hver monomer er farvet i henholdsvis krikand og hvede og bundet til agonisten L-quisqualat. Alle de ligander, der blev identificeret i det ekstracellulære og på toppen af receptorens transmembrandomæne, er indkapslet i Fo-Fc udeladelseskortet, farvet grønt og kontureret ved 6σ. (B) fremhæver tilpasningen af agonisten, L-quisqualate indkapslet i forskelskortet. L-quisqualat interagerer med flere mGlu5-rester, herunder Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 og Gly-280. H-bindingsinteraktionerne er repræsenteret af røde streger. I (C) er en yderligere tæthed tydelig nær Asn-210, som er til stede i receptorens ekstracellulære domæne, og N-acetylglucosaminmolekyle (NAG) blev modelleret i denne tæthed. For klarhedens skyld er NAG ikke knyttet til Asn i den nuværende figur. (D) viser forskellen i tæthed for kolesterolhemisuccinat (CHS) i grønt nær den lipideksponerede overflade af receptoren. CHS-molekylet, repræsenteret i pindene, blev modelleret i denne tæthed. (E) viser mGlu 5-receptorstruktur (PDB-7fd9) bundet til antagonisten LY341495 i tegneserierepræsentation. I (F) indikerer en ekstra tæthed i Fo-Fc-differenskortet placeret ved hængslet mellem lobe I og lobe II i det ekstracellulære domæne tilstedeværelsen af antagonisten. Nøglerester (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 og Tyr-223) omkring antagonisten er vist i pinde-repræsentationer, og potentielle hydrogenbindingsinteraktioner med antagonisten er vist i røde streger. (G) viser forskellen i tæthed, der tyder på tilstedeværelsen af NAG-molekyle nær Asn-210 i den antagonistbundne struktur (bemærk, NAG er ikke forbundet med Asn for klarhedens skyld). Tallene blev genereret med Pymol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Identifikation, modellering og forfining af en lille hæmmer og opløsningsmiddelmolekyler i det højopløselige kort over β-galactosidase (EMD-10563). (A) viser β-galactosidase-modellen opløst til 2,3 Å (PDB: 6tsh) i tegneserierepræsentation, hvor hver monomer er farvet tydeligt. Den grå boks fremhæver ligandbindingsstedet. (B) viser Fo-Fc-differenstætheden (fra Servalcat) i grønt net i enzymets aktive sted. Forskellen i tæthed tyder på tilstedeværelsen af inhibitoren (DGN) og flere opløsningsmiddelmolekyler i det aktive sted. (C) viser, at styret af Fo-Fc-kortet modelleres hæmmeren deoxygalacto-nojirimycin (DGN) på det aktive sted. Denne modellerede ligand er afbildet i pindformat og indkapslet i Fo-tætheden (af Servalcat), som er farvet i blue_mesh. Hydrogenbindingsinteraktioner mellem DGN og flere proteinrester, herunder Tyr-503 og His-540, er observeret. Den ekstra Fo-Fc-forskelstæthed omkring liganden (grøn) er vejledende for opløsningsmiddelmolekylerne. (D) Kortet viser flere opløsningsmiddelmolekyler, herunder vand og Mg2+, repræsenteret som henholdsvis røde og lilla kugler, er modelleret i det aktive sted efter at have sikret, at hvert opløsningsmiddelmolekyle er bundet til enten protein (Glu-416, His-418 og Glu-461) eller liganderester. Vandmolekylerne og Mg2+ er indkapslet i Fo-densiteten (blåt net). Mg2+ ses at interagere med liganden, DGN via et vandmolekyle. Fo-Fc-kortet (grønt net) i paneler (B,C) er kontureret ved 6σ, mens Fo-tætheden - blåt maske i C og D (fra Servalcat-forfiningen efter modellering) er kontureret ved 3σ. Figurerne i paneler (A-D) er genereret med Pymol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Effekt af opløsning på ligandmodellering i β-galactosidase. Halvkort fra EMD-10563 blev brugt som input i Relion-efterprocestrinnet, og de kombinerede efterbehandlingskort blev filtreret til opløsningerne 2,3 Å, 3,0 Å og 3,5 Å med forskellige B-faktorer. Kortet vist i alle panelerne er kontureret ved 6σ. For klarhedens skyld er kun proteinrygraden vist uden sidekæder, ligand eller opløsningsmiddelmolekyler i paneler A, B og C. (A) Kortet er filtreret til 3,5 Å, og det aktive sted for β-galactosidase er vist. En klat, der ligner liganden, DGN, ses i denne opløsning, ledsaget af nogle få mindre klatter i nærheden. Modellering af liganden i den korrekte orientering viser sig at være udfordrende på grund af manglen på distinkte funktioner på kortet. (B) Kortet filtreret til 3.0 Å opløsning vises. Her bliver ligand-blob'en lidt mere defineret, men mangler stadig funktioner generelt. Et par flere små klatter, der tyder på opløsningsmiddelmolekyler, er også observeret. (C) Kortet filtreret til 2,3 Å opløsning afslører ligandtætheden med forskellige træk, der især afslører stolekonformationen af iminosukkeret. Et betydeligt antal små klatter svarende til vandmolekyler observeres ved denne opløsning. Den automatiske B-faktor estimering/skærpning i Relion efterproces giver en værdi på -18 Å2 for kortene filtreret til 3 Å og 3,5 Å, mens værdien er -52 Å2 for kortet filtreret til 2,3 Å. Forskellig B-faktor slibning af EM-kort kan også udføres med Coot og nyttig i modelbygning. (D) Panelet illustrerer, at liganden DGN (pinderepræsentation), Mg2+ og vandmolekyler (som kugler) som modelleret i det aktive sted og det skærpede kort ved 2,3 Å, vist i blåt net omkring disse atomer. Figurerne i paneler (A-D) er genereret med Pymol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forbedringerne i mikroskophardware og -software har resulteret i en stigning i antallet af cryoEM-strukturer i de senere år. Selvom den højeste opløsning, der opnås i øjeblikket i enkeltpartikelkryoEM, er 1,2 Å 57,58,59, bestemmes størstedelen af strukturerne omkring 3-4 Å opløsning. Modellering af ligander i kort med medium til lav opløsning kan være vanskelig og ofte fyldt med tvetydighed. I betragtning af den udbredte brug af cryoEM i både den akademiske verden og medicinalindustrien til translationel forskning og lægemiddelopdagelse, er det vigtigt at sikre, at ligander modelleres korrekt og uden tvetydighed. Derfor er det klogt at kvantificere opløsningsevnen af ligandatomer ved at beregne Q-score60, som nu er tilgængelig i EMDB som en metrik til at evaluere kvaliteten af kortene og modellens pasform såvel som i Chimera.

I det første eksempel blev ChimeraX brugt til at beregne forskelskortet i det virkelige rum mellem apo og de ligandbundne kort i M. tuberculosis enolase-enzymet. Den ekstra tæthed ved en høj tærskel antyder tilstedeværelsen af liganden, phosphoenolpyruvat, i det aktive sted og Mg2+ bundet til liganden. Det er vigtigt at bemærke, at kortet i dette tilfælde har medium opløsning (3,2 Å), og vandmolekyler kan ikke modelleres sikkert (figur 1). Begrænsningen forbundet med denne metode er, at den kun kan anvendes, når ligandbinding ikke inducerer signifikante konformationsændringer i proteinet. Kortnormalisering blev ikke udført i dette tilfælde, da både apo- og ligandbundne datasæt blev erhvervet med samme pixelstørrelse og behandlet med identiske parametre i Relion. Det er dog værd at bemærke, at når man sammenligner kort genereret af forskellige rekonstruktionsprogrammer, såsom Relion46,47 og CryoSparc61, eller med forskellig kvalitet, bliver normalisering af kortene afgørende, før meningsfulde sammenligninger kan foretages.

Det næste eksempel er mGlu5, som gennemgår stor molekylær reorganisering ved agonistbinding, som det fremgår af cryoEM-strukturerne51,62 (figur 2). I dette scenarie er det ikke muligt at beregne en simpel forskelskort mellem de ubundne (apo) og ligandbundne receptorer på grund af væsentlige forskelle mellem kortene. Her blev Servalcat, der bruger uskarpe og uvægtede halvafbildninger som input til forfining i det gensidige rum og efterfølgende beregner et forskelskort mellem det eksperimentelle afbildning og det afledte aftryk af modellen, brugt. Ved en høj tærskel kan man visualisere forskelle og fungere som en guide til korrektion og forbedring af modellen. Adskillige umodellerede klatter i det ekstracellulære og nær det transmembrane domæne af mGlu5 blev observeret og brugt som en guide til at modellere ligander (figur 2).

Det tredje eksempel viser, hvordan opløsning (2,3 Å) spiller en afgørende rolle i kortfortolkning og modellering af en fragmentstørrelse hæmmer i β-galactosidase. Her var udfordringen at identificere en meget lille ligand (<200 Da) i Servalcat-forskelskortet midt i den iboende støj i dataene og modellere den nøjagtigt. Ud over den høje globale opløsning bestemt ved hjælp af Fourier Shell Correlation (FSC), var den lokale opløsning, der er specifik for liganden, også tilstrækkelig høj til at sikre nøjagtig placering af ligandernes kirale centre (figur 3). Densitet for opløsningsmiddelmolekyler blev observeret i forskelskortet i hele enzymet og især omkring liganden. Effekten af opløsning på modelleringsligander og opløsningsmiddelatomer blev også påvist (figur 4). Det er vigtigt at udvise forsigtighed, når man modellerer vand- eller opløsningsmiddelmolekyler, fordi støj ved en lav tærskel nogle gange kan ligne vand- eller opløsningsmiddelmolekyler, hvilket fører til potentielle fejlfortolkninger.

En anden vigtig overvejelse er, at kryoEM-kortene alene muligvis ikke er tilstrækkelige til nøjagtigt at identificere en metalion alene. Yderligere biofysiske metoder som Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) eller Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX) er ofte nødvendige for at bekræfte tilstedeværelsen og identiteten af metalionen. I både enolase- og β-galactosidase-enzymer blev Mg2+ modelleret på grund af det væld af information, der allerede var tilgængelig om disse proteiner, hvilket bekræfter identiteten af metalionen. Også koordinationen af metalionerne i disse tilfælde, eksemplificeret ved den klassiske oktaedriske geometri og de næsten ideelle koordinationsafstande på Mg2+, gav et væsentligt bevis på deres identitet.

Generelt bør et par vigtige overvejelser tages i betragtning, når man modellerer ligander i kryoEM-kort. Til at begynde med er det vigtigt at vælge det korrekte kort til ligandidentifikation og modellering. I alle tilfælde er et uskarpt og uvægtet kort eller halvkort tilrådeligt over et skærpet og vægtet kort for at visualisere ligandtætheden, da skarphed og vægtning kan resultere i underskærpede eller overskærpede (støj på grund af serieafslutning) områder på kortet. Dette kan resultere i en suboptimal ligandtæthed, og brugen af forskellig B-faktor slibning kan anvendes til at evaluere tætheden under modelbygning i Coot. Selvom der er en risiko ved at bruge det skærpede kort til at identificere ligander i et kryoEM-kort, viser det uskarpe kort muligvis ikke alle detaljer om ligandtætheden, men kan bruges til demonstrationsformål, som vist i figur 1B,C.

Posituren for den modellerede ligand skal valideres, især i tilfælde, hvor dataene er svage. Som vist her for mGlu5 varierer den lokale opløsning på tværs af kryoEM-kortet, og upartisk modellering af liganden kan være udfordrende. Servalcat kan bruges som et værdifuldt værktøj til at opdage potentielle unøjagtigheder i protein- og ligandmodellering22.

Sammensætningsmæssig heterogenitet kan være til stede i et protein-ligandkompleks, hvor kun en specifik population kan have liganden til stede (hvis liganden er af lav molekylvægt, fjerner klassificeringstrinnet muligvis ikke heterogeniteten). Ikke desto mindre er det vigtigt at udføre 3D-klassificeringen63 trin iterativt under billedbehandling før ligandmodellering og verificere, om ligandens tæthed forbedres. Hvis der er flere kopier af protein til stede, bør der udvises forsigtighed, når der anvendes symmetri på tværs af kortet under indledende modelgenerering og forfining, da dette kan udligne ligandtætheden i alle de symmetrirelaterede molekyler. Symmetri bør kun pålægges, efter at kortet er blevet grundigt inspiceret for at bekræfte tilstedeværelsen af ligandtæthed i alle proteinkæderne.

Afhængig af tilstanden (krystal eller opløsning) og placeringen (begravet eller overflade) kan atomerne være dynamiske, og i modelforfining omtales dette som atomforskydningsparameteren (ADP). Sammen med forskelskortet, som giver visuelle ledetråde til mulige unøjagtigheder i modellen, kan ADP-værdier bruges til at evaluere nøjagtigheden af liganderne efter forfining 64,65,66,67. Typisk skal liganden have lignende ADP-værdier som de omgivende rester, dvs. hvis de er stabilt bundet og modelleret nøjagtigt. Ligander i periferien eller atomerne af en ligand (som lipider), der er langt fra makromolekyler, kan dog have højere ADP-værdier. Ud over at forfine koordinaterne tillader både Refmac 33,34 og Phenix forfining af ADP-værdier28,68. I Refmac bruges Mott-Bethe-tilnærmelsen til at beregne elektronspredningsfaktoren for individuelle atomer under kortberegning. I den seneste version af Phenix er individuel B-faktorforfining, der ligner krystallografi, blevet introduceret for at tage højde for atomforstyrrelse. Meget ofte observeres en bred vifte af ADP-værdier i de raffinerede modeller, der er afledt af cryoEM (nogle gange værdier tæt på nul), og selv den Q-score, der bruges i EMDB til at evaluere modellens tilpasning til kortet, afhænger af det primære kort, der er deponeret, og arten af B-faktorskærpning60. I cryoEM-modelopbygning bruges ofte flere kort, og derfor bør de kort, der bruges i modellering og forfining, tydeligt nævnes i metoderne, da på grund af anisotrop opløsning i mange makromolekyler er et enkelt kort muligvis ikke tilstrækkeligt til at forklare alle detaljerne. 

Ved modellering af ligander i makromolekyler er en af de største begrænsninger ved cryoEM-kort (som i krystallografi), at hvis ligandbindingsstedet er af lav opløsning, eller hvis den bundne ligand er dynamisk, kan det vise sig vanskeligt at fastslå den korrekte konformation. Derudover har de fleste kryoEM-strukturer opløsninger under 3 Å, og repræsentationen af vandmolekyler i kortene er begrænset, hvilket gør det vanskeligt at vurdere hydreringens rolle i ligand- eller lægemiddelbinding (som vist her med eksemplerne på enolase og mGluR). Beregningsmetoder kan bruges i kombination med cryoEM-data til at adressere disse begrænsninger69. I modsætning til krystallografi er det kun modellen, der forfines, ikke kortet. I øjeblikket er den eneste metode til at indikere tilstedeværelsen af en ligand eller sikre nøjagtig modellering ved at generere udeladelseskort (ved hjælp af værktøjer som Servalcat). Der er således en række værktøjer til at hjælpe forskere med at opbygge og evaluere modellen, men der er flere områder inden for modelforfining, hvor nyere tilgange eller modifikationer af nuværende tilgange kan forventes i den nærmeste fremtid.

I denne artikel har vi fokuseret på de nuværende tilgange til modellering af ligander, som omfatter manuel inspektion af ligandtætheden, generering af ligandgeometrifilen, efterfulgt af modellering af liganden i cryoEM-kortet. Dette er en spændende periode inden for strukturbiologi og lægemiddelopdagelse, da direkte elektrondetektorer med hurtigere billedhastigheder og brug af hurtigere dataindsamling70 har resulteret i opnåelse af højopløselige kort (<2,8 Å) af flere makromolekyler, der ofte er bundet med små molekyleligander på relativt kort tid. Den nylige introduktion af automatiserede ligandmodelleringsværktøjer såsom GEMspot69 i Schrödinger-suiten og EMERALD17 i Rosetta-suiten, som forsøger at finde den mest sandsynlige bundne positur af liganden, mens de inddrager de eksperimentelle kryoEM-data, lover at strømline og automatisere denne proces. I lighed med røntgenkrystallografi forestiller man sig, at identifikation af bindingstilstande for små molekyleligander ved hjælp af cryoEM, måske to eller flere på en enkelt dag, vil blive en realistisk mulighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

SJ er modtager af ph.d.-stipendiet fra DAE-TIFR, og bevillingen er anerkendt. KRV anerkender DBT B-Life-tilskuddet DBT/PR12422/MED/31/287/2014 og støtten fra Department of Atomic Energy, Indiens regering, under projektidentifikation nr. RTI4006.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCP4-8.0 Consortium of several institutes https://www.ccp4.ac.uk Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM Consortium of several institutes https://www.ccpem.ac.uk/download.php Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot  Paul Emsley, LMB, Cambridge https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix) Consortium of several institutes https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank  Consortium of several institutes https://www.ebi.ac.uk/emdb/ Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon Thermo Fisher Scientific  https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf Commercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix  Consortium of several institutes https://phenix-online.org/download Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank Consortium of several institutes https://rcsb.org Public database of macromolecular structures
Pymol Schrodinger https://pymol.org/2/ Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion MRC-LMB, Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios Thermo Fisher Scientific  https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		 Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ General purpose software for display, analysis and more

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 209
Modellering af ligander til kort afledt af elektronkryomikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K.… More

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter