Summary
يستخدم البروتوكول الفحص المجهري المتقدم للصفائح الضوئية جنبا إلى جنب مع طرق إزالة الأنسجة المكيفة للتحقيق في الهياكل القلبية المعقدة في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.
Abstract
يلعب المجهر ذو الصفيحة الضوئية (LSM) دورا محوريا في فهم البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) للقلب ، مما يوفر رؤى حاسمة في فسيولوجيا القلب الأساسية والاستجابات المرضية. نتعمق هنا في تطوير وتنفيذ تقنية LSM لتوضيح البنية الدقيقة للقلب في نماذج الفئران. تدمج المنهجية نظام LSM المخصص مع تقنيات إزالة الأنسجة ، مما يخفف من تشتت الضوء داخل أنسجة القلب للتصوير الحجمي. يسمح الجمع بين LSM التقليدي مع خياطة الصور وطرق إزالة الالتفاف متعددة الرؤية بالتقاط القلب بأكمله. لمعالجة المفاضلة المتأصلة بين الدقة المحورية ومجال الرؤية (FOV) ، نقدم أيضا طريقة مجهر الورقة الضوئية (ASLM) التي اجتاحتها محوريا لتقليل الضوء خارج التركيز البؤري وإضاءة القلب بشكل موحد عبر اتجاه الانتشار. في غضون ذلك ، تعمل طرق إزالة الأنسجة مثل iDISCO على تعزيز تغلغل الضوء ، مما يسهل تصور الهياكل العميقة وضمان فحص شامل لعضلة القلب في جميع أنحاء القلب بأكمله. يقدم الجمع بين LSM المقترح وطرق إزالة الأنسجة منصة واعدة للباحثين في حل الهياكل القلبية في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.
Introduction
لا يزال قصور القلب هو السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم ، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص القدرة على التجدد لخلايا عضلة القلب الناضجة1. تلعب البنية المعقدة للقلب دورا حاسما في وظيفته وتوفر نظرة ثاقبة للعمليات التنموية. يعد الفهم العميق لبنية القلب أمرا ضروريا لتوضيح العمليات الأساسية لتشكل القلب وإعادة تشكيله استجابة لاحتشاء عضلة القلب. وقد أظهر التقدم الأخير أن الفئران الوليدية يمكنها استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، في حين تفتقر الفئران البالغة إلى هذه القدرة على التجدد2. هذا يضع أساسا للتحقيق في الإشارات المرتبطة بالتشوهات الهيكلية والوظيفية في نماذج الماوس. طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود فنية ، بما في ذلك عمق الاختراق المقيد ، ونظام المسح البطيء للنقاط ، وتلف الصور الناتج عن التعرض الطويل لضوء الليزر. هذه تعيق التصوير الشامل ثلاثي الأبعاد (3D) للقلب السليم. في هذا السياق ، يظهر المجهر ذو الألواح الضوئية (LSM) كحل قوي ، حيث يوفر مزايا التصوير عالي السرعة وتقليل تلف الصور وقدرات التقسيم البصري الاستثنائية3،4،5. الميزات الفريدة ل LSM تضعها كطريقة واعدة للتغلب على قيود التقنيات التقليدية ، مما يوفر رؤى غير مسبوقة في تطوير القلب وعمليات إعادة التصميم6،7،8.
في هذا البروتوكول ، نقدم استراتيجية تصوير تجمع بين LSM المتقدم وأساليب إزالة الأنسجةالمعدلة 9 ، مما يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها دون الحاجة إلى وضع علامات محددة وتقسيم ميكانيكي. نقترح أيضا أنه يمكن تحسين تصوير LSM التقليدي من خلال تقنيات إزالة الالتفاف متعدد الرؤية10 أو تقنيات الفحص المجهري للصفائح الضوئية (ASLM)11،12،13،14،15 لتحسين الدقة المحورية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي دمج خياطة الصور مع أي من هذه الطرق إلى التغلب بشكل فعال على المفاضلة بين الدقة المكانية ومجال الرؤية (FOV) ، وبالتالي تطوير تصوير قلوب الفئران البالغة. يتيح دمج العديد من أساليب إزالة الأنسجة ، بما في ذلك الأساليب الكارهة للماء ، والمحبة للماء ، والقائمة على الهيدروجيل ، تغلغل أعمق للضوء لالتقاط مورفولوجيا القلب بأكمله16،17،18،19.
في حين أن طرق التطهير المتعددة متوافقة مع أنظمة LSM الحالية ، فإن الهدف هو تقليل تشتت الفوتون وتعزيز تغلغل الضوء في الأنسجة ، مثل القلب ، عن طريق استبدال الدهون بوسط يتطابق بشكل وثيق مع معامل الانكسار. تم اختيار iDISCO كممثل20,21 وتم تكييفه للتصوير الذاتي في هذا البروتوكول نظرا لمعالجته السريعة وشفافيته العالية (الشكل 1 أ). بشكل جماعي ، يوفر تكامل نهج LSM المتقدم مع تقنيات إزالة الأنسجة إطارا واعدا لكشف تشريح القلب المعقد في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لتعزيز فهمنا لتشكل القلب والإمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكولات والتجارب الحيوانية وأجريت تحت إشراف لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة تكساس في دالاس (IACUC # 21-03). تم استخدام الفئران C57BL6 ، بما في ذلك حديثي الولادة في اليوم الأول بعد الولادة (P1) والبالغين بعمر 8 أسابيع ، في هذه الدراسة. لم يلاحظ أي فرق بين الذكور والإناث. تم إجراء جميع عمليات الحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة للصور باستخدام برامج أو منصات مفتوحة المصدر مع تراخيص بحثية أو تعليمية. الموارد متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.
1. تحضير العينات وتنظيف الأنسجة (6 - 10 أيام)
- تحضير جميع المحاليل الكيميائية في جدول المواد اللازمة لطريقة إزالة الأنسجة قبل البدء في إجراء إزالة الأنسجة.
ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات في غطاء الدخان أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، خاصة عند التعامل مع المواد الكيميائية السامة. - القتل الرحيم للحيوانات مع CO2 عن طريق وضعها في غرفة CO2 في النقاط الزمنية المطلوبة ، مثل P1 و 8 أسابيع ، لجمع القلب بالكامل وغمر القلب المعزول حديثا في درجة حرارة الغرفة (RT) في 0.2 M KCl للقبض في الانبساط16.
- ثبت القلب عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) مع تحريض لطيف على الروك طوال الليل للحفاظ على تشريح القلب عند 4 درجات مئوية ، انظر الجدول 1.
تنبيه: PFA مادة كيميائية سامة ويجب إجراؤها تحت غطاء الدخان. - اغسل القلب باستخدام 1x PBS في RT لمدة 30 دقيقة ، 3x.
ملاحظة: اختياري: قم بتضمين القلب في هلام الأغاروز لإنشاء مجموعة قلب لنظام LSM المصمم خصيصا في الخطوة 2 كما هو موضح أدناه.- تحضير محلول الأغاروز 1 ٪ عن طريق إذابة الأغاروز في برنامج تلفزيوني وتسخين الخليط في الميكروويف حتى يذوب تماما. صب المحلول في قالب لإنشاء طبقة سفلية حتى يبرد المحلول إلى 40 درجة مئوية.
- ضع القلب في القالب واملأ القالب بهلام الأغاروز حتى يصلب. تخلص من أي فقاعات في هلام الأغاروز لتقليل القطع الأثرية في التصوير.
ملاحظة: يقلل تضمين العينة من خطر حدوث تلف محتمل لتشريح القلب أثناء التركيب.
تنبيه: استخدم الأغاروز منخفض درجة الانصهار وتجنب وضع القلب مباشرة في أغاروز ساخن للتخفيف من خطر تعريض العينة لدرجات حرارة مرتفعة.
- تجفيف القلب باستخدام تدرجات الميثانول الممزوج بالماء منزوع الأيونات (الشكل 1 ب) ، والمعالجة من خلال تركيزات متسلسلة تبلغ 20٪ و 40٪ و 60٪ و 80٪ و 100٪ كما هو موضح في الجدول 1. كرر مع الميثانول الطازج 100٪ 1x لضمان الجفاف التام. تجفيف قلوب الفئران حديثي الولادة لمدة 1 ساعة في كل خليط الميثانول مع الهز. اضبط وقت الحضانة على 2 ساعة لقلوب الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع وقلوب الفئران.
تنبيه: الميثانول مادة كيميائية متطايرة ومزعجة وقابلة للاشتعال. - استبدل القلب بمحلول ميثانول طازج 100٪ وقم بتبريده لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- استبدل المحلول وقم بتبييض القلب ب 5٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) في الميثانول باستخدام نسبة حجم 1: 5 (30٪ H2O2 إلى 100٪ ميثانول) طوال الليل عند 4 درجات مئوية لإزالة الأصباغ.
ملاحظة: تسمح إزالة الأصباغ بتقليل امتصاص الفوتون ، مما يؤدي إلى تحسين جودة الصورة مع تقليل القطع الأثرية. - استبدل المحلول واحتضان القلب في ميثانول 100٪ لمدة 1 ساعة في RT.
- قم بإزالة الدهون من القلب بمحلول يحتوي على 66٪ ثنائي كلورو ميثان (DCM) و 33٪ ميثانول لمدة 3 ساعات مع الهز. تأكد من غرق القلب في قاع القارورة بنهاية هذه الخطوة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتجديد المحلول (66٪ DCM / 33٪ ميثانول) وقم بتمديد وقت الحضانة (على سبيل المثال ، 1 ساعة أخرى) لتحقيق إزالة الدهون الكاملة. انقل القلب إلى محلول جديد بسرعة لمنع الجفاف ، لأن DCM شديد التقلب.
تنبيه: استخدم البولي بروبلين أو الأواني الزجاجية للتجربة ، لأن DCM غير متوافق مع البوليسترين. - استخدم ثنائي بنزيل الأثير (DBE) لمطابقة معامل الانكسار (RI = 1.56). بالنسبة لقلوب الفئران حديثي الولادة ، تستغرق عملية مطابقة معامل الانكسار 2 أيام ، بينما بالنسبة لقلوب الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع ، تستغرق 5 أيام مع اهتزاز خفيف. استبدله ب DBE جديد وقم بتمديد وقت الحضانة حتى يحقق القلب الشفافية الكاملة.
تنبيه: DBE خطير. تجنب أي اتصال مع الجلد.
2. تركيب عينة (1 يوم)
ملاحظة: في حالة استخدام نظام LSM تجاري ، اتبع بروتوكوله المحدد الذي توفره الشركة لإصلاح القلب وتخطي الخطوات 2.1 - 2.9.
- قم بتخصيص حجرة وحامل مقاوم لمحلول مطابقة معامل الانكسار (على سبيل المثال ، DBE في نهج iDISCO المعدل) باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد ومواد Onyx (الشكل 2A)16.
- قم بتثبيت مغناطيس في الجزء السفلي من الغرفة لتسهيل الاتصال السريع والتوطين الدقيق تحت نظام LSM (الشكل 2B).
- قم بتوصيل نظارات غطاء مقاس 25 مم × 50 مم × 0.17 مم بالغرفة باستخدام غراء سيليكون شفاف وتحقق من سلامة مقاومة الماء للغرفة عن طريق ملئها ب DBE والتحقق من وجود تسربات بعد يوم 1.
- قم بتخصيص حامل المشبك باستخدام طابعة 3D وقم بتثبيت مغناطيس لتركيب مجموعة القلب داخل الحجرة (الشكل 2C) أو أدخل إبرة في هلام الأغاروز لتركيب مجموعة القلب.
- تنفيذ تطوير نظام LSM داخلي باستخدام عدسة أسطوانية وليزر الحالة الصلبة (DPSS) الذي يتم ضخه بالصمام الثنائي المستمر كما تم الإبلاغ عنه سابقا16,22. استخدم الطول الموجي للإثارة البالغ 532 نانومتر لالتقاط التألق الذاتي من عضلة القلب (الشكل 2D).
- قم بتركيب الغرفة على مرحلة 6 أبعاد وحدد الموضع الأمثل حيث تكون الغرفة عمودية على اتجاه انتشار الليزر.
- استخدم حامل مشبك مغناطيسي لوضع العينة في منتصف الغرفة وتوصيل الحامل بمرحلة آلية 4 الأبعاد (X ، Y ، Z ، و Yaw ؛ الشكل 2 د).
- اغمر مجموعة القلب في الحجرة المملوءة ب DBE باستخدام المرحلة الآلية وحدد نطاق المسح على طول محور الكشف (الاتجاه Z).
- حدد سرعة المسح (Vz) للمحرك على طول الاتجاه Z بناء على حجم الخطوة (S) ووقت الحصول على صورة (T) باستخدام المعادلة التالية:
ملاحظة: تلتزم العلاقة بين حجم الخطوة والدقة المحورية لنظام التصوير بنظرية أخذ العينات Nyquist-Shannon. فعلى سبيل المثال، حدد حجم الخطوة ب 1 ميكرومتر، بالنظر إلى أن الاستبانة المحورية كانت 2.91 ميكرومتر، كما هو مبين في التقريرالسابق 16. - للتحقق من الدقة المكانية وتقليل مشكلات العتامة المحتملة على أعماق مختلفة ، قم بقياس وظيفة انتشار النقطة (PSF) للنظام عن طريق تصوير حبات الفلورسنت بقطر 0.53 ميكرومتر مخفف في هلام أغاروز منخفض نقطة انصهار بنسبة 1٪ بتركيز 1: 1.5 × 105. احسب PSF عبر العينة بأكملها عن طريق قياس العرض الكامل بنصف الحد الأقصى (FWHM)16.
3. خياطة الصورة (4-8 ساعات)
- احسب عدد البلاط المطلوب لتغطية قلب الماوس بالكامل ، مع الأخذ في الاعتبار FOV المحدود. لكل بلاطة ، تتوافق الأبعاد مع مجال الرؤية لنظام LSM. على سبيل المثال ، يتطلب قلب الفأر الوليدي بقياس مقطعي عرضي يبلغ 3 × 3.6 مم2 بلاطة 2 × 2 للتغطية في LSM المخصص (الشكل 3 أ). في المقابل ، يتطلب قلب الفأر البالغ من العمر 8 أسابيع بقياس 5 × 8 مم2 3 × 4 بلاطات لتغطية بنية القلب بأكملها (الشكل 3 ب).
ملاحظة: مطلوب خياطة الصورة إذا كان LSM التقليدي لديه مجال رؤية محدود لتصوير القلب كله. - التقط صورا للقلب بدءا من البلاط 1 ، أي بلاط الزاوية العلوية اليسرى للقلب (الشكل 3A-B).
- التقط صورا بالتجانب المتبقي بالتتابع مع تداخل بنسبة 10٪ بين المربعات المتتالية حتى يتم تغطية القلب بالكامل ، كما هو موضح في الشكل 3C.
- قم بتنزيل وتثبيت برنامج Fiji23 مفتوح المصدر. قم بتنزيل وتثبيت المكون الإضافي Fiji ، BigStitcher24.
- انتقل إلى قائمة المساعدة ، وحدد تحديث ، واختر إدارة موقع التحديث ، واختر BigStitcher. بعد ذلك ، انقر فوق إغلاق ، متبوعا بتطبيق التغييرات. عند الانتهاء من تنزيل المكون الإضافي ، أعد تشغيل برنامج فيجي.
- افتح المكون الإضافي BigStitcher واستورد جميع المربعات الضرورية من خلال دليل ملف الصورة. احفظ مجموعة البيانات كملف HDF5.
- تنظيم البلاطات باختيار نقل البلاطة حسب الشبكة العادية، حدد النموذج المستخدم لتحريك القلب، وحدد تداخل 10٪ بين كل بلاطة. قم بخياطة البلاطات باستخدام خيار معالج الخياطة.
- قم بتصدير البيانات المخيطة باستخدام Image Fusion ، لإنشاء ملف tiff.
4. إزالة الالتفاف متعدد المشاهدات (5 أيام)
- استخدم حبات الفلورسنت لتسجيل صور إعادة الإعمار متعددة المشاهدات على طول القلب (الشكل 3D).
- تحضير الراتنج25 عن طريق خلط ثنائي الفينول-أ ديجليسيديل الأثير (D.E.R. 332) ، إيزوفورون ديامين ، 5-أمينو-1،3،3-ثلاثي ميثيل سيكلو هكسانيثيل أمين (IPDA) ، والبولي بروبيلين غليكول ديجليسيديل الأثير (D.E.R 736) بنسبة حجم 4: 1: 1.
- أجهزة الطرد المركزي 10 ميكرولتر من حبات مضان في 161 × غرام لمدة 5 دقائق وإضافة 20 ميكرولتر من الميثانول لتحل محل حل تخزين الخرزات. كرر ذلك 3x.
- قم بإعداد محلول 10 مل بتركيز حبة 1: 1 × 105 عن طريق خلط محلول حبة الميثانول في الراتنج المحضر في الخطوة 4.1.1.
- قم بإزالة المحلول في غرفة مفرغة لمدة 3 ساعات لإزالة الجيوب الهوائية والفقاعات.
- صب المحلول في قالب سيليكون أو قش شرب بلاستيكي وانتظر لمدة 2 إلى 3 أيام حتى يصلب. بعد 1 يوم قبل أن يصبح الراتنج صلبا ، ضع الأنبوب الزجاجي داخل القالب وانتظر حتى يعلق الأنبوب على الراتنج. قم بإزالة الراتنج من القالب باستخدام الأنبوب الزجاجي (الشكل 3 د).
- ضع القلب في الأنبوب الزجاجي ، واملأه ب DBE ، وقم بتركيب الأنبوب الزجاجي في الحجرة المملوءة ب DBE.
- التقط صورا متسلسلة لقلب الفأر مع الخرز من القسم المضيء عن طريق مسح مجموعة القلب عبر محور الكشف (المحور Z; الشكل 3E-F).
ملاحظة: قم بتنفيذ خياطة الصور في الخطوة 3 لإنشاء حزم فردية من الصور إذا تجاوز حجم القلب مجال الرؤية. - قم بتدوير قلب الماوس 60 درجة على طول المحور Y لالتقاط الأكوام اللاحقة من زوايا متعددة ، أي 0 درجة و 60 درجة و 120 درجة و 180 درجة و 240 درجة و 300 درجة (الشكل 3E-F).
- افتح المكون الإضافي BigStitcher واستورد جميع الصور من خلال دليل ملف الصورة. احفظ مجموعة البيانات كملف HDF5.
- اختر اكتشاف نقاط الاهتمام وحدد يدويا حبات الاهتمام للتسجيل.
- حدد نموذج تحويل Affine للتسجيل. اختر وظيفة انتشار النقاط وقم بتعيين PSF لجميع طرق العرض.
- انقر فوق Multiview Deconvolution واختر نوع التكرار على أنه Bayesian فعال. حدد عدد التكرارات على أنه 10 وقم بتنفيذه26.
- انقر فوق Image Fusion لتصدير ملف tiff .
ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات التفصيلية حول فك الالتفاف متعدد المشاهدات في تقارير أو بروتوكولات أخرى24،27،28.
5. اجتاحت محوريا أجهزة نظام ورقة الضوء (1 يوم)
- قم بتركيب عدسة كهربائية قابلة للضبط (ETL) على مستوى فورييه للعدسة الأسطوانية (CL) 27 (الشكل 2D) لمسح شعاع الليزر محوريا14. تأكد من أن الواجهة السائلة في ETL أفقية لمنع تشوه واجهة الموجة الناجم عن الجاذبية. قم بمحاذاة ETL بدقة لتقليل انحرافات الحزمة والانحرافات الضوئية ذات الترتيب الأعلى30.
- قم بتثبيت بطاقة DAQ في محطة العمل وقم بتوصيل كبل BNC ببطاقة DAQ لمزامنة التعرض للكاميرا ومسح ETL.
- افتح غلاف برنامج تشغيل ETL وقم بإزالة الغطاء (الشكل 4).
- قم بلحام سلك إشارة كبل BNC بالتناظرية في دبوس B ، كما هو موضح في الجزء السفلي من لوحة PCB (الشكل 4).
- لحام السلك الأرضي لكابل BNC بدبوس GND ؛ بعد ذلك ، قم بتوصيل الطرف الآخر من كابل BNC ب AO (الإخراج التناظري) في بطاقة DAQ (الشكل 4).
- قم بتوصيل برنامج تشغيل ETL بمنفذ USB الخاص بمحطة العمل ، وقم بتوصيل برنامج التشغيل ب ETL باستخدام كبل hirose ، وقم بتثبيت برنامج Lens Driver Controller.
- قم بتغيير وضع التشغيل في برنامج وحدة التحكم في برنامج التحكم في برنامج تشغيل العدسة إلى تناظري للتحكم في ETL باستخدام مشغل تم إنشاؤه من بطاقة DAQ.
- في برنامج كاميرا sCMOS ، قم بتبديل وضع الالتقاط إلى خارجي (ورقة خفيفة). تأكد من أن اتجاه مسح البكسل النشط عمودي على اتجاه المسح الضوئي بالليزر للمساعدة في المزامنة.
- قم بتوصيل منفذ التشغيل الخارجي الموجود في الجزء الخلفي من كاميرا sCMOS ب AO لبطاقة DAQ باستخدام كابل BNC (الشكل 4).
6. اجتاحت محوريا مزامنة نظام ورقة الضوء (7 أيام)
- حدد وقت التعرض بناء على نسبة الإشارة إلى الخلفية المقبولة (SBR) والتي لا تقل عن 10 للدراسة المقترحة. قم بزيادة وقت التعرض إذا كان SBR أقل من 10.
ملاحظة: يوفر وقت التعرض الذي يتراوح من 10 إلى 50 مللي ثانية SBR مقبولا في هذا المشروع. - حدد وقت التقاط صورة (T) وفاصل الخط (L) بناء على وقت التعرض (E) للكاميرا وتردد ETL (f) باستخدام المعادلات التالية:
حيث يشير P إلى عدد أعمدة البكسل على مستشعر الكاميرا. المعلمات التمثيلية للمرجع هي f = 1 هرتز ، P = 2048 ، E = 10 مللي ثانية ، و L = 243 μs ، على التوالي. - في برنامج LabVIEW ، يقوم Trigger Generator.vi بإنشاء مشغلات مربعة ومثلثة للمزامنة (الشكل 5).
ملاحظة: يتوفر برنامج LabVIEW المخصص من المؤلفين بناء على طلب معقول. - جبل حبات الفلورسنت المخففة في 1٪ منخفضة نقطة انصهار هلامالأغاروز 16 بتركيز 1: 1 × 103 لتحديد موضع خصر الشعاع في الصورة (الشكل 6 أ).
- في البرنامج ، حدد نقاط البداية والنهاية لشعاع الليزر تحت مجال الرؤية عن طريق تغيير الجهد على طول اتجاه المسح.
- لمزامنة كاميرا sCMOS و ETL ، قم بمسح شعاع الليزر على طول المحور X والبكسل النشط على طول المحور Y لإنشاء صورة 2D (الشكل 6B). تشير الحبيبات الأكثر إشراقا ووضوحا على طول القطر في الصورة إلى التزامن الدقيق بين sCMOS و ETL.
ملاحظة: تعد مزامنة سرعة المسح الضوئي لتنشيط بكسل ETL و sCMOS أمرا بالغ الأهمية لجودة الصورة. يتم تلخيص العديد من الأخطاء غير المتزامنة الشائعة في الشكل 6C-F. - بعد تحديد معلمات المزامنة المثلى للمزامنة، قم بتدوير كاميرا sCMOS بزاوية 90 درجة حول المحور Z لمحاذاة اتجاه البكسل النشط مع اتجاه المسح بالليزر.
- كرر الخطوة 2.10 ، وقم بقياس FWHM ل PSF. استخدم نفس الطريقة كما هو موضح في التقريرالسابق 16 ، مع متوسط الاستبانات الجانبية والمحورية ل ASLM على 2.18 ميكرومتر و 2.88 ميكرومتر ، على التوالي (الشكل 7).
ملاحظة: الإضاءة والدقة الموحدة عبر مجال الرؤية بأكمله ممكنة في ظل ظروف مثالية (الشكل 7A-B). يمكن أن يؤدي التشغيل غير المتزامن ل ETL مع كاميرا sCMOS ، بالإضافة إلى عدم محاذاة الإضاءة والكشف ، إلى دقة مكانية غير موحدة (الشكل 7C-D). - بالنسبة لتصوير القلب ، بعد محاذاة النظام وتحديد المعلمات المثلى لمزامنة النظام ، تابع الخطوات من 2.6 إلى 2.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ثبت أن LSM يعزز دراسات القلب31،32،33،34،35،36،37 بسبب الحد الأدنى من مخاطر تلف الصور ، والدقة المكانية العالية ، والتقسيم البصري على عكس طرق التصوير البصري الأخرى مثل تقنيات برايت فيلد ومسح النقاط6،8،38،39،40. وبالتالي ، لفهم بنية عضلة القلب 3D بشكل أفضل ، أنشأنا البروتوكول بناء على الأساليب الأساسية بما في ذلك إزالة iDISCO المكيفة ، وخياطة الصور ، وإزالة الالتفاف متعدد المشاهدات ، و ASLM. بينما قدمنا النتائج باستخدام نماذج الفئران ، من المهم ملاحظة أن الفئران ونماذج القوارض الأخرى مناسبة أيضا للطرق المقترحة. يتيح بروتوكول إزالة الأنسجة المعدل جعل قلب الفأر P1 شفافا في غضون 4 أيام وقلب الفأر البالغ من العمر 8 أسابيع شفافا في غضون 7 أيام (الشكل 1 ب). تعمل هذه الخطوة كنقطة انطلاق لتقليل امتصاص الفوتون وتشتته في القلب السليم. يتيح فك الالتفاف متعدد المشاهدات تحسين الدقة المحورية عن طريق دمج الصور من وجهات نظر متعددة في نموذج واحد. بعد تسجيل الصور بالتتابع من 6 مناظر لنفس القلب ، تحقق طريقة إزالة الالتفاف متعددة المشاهدات دقة شبه متجانسة الخواص مع جانب 4.68 ميكرومتر ومحوري 5.06 ميكرومتر ، بعد 15 ساعة من الحساب (الشكل 8 أ). لتجنب التعقيد الحسابي ، قمنا أيضا بتخصيص ASLM المستند إلى ETL للصورة من قلوب الفئران حديثي الولادة إلى قلوب الفئران البالغة. تسمح لنا هذه الطريقة بمسح عضلة القلب باستخدام شعاع ليزر مركز بإحكام ، مما يقلل من الخلفية خارج التركيز البؤري ويعزز تباين الصورة مقارنة بطرق LSM التقليدية (الشكل 8B). مع تصميم ASLM الحالي ، يحقق متوسط الدقة الجانبية والمحورية للنظام 2.18 ميكرومتر و 2.88 ميكرومتر ، على التوالي ، مما يتيح استكشافا متعمقا لترابيق عضلة القلب في البطينين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام خياطة الصورة بشكل مستقل ، أو بالاشتراك مع إزالة الالتفاف متعدد الرؤية أو ASLM لتوسيع مجال الرؤية لأحجام عينات أكبر. يسمح لنا دمج الخياطة مع ASLM بتغطية قلب الفأر البالغ من العمر 8 أسابيع بالكامل بدقة موحدة (الشكل 8C) ، مما يوفر حلا فعالا للتحقيق في المقطع العرضي للقلب بأكمله.
الشكل 1: عملية تنظيف الأنسجة. (أ) تتضمن الطريقة الكارهة للماء جفاف الأنسجة، واستخلاص الليبيدات، ومطابقة معامل الانكسار باستخدام إيثر ثنائي بنزيل (DBE) باعتباره المذيب العضوي. ب: اغمر القلب في خليط من محلول فورمالديهايد (PFA) بنسبة 4٪ وجففه بتدرج من الميثانول ومخاليط الماء منزوع الأيونات (DI). تبييض القلب باستخدام 5٪ H2O2 في الميثانول عند 4 درجات مئوية. أزل دهون القلب باستخدام ثنائي كلورو الميثان (DCM) ومحلول الميثانول حتى تغوص العينة في قاع الأنبوب. أخيرا ، احتضان القلب في DBE من أجل الحصول على معامل الانكسار المطلوب. خطوط الشبكة 5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي للمجهر المسحوب محوريا للصفائح الضوئية. (أ) غرفة مطبوعة 3D مخصصة ، (ب) مغناطيس الغرفة ، (ج) حامل المشبك ، و (د) نظام ASLM. الاختصارات: CL: عدسة أسطوانية. ETL: عدسة إلكترونية قابلة للضبط ؛ IL: عدسة الإضاءة. DL: عدسة الكشف. FW: عجلة التصفية TL: عدسة أنبوب. تم تعديل هذا الرقم من المرجع16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خياطة الصورة وإزالة الالتفاف متعدد المشاهدات. (أ-ب) يتم استخدام خياطة الصور لتغطية قلوب الماوس بأكملها ، حيث يحتوي كل بلاطة على تداخل FOV بنسبة 10٪ مع البلاط المجاور لها. ج: نمط حركة قلب الفأر لخياطة الصورة. (د) يتم لصق حبات الفلورسنت في نهاية الأنبوب الزجاجي لتسهيل تسجيل الصور ، بينما يتم وضع القلب داخل الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على DBE ، مما يتيح التصوير المتزامن لكل من قلب الفأر والخرز الفلوري. (ه) يتضمن فك الالتفاف متعدد المشاهدات الحصول على صور من ستة منظورات متميزة ، كل منها يجمع صورا من اتجاهات فريدة. (F) البيانات الأولية لقلب الماوس P1 والخرز بزوايا مختلفة من 0 درجة و 60 درجة و 120 درجة و 180 درجة و 240 درجة و 300 درجة. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر. وقد عدل هذا الرقم من16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخطط كتلة نظام ASLM. استخدام بطاقة DAQ لمزامنة كاميرا ETL و sCMOS. تم فتح غلاف برنامج تشغيل ETL لحام الإشارة والأسلاك الأرضية إلى ثنائي الفينيل متعدد الكلور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: لوحة تحكم LabView. لوحة تحكم LabVIEW لتوليد مشغلات لمزامنة ETL ووحدات البكسل المنشطة لكاميرا sCMOS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مزامنة تركيز الورقة الضوئية مع وحدات البكسل المنشطة. (أ) يتم تحديد نقطتي البداية والنهاية لنطاق مسح ورقة الضوء عن طريق تكوين الجهد المناسب لمشغل ETL. (ب) النتيجة المتزامنة للخرزات الفلورية واضحة على طول قطر الصورة. (سي إف) تنشأ الدقة المكانية غير المنتظمة عبر مجال الرؤية بأكمله من التشغيل غير المتزامن ل ETL مع كاميرا sCMOS. يبدأ ETL المسح الضوئي (C) لاحقا أو (D) قبل البكسل المنشط. (إ-و) المنطقة البؤرية ليست موازية لقطر الصورة ، مما يشير إلى عدم التوافق بين سرعات المسح الضوئي والتنشيط. يقوم ETL بمسح (E) بشكل أسرع أو (F) أبطأ من اكتساح وحدات البكسل النشطة في sCMOS. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: استكشاف أخطاء ASLM وإصلاحها. (أ) توضع ورقة الضوء بالضبط على المسافة البؤرية لعدسة الكشف. يقوم ETL بمسح تركيز ورقة الضوء على طول اتجاه الانتشار أثناء المزامنة مع البكسل المنشط لمستشعر sCMOS. (B) عرض XY لحبيبات الفلورسنت عندما يتم محاذاة ETL ومزامنتها بشكل صحيح. (ج-د) نتائج حبات الفلورسنت على المستوى البؤري وخارج التركيز البؤري في الصور المقطعية ، مما يشير إلى عدم المحاذاة بين مسح ETL وانتشار الليزر. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر و 10 ميكرومتر في الجزء الداخلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تصوير ورقة ضوئية لقلوب الفئران. (أ) صورة مقدمة بحجم الصوت لقلب الفأر P1 متعدد الرؤية تسلط الضوء على التربيق داخل تجويف البطين. (ب) صور مقطعية لقلب الفأر البالغ من العمر 8 أسابيع الناتج عن LSM التقليدي (يسار) و ASLM (يمين). يتم تقديم الصور كبيانات أولية. (ج) مزيج من خياطة الصور و ASLM لتصوير قلب فأر عمره 8 أسابيع ، يتكون من 12 بلاطة مرتبة في 3 بلاطة أفقيا و 4 بلاطة رأسيا. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. الاختصارات: LV: البطين الأيسر ، LA: الأذين الأيسر ، RV: البطين الأيمن ، و RA: الأذين الأيمن. تم تعديل هذا الرقم من المرجع16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| إجراء | الوقت (قلب الفأر P1) | الوقت (قلب فأر عمره 8 أسابيع) | درجة الحرارة | |||
| إصلاح في 4٪ PFA | ضحاها | ضحاها | 4 درجة مئوية | إعداد العينة | ||
| يغسل مع 1x PBS | 30 دقيقة | 30 دقيقة | آر تي | |||
| يغسل مع 1x PBS | 30 دقيقة | 30 دقيقة | آر تي | |||
| يغسل مع 1x PBS | 30 دقيقة | 30 دقيقة | آر تي | |||
| تضمين مع هلام الاغاروز | 1 ساعة | 2 ساعة | آر تي | |||
| احتضان في 20٪ ميثانول / 80٪ ماء DI | 1 ساعة | 2 ساعة | آر تي | تجفاف | ||
| احتضان في 40٪ ميثانول / 60٪ ماء DI | 1 ساعة | 2 ساعة | آر تي | |||
| احتضان في 60٪ ميثانول / 40٪ ماء DI | 1 ساعة | 2 ساعة | آر تي | |||
| احتضان في 80٪ ميثانول / 20٪ ماء DI | 1 ساعة | 2 ساعة | آر تي | |||
| احتضان في 100 ٪ الميثانول | 1 ساعة | 2 ساعة | آر تي | |||
| احتضان في الميثانول الطازج 100 ٪ | 1 ساعة | 2 ساعة | آر تي | |||
| احتضان في الميثانول الطازج 100 ٪ | 10 دقائق | 10 دقائق | 4 درجة مئوية | تصبغ | ||
| مبيض مع 5٪ H2O2 / ميثانول | ضحاها | ضحاها | 4 درجة مئوية | |||
| احتضان في 100 ٪ الميثانول | 1 ساعة | 1 ساعة | آر تي | |||
| إزالة الدهون مع 66٪ DCM / 33٪ ميثانول على شاكر | 3 ساعات | 3 ساعات | آر تي | إزالة الدهون | ||
| احتضان في DBE على شاكر | 2 أيام | 5 أيام | آر تي | مطابقة المثيل المحجوز | ||
الجدول 1: خطوات تنظيف الأنسجة المخصصة للتصوير الذاتي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد وفر تقدم طرق التصوير والحساب وتنظيف الأنسجة فرصة لا مثيل لها للتحقيق على نطاق واسع في بنية القلب ووظيفته. هذا يحمل إمكانات كبيرة لتعميق فهمنا لتشكل القلب والتسبب في المرض باستخدام نموذج قلب القوارض السليم. على عكس الدراسات في الجسم الحي لقلب الزرد باستخدام نهج مماثل40،41،42،43 ، فإن دمج تقنيات LSM المتقدمة وطرق إزالة الأنسجة يمكننا من التغلب على التحديات بين الدقة المكانية وعمق الاختراق عند تصوير نموذج القوارض 9,44. تجعل تقنيات تنظيف الأنسجة القلوب شفافة بصريا عن طريق إزالة الدهون وعناصر تشتت الضوء الأخرى ، مما يتيح اختراق أعمق للتصوير45. عندما يقترن LSM ، يمكننا تصوير عضلة القلب. يعزز هذا المزيج عمق التصوير ويسمح بمراقبة البنية الدقيقة المعقدة لعضلة القلب. في حين تم إنشاء العديد من طرق المقاصة18 ، قمنا بتكييف iDISCO20 لجعل القلب السليم شفافا بسرعة مقارنة بطرق تنظيف الأنسجةالأخرى 15 ، مما يجعله متاحا بسهولة لتصوير التألق الذاتي من عضلة القلب. لوضع علامات مضان محددة ، يمكن دمج بروتوكولات iDISCO و Adipo-Clear46 الأصلية مع التلوين المناعي في نظام التصوير المخصص هذا ، على الرغم من الحضانة الأطول. وفي الوقت نفسه ، تفضل الطرق التي تحافظ على التألق الداخلي وتتطلب وقتا أقصر للمعالجة للدراسة المقترحة. على عكس الطرق الأخرى ، تقدم هذه المنصة المزايا التالية. أولا ، نحن نستخدم بروتوكول iDISCO المعدل لإزالة الأنسجة ، مما يتيح التقديم السريع للقلب شفافا في أقل من 1 أسبوع مع الاحتفاظ بالتألق الذاتي لعضلة القلب. ثانيا ، نقوم بدمج الأساليب الحسابية مثل خياطة الصور وإزالة الالتفاف متعدد المشاهدات في نظام ورقة الضوء الراسخ هذا لتصوير القلب. أخيرا ، نقوم بتصميم ومزامنة نظام ASLM لتعزيز الدقة المحورية عبر مجال رؤية كبير ، مما يتيح التصوير متعدد المقاييس وتحليل ضغط عضلة القلب والترابئيق بدقة قريبة من الخواص.
لالتقاط صور قلبية لنموذج القوارض ، قدمنا أربعة طرق تعتمد على LSM: i) الطريقة التقليدية لأغراض الفحص19 ، ii) خياطة الصور ، iii) إزالة الالتفاف متعدد المشاهدات ، و iv) مسح ASLM. بالنظر إلى التباين في حجم القلب عبر النماذج المختلفة ، سعينا إلى معالجة المفاضلة الأساسية في الدقة المكانية وسرعة الاستحواذ و FOV. بينما تتيح خياطة الصور مجال الرؤية الكبير بدقة مكانية معرضة للخطر ، فإن دمجها مع إزالة الالتفاف متعدد الرؤية أو ASLM يوفر دقة شبه متجانسة الخواص عبر مجال الرؤية الممتد لتغطية قلب الفأر البالغ بأكمله. علاوة على ذلك ، فإن دمج هذه الأساليب يعزز جودة الصورة والتباين في الأنسجة العميقة ، مما يسمح بإعادة بناء رقمية شاملة لنماذج 3D للهياكل الدقيقة مثل تربيق عضلة القلب والضغط داخل البطينين. ومع ذلك ، فإن طوفان مجموعات البيانات ، وتكلفة المعالجة الحسابية الواسعة ، والحاجة إلى تسجيل دقيق للصور ، وإمكانية القطع الأثرية في إزالة الالتفاف متعدد المشاهدات وخياطة التصوير تعيق تطبيقاتها الواسعة. في حين أن ASLM هو بديل ناشئ ، فإن تعقيد مزامنة النظام واستراتيجيات المسح بالليزر والاعتماد على شفافية الأنسجة تشكل تحديات قد تؤثر على متانة النظام وتزيد من خطر تلف الصورة للقلب.
بشكل جماعي ، توفر هذه المنهجية بما في ذلك تصوير LSM وتنظيف الأنسجة نقطة انطلاق لاستكشاف بنية القلب من حديثي الولادة إلى البالغين. لديه القدرة على توطين توزيع سلالات القلب المتخصصة ووظائفها أثناء تطور القلب47. مع تطوير التحليل الحسابي المصمم خصيصا لتطبيقات القلب6،48،49،50،51،52،53 ، يمكن توسيع هذا الإطار للتحقيق في عمليات إعادة تشكيل القلب ، لا سيما استجابة لاحتشاء عضلة القلب. في نهاية المطاف ، تحمل هذه الاستراتيجية الشاملة القدرة على كشف الآلية الأساسية لتشكل القلب ودفع تطوير التدخلات العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نعرب عن امتناننا لمجموعة الدكتور إريك أولسون في مركز UT Southwestern الطبي لمشاركتها بسخاء النماذج الحيوانية. نحن نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 - 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
References
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al.
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T.
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al.
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al.
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
