Summary
该协议描述了如何从已故器官供体中生成人类胰腺切片,以在近生理条件下研究细胞功能。这种创新方法能够研究正常和结构受损的胰岛,以及内分泌和外分泌区室之间错综复杂的相互作用。
Abstract
研究人类胰腺对于了解与 1 型 (T1D) 和 2 型糖尿病 (T2D) 相关的病理生理机制以及胰腺内分泌和外分泌生理学和相互作用至关重要。从对分离胰岛的研究中已经学到了很多知识,但这妨碍了在整个组织的背景下检查它们的功能和相互作用。胰腺切片提供了一个独特的机会,可以探索正常、发炎和结构受损胰岛在其原生环境中的生理学,从而可以研究内分泌和外分泌区室之间的相互作用,以更好地研究胰腺组织的复杂动力学。因此,活体胰腺切片平台的采用代表了该领域的重大进步。该协议描述了如何通过组织包埋在琼脂糖和振动切片机中从已故器官供体中产生活组织切片,以及它们用于评估功能读数,如动态分泌和活细胞成像。
Introduction
胰岛生理学研究对于理解糖尿病的发病机制和开发新的治疗方法至关重要。到目前为止,研究依赖于孤立的胰岛,这使胰岛暴露于机械和酶应激下,可能导致细胞生理学的变化;此外,不可能在其自然组织环境中评估胰岛功能,这可能受到外分泌细胞和血管细胞等的影响1。在研究 T1D 供体的胰腺时,存在一个挑战,即它们的胰岛难以分离,并且在分离过程中可能会变得支离破碎,这可能会对可能不代表体内群体的胰岛产生选择效应 2.此外,胰岛将与其复杂的环境和细胞连接分离,尤其是与在发炎胰岛中发现的浸润免疫细胞分离,这些免疫细胞在胰岛外围更丰富。因此,虽然分离的胰岛是糖尿病研究的基石工具,但也存在局限性。作为回应,我们引入了一种用于生成活体胰腺切片的突破性协议,为这些挑战提供了解决方案。
胰腺组织切片技术的最新发展和采用被认为是我们探索胰腺复杂生物学和功能能力的突破。这项创新为胰岛生理学的动态研究以及内分泌细胞、外分泌细胞、神经细胞、血管细胞和免疫细胞在其自然解剖背景下的相互作用开辟了新的途径。与传统方法不同,这种体外设置保留了器官的大部分细胞结构,从而更接近其天然生物学。该方法最初由 Speier 和 Rupnik 于 2003 年在小鼠中开发3,已证明其可用于评估钙成像、电生理学和细胞内和细胞间信号传导的激素分泌 4,5,6,7,8,9。然后将胰腺切片平台应用于通过手术活检获得的人胰腺组织的研究 4,10,11,12。我们小组通过糖尿病胰腺器官捐献者网络 (nPOD) 的活动证明了从尸体器官捐献者那里获得和利用胰腺切片的可行性13。nPOD 为进行人类 1 型糖尿病研究的经批准的研究人员提供胰腺组织,并且由于采用胰腺切片平台,nPOD 通常生成和分发活的胰腺切片 14,15,16,17。自 2020 年胰腺切片平台实施以来,nPOD 已成功将 43 名供体(包括 12 名 T1D 供体)的组织切片分发给众多研究者。利用这些切片,研究人员对胰岛功能的关键方面进行了开创性的研究,并探索了胰岛与脉管系统、神经系统和免疫细胞在 T1D 背景下的相互作用 13,18,19,20,21,22,23,24.许多研究强调了传统方法的局限性,并强调了可以捕捉胰腺内动态相互作用的技术的重要性 25,26,27。从小鼠到人类胰腺的切片技术的适应性,加上它们与糖尿病胰腺器官捐献者网络(nPOD)等项目的整合,证明了人们越来越认识到该方法在解锁对1型糖尿病等疾病的宝贵见解的潜力。
Protocol
来自两性组织捐献者的人类胰腺切片是通过佛罗里达大学糖尿病胰腺器官捐献者网络 (nPOD) 组织库获得的。根据器官捐赠法律法规,没有标识符的已故个体的器官组织已被确定为非人类受试者研究,并被佛罗里达大学机构审查委员会 (IRB;IRB no. 392-2008),放弃了征得同意的需要。专门用于该项目的nPOD组织被佛罗里达大学IRB(IRB20140093)批准为非人组织。
注意:对于完全不熟悉切片技术及其应用(如围灌注和钙成像)的读者,建议在处理人类样本之前获得使用小鼠或大鼠切片 3,28 的实践经验并发展基本技能。
1. 准备工作
注意:这些准备工作应在组织到达之前进行。
- 通过混合125mM NaCl,5.9mM KCl,2.56mM CaCl 2,1mM MgCl 2,25mM HEPES,0.1%BSA,2mM L-丙氨酸,L-精氨酸和L-谷氨酰胺制备HEPES缓冲液。将 pH 值调节至 7.4 并过滤灭菌。
- 向缓冲液中加入葡萄糖和/或其他刺激物,以制备用于围灌注实验的溶液。对于基线缓冲液,加入 5.5 mM 葡萄糖。该缓冲液将用于切片程序、切片收集和腹膜灌注准备。
- 通过向基线缓冲液中加入抑肽酶 (10 μg/mL) 来准备至少两个用于切片收集的培养皿。
- 在不含BSA和氨基酸的HEPES缓冲液(125mM NaCl,5.9mM KCl,2.56mM CaCl 2,1mM MgCl 2,25mM HEPES)中制备3.8%低熔点琼脂糖溶液,并将其保持在37°C。
- 通过将新刀片放入支架中来组装振动切片机。如果适用,将刀片角度设置为 15°(如果使用 Leica VT1200S)。如果适用,校准振动切片机。
- 打开腹膜灌注机,选择腔室数量和程序协议。
- 将所有必要的溶液放入腹膜融合机中,灌注系统并保持溶液加热。该机器会计算用于协议的每种溶液的必要体积。
2. 组织处理
注意:切片应在收到后立即生成。任何延误都可能导致手术困难并导致组织退化。
- 在立体显微镜下将胰腺组织置于具有基线缓冲液的培养皿中(图1A)。使用镊子和剪刀轻轻去除结缔组织、纤维化组织和脂肪组织。
- 使用剪刀或手术刀将组织切成约0.5cm3 的多个小块(图1B)。在薄纸上吸干胰腺碎片。
- 将 4 块转移到 35 毫米培养皿中,并用琼脂糖溶液填充培养皿,直到所有块完全浸没。让琼脂糖完全凝固。
- 小心地从琼脂糖中切出几块。将手术刀沿着培养皿的边缘运行,以去除琼脂糖并小心地分离组织块。确保碎片被一层薄薄的琼脂糖包围。
3. 切片
- 将组织片倒置在振动切片机的金属板上,将它们粘在金属板上。
- 将板安装到托盘中,并用基线缓冲液(含有 5.5 mM 基线葡萄糖的 HEPES)填充托盘。
- 将振动切片机设置为 120 μm 的自动切片,并调整开始和结束位置。
- 将刀片移动到组织上方,然后以慢速 (0.1 mm/s) 和 0.8 mm 的振幅开始切片。如果组织允许,可以提高速度(图1C)。
- 使用弯曲的镊子或小刷子收集切片。在含有抑肽酶的基线缓冲液中积累切片(图1D)。
- 让切片在含有抑肽酶的基线缓冲液中静置至少 1 小时。将切片放在缓慢的轨道振荡器上,以冲洗掉切割过程释放的酶。
4. 活/死检测
注意:这是一种可选的测定方法,可在手术后显示组织切片的活力。但是,切片一旦染色就不能重复使用。
- 在充满基线缓冲液的孔中转移单片。
- 加入荧光素二乙酸酯(FDA,50μg/ mL),在室温下孵育1分钟,避光保存。
- 加入碘化丙啶(PI,50μg/ mL),在室温下孵育1分钟,避光保存。
- 将切片转移到另一个装满 PBS 的孔中洗涤 1 分钟。
- 将切片转移到培养皿中或安装在带有盖玻片的载玻片上以进行成像(图2A,B)。
5. 围灌注
注:该协议描述了如何对组织切片进行动态围融合,但它也适用于分离的胰岛。按照机器用户手册中所述,在加载胰岛之前,需要用滤纸和珠子溶液制备胰岛室。但是,胰岛和切片室可以在同一实验中一起使用。
- 选择 3 片,并在体视显微镜下使用刷子和手术刀将琼脂糖修剪到最小。
- 在切片室的网格上加入一滴基线缓冲液(含有5.5mM基线葡萄糖的HEPES),然后轻轻地将一个切片放在网格上。对3个切片中的每一个重复上述步骤(图3A)。如果切片非常小,则堆叠超过 3 个腔室以增加胰岛数量。不要在每个腔室放置超过一片切片。
注意:每片胰岛的数量在供体之间差异很大,并且取决于切片大小(10-100 个胰岛/切片)。总共 3 片已被证明足以测量胰岛素和胰高血糖素的分泌。 - 对于分离的胰岛,每列至少使用 30 个胰岛来分泌胰岛素。建议使用 100 个胰岛进行胰高血糖素检测。从上到下组装各个切片室部件。
- 将切片室连接到机器中的流入和流出管,并启动协议(图 3C)。
- 在协议期间使用腔室加热和托盘冷却泵。在方案期间更换收集板,如果在同一天进行定量,则将其储存在4°C,或在此之前储存在-80°C。
- 当方案完成时,移除腔室,拆卸并收集切片进行裂解(3%HCl在无水乙醇中)或固定(在4%多聚甲醛中)。
- 用水、10% 漂白剂、水和空气冲洗机器以清洁机器。
- 使用市售检测试剂盒量化激素分泌。
注: 图 4 显示了 3 片胰岛素和胰高血糖素分泌的绝对水平,以估计浓度范围。
6. 钙成像
- 根据制造商说明制备钙染料(例如,Fluo4-AM、Calbryte)溶液。
- 在基线HEPES缓冲溶液中稀释染料,并加入抑肽酶(10μg/ mL)。
- 转移单片并在室温下在轨道振荡器上孵育 30-60 分钟,避光保存。
- 在孵育期间,通过填充灌注期注射器和引液管来准备切片成像设置(图5A,B)。
- 连接所有设备,打开加热器,启动泵流量。建议同时使用流入加热和平台加热器,流速为 0.5 mL/min。
- 轻轻地将单片放入成像室中,并用竖琴固定。
- 使用低放大倍率物镜识别成像区域。使用反射有助于识别胰岛面积(图5C)。
- 切换到更高放大倍率的物镜(例如,20 倍或 40 倍)并根据实验设置调整位置。
注意:为确保最佳细胞活力和胰岛完整性,建议光学切片应位于切割表面下方 1-2 个细胞层。 - 设置 z-stack 和/或瓦片扫描位置。设置成像间隔和记录持续时间。在这里,使用至少 256 x 256 的分辨率来区分单个细胞,成像间隔为 5-10 秒,z 堆栈范围(如果适用)为 30-60 μm,平面(一个细胞层)之间的间隔为 10 μm。有关详细的成像设置,请参见 图 6 。
注意:设置成像参数以获得最佳分辨率和最大面积,但避免漂白样品。 - 开始成像,根据实验切换溶液流入量。完成后,收集切片并固定它们进行免疫组织化学。
Representative Results
当方案成功执行时,1g胰腺组织产生约100-200片。随后,这些切片应进行体视显微镜检查,以识别那些富含胰岛的切片,然后再进行功能评估。通过用荧光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI) 标记来确定活力,预计达到 80%-90%(图 2A)。由于切片过程中的细胞损伤,切割表面的活力可能会明显降低。在活切片中,观察到动态激素分泌(图2B),在暴露于高葡萄糖和氯化钾(KCl)膜去极化时导致强大的胰岛素释放。
相反,当切片过程中出现延迟或组织质量欠佳时,结果会大不相同。获得的切片数量可能会减少,并且活力评估可能表明用PI标记的非活性细胞的比例更高(图2C)。在这些情况下,功能评估表明对高血糖和膜去极化的反应减弱甚至不存在(图2D)。来自次优实验的数据说明了及时精确执行和组织质量的重要性,因为它们可能导致组织活力降低和功能受损。这些负面结果是一个有价值的提醒,提醒我们这种方法成功需要考虑的关键因素。
钙成像中的常见发现以热图形式可视化,如图 5D 所示,或作为单个细胞的单独迹线,如图 5E 所示。需要强调的是,染料会不加区别地标记所有细胞类型,因此特异性刺激对于根据细胞的反应区分细胞至关重要。为了鉴定活细胞,我们采用KCl,并根据超过平均基线反应两个标准误差以上的响应对细胞进行排序。此外,切片可以进行固定和染色,从而能够识别细胞类型。
图 1:组织处理和切片。 (A) 1 g 未处理的胰腺组织。(B) 清洁的胰腺碎片,准备琼脂糖包埋。(C) 使用振动切片机的切片程序。(D) 新鲜切开的人胰腺切片。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:组织活力和胰岛素分泌数据。 (A) 活组织切片的代表性图像。反射激光的最大强度投影(灰色,左上角),死细胞的PI(红色,左下角),活细胞的FDA(绿色,右下角),以及活细胞和死细胞的合并图像(右上角)。虚线表示一个小岛。比例尺 50 μm。 (B) 来自单个非糖尿病供体的人胰腺组织切片的动态胰岛素分泌。胰岛素动力学显示高血糖刺激 6 分钟后第一阶段峰值反应,然后是平台期第二阶段。数据归一化为 5.5 mM 葡萄糖(刺激指数、倍数变化)的平均基线分泌物。如(A)所示,已对来自同一供体的切片进行分泌。(C) 无活性组织切片的代表性图像。反射激光的最大强度投影(灰色,左上角),死细胞的PI(红色,左下角),活细胞的FDA(绿色,右下角),以及活细胞和死细胞的合并图像(右上角)。虚线表示一个小岛。比例尺 50 μm。 (D) 来自单个非糖尿病供体的人胰腺组织切片的动态胰岛素分泌。胰岛素动力学显示葡萄糖刺激的胰岛素分泌和 KCl 的膜去极化均明显丢失,数据归一化为 5.5 mM 葡萄糖的平均基线分泌(刺激指数、倍数变化)。如(C)所示,已对来自同一供体的切片进行分泌。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:动态围灌注的组织负荷。 (A) 堆叠切片室。单个切片被加载到金属网格上,如插件所示。(B) 在胰岛室中装载分离的胰岛。切片室和胰岛室连接到腹膜融合机。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:切片和分离胰岛中的激素分泌。与图(C)和(D)相比,图(A)和(B)中显示的数据来自不同的捐赠者。(A) 来自单个非糖尿病供体的 3 个胰腺组织切片的绝对激素分泌。胰岛素分泌呈绿色,胰高血糖素分泌呈品红色。(B) (A) 中所示的激素分泌归一化为总激素含量(含量的百分比)。含量是从实验中使用的所有 3 个切片中测量的。(C) 来自同一非糖尿病供体的分离胰岛(100 个胰岛)和胰腺组织切片(3 个切片)的动态胰岛素分泌。数据以绝对数 (mU/L) 显示。(D)(C)中所示的胰岛素分泌归一化为总胰岛素含量(含量的百分比)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:成像设置和预期结果。 (A) 使用正置共聚焦显微镜和围灌注装置进行功能成像的设置。(B) 与进水口和出水口相连的成像室。(C) 来自健康人类供体的组织切片内胰岛的 Z 轴共聚焦图像堆栈,显示反射光(顶部)和 Fluo4 信号(底部)。反射用于识别切片内的小岛(虚线)。(D) 热图显示胰岛细胞 的体外 Ca2+ 动力学,表示为 Fluo4 的荧光强度归一化为在 5.5 mM 葡萄糖和高葡萄糖 (16.7 mM) 刺激下的基础信号强度。每行代表 x 轴上随时间推移跟踪的单个细胞,以及它们在荧光强度相对于基线 (dF/F) 的幅度变化 (%) 方面的响应,在色标中显示从蓝色(低强度)到红色(高强度)。(E) 4 个单独细胞的代表性痕迹显示对高葡萄糖的反应。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:钙成像设置。 选择执行 40 μm 延时记录(XYZT 成像)的代表性设置的软件屏幕截图。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在这里,我们提出了一种方案来生成可行的胰腺组织切片及其用于功能性读数,如动态激素分泌和功能成像。与人胰岛分离类似,切片程序的成功受多种因素的影响,包括供体特性、组织运输时间和组织质量25,29。因此,仔细选择用于实验的组织样本并将缺血时间保持在最低限度至关重要。在这种情况下,除了尸体捐献者之外,还应仔细考虑其他可能的人体组织来源。包括手术供体提供了将功能性切片数据与来自同一患者的相关体内信息相结合的选项,从而增强了转化相关性11。然而,这种组织来源带来了其他因素,因为活检通常来自接受胰腺切除术的老年患者,主要是由于局部肿瘤。值得注意的是,胰腺活检不是在糖尿病的情况下进行的。
在执行实际切片程序时,及时的组织处理至关重要。切片可以储存数小时,如本协议所述,或如Qadir等人19所述长时间培养。目前,该协议是长时间维持切片活力的唯一方法,然而,未来的努力应评估不同培养时期的功能变化,并与来自同一供体的分离胰岛进行比较。
该过程中最关键的步骤是在包埋琼脂糖之前仔细进行组织制备。大的导管和纤维化组织会使切片过程复杂化,并可能导致组织块从琼脂糖中脱落。如果发生这种情况并且碎片保持合理的尺寸,则可以对它们进行重新加工和嵌入以进行切片。保持良好的组织质量和精心处理可以大大提高切片程序的效率,并产生最大数量和质量的切片。从组织制备到切片生成所经过的时间不应超过 2-3 小时,因为较长的间隔会显着影响组织活力。
在切片围灌注过程中,一个简单而关键的步骤是对切片进行精确修剪,以确保与腔室完美贴合。这样可以对组织进行适当的沐浴和不间断的流动。一旦协议启动,就必须避免进一步操纵腔室,以防止激素释放中不必要的峰值。应准备足够的缓冲液,并且管道应到达溶液的底部,以防止空气吸入和腔室干涸。
对于钙成像,根据实验需求和设计,仔细选择感兴趣的区域非常重要。通过选择可减少光曝光或缩短总体方案时间的成像参数来最大限度地减少光漂白非常重要。与动态激素分泌一样,保持适当的溶液流动和加热设置至关重要,因为切片需要接近生理条件才能实现最佳功能(例如,37°C)。
胰腺组织切片有效地保持了胰腺的结构完整性,保留了其不同细胞类型之间的细胞间连接。因此,它们提供了一种处理孤立胰岛的替代方案,促进了对内分泌和外分泌功能及其相互作用的同时探索。为了评估各个细胞类型的相互作用,区分它们至关重要。事后染色是一种选择,但它在可用的荧光探针和定位精确细胞层的挑战方面存在局限性。因此,建议将细胞特异性刺激纳入方案中,以实现基于反应的细胞鉴别。为了区分小鼠或人类切片中的细胞类型,有效的刺激包括α细胞的肾上腺素21,30,δ细胞的生长素释放肽31,腺泡细胞的蔚蓝素5,32,导管细胞的胆汁酸33和血管细胞的去甲肾上腺素22。类似的刺激可用于测量分泌反应。影像学研究侧重于单个细胞,而分泌研究则分析集体反应。因此,包含足够数量的切片以检测所需的结果至关重要。最佳数量可能因细胞类型而异,三个切片证明对内分泌细胞足够了;但是,建议使用更多切片来确保可检测性,而不是冒着丢失有价值信息的风险。
与任何其他方法一样,组织切片具有局限性,在解释结果时应考虑这些局限性。针对特定细胞类型的刺激应用可能会对切片中的其他细胞类型产生影响,从而可能触发反馈循环。然而,这些对于研究也很重要,因此测量的反应可以更能代表生理反应。对于选择性细胞靶向,可以使用传统的 体外 方案。重要的是,腺泡细胞含有胰酶,可以分解蛋白质并消化组织切片,导致细胞在几个小时内降解。为了保持活力,当切片处于静态状态时,一致使用胰蛋白酶抑制剂是必不可少的,即使它们的应用可能会干扰用于标记目的的病毒的成功转移。
与胰岛分离相比,供体变异性和组织质量会影响所获得切片的数量和活力。切片后活力不足可能导致寿命短,并阻碍切片培养的能力。此外,供体之间的胰岛数量可能会有很大差异,因此在进行实验之前估计胰岛含量具有挑战性。因此,仔细选择供体接受标准并实施适当的标准化方法,例如分泌激素含量的百分比或倍数变化到基线的百分比至关重要。为了获得一致的结果,建议在实验前评估组织切片的活力。此外,建议在实验中加入相关的控制刺激(例如,KCl)。在单个细胞分析(例如成像)的情况下,可以根据细胞对这些控制刺激的反应对细胞进行预分选。尽管存在上述挑战,但切片为当前的研究方法提供了宝贵的增强。
所描述的方案可以用作几种应用的起点,并且可以操纵胰腺切片,并在各种刺激后检查反应。我们还将读者引导至大量利用小鼠或人类胰腺切片的研究,为那些计划实验的人提供了宝贵的见解。将来,有可能使用胰腺切片来研究潜在的疗法,或者可以对疾病机制进行建模。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究是在糖尿病胰腺器官捐献者网络 (nPOD;RRID:SCR_014641),一个由JDRF支持的合作1型糖尿病研究项目(nPOD:5-SRA-2018-557-Q-R)和Leona M.&Harry B. Helmsley慈善信托基金(Grant#2018PG-T1D053,G-2108-04793)。所表达的内容和观点是作者的责任,并不一定反映nPOD的官方观点。与 nPOD 合作提供研究资源的器官采购组织 (OPO) 列在 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/。作者感谢捐赠者及其家人的宝贵贡献。这项工作得到了美国糖尿病协会 4-22-PDFPM (J.K.P.) 和 Leona M. 和 Harry B. Helmsley 慈善信托基金(拨款 2015-PG-T1D-052)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |
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