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Bioengineering

L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs

Published: March 29, 2024 doi: 10.3791/66707
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

Summary

Le protocole utilise la microscopie à feuillet de lumière avancée ainsi que des méthodes de nettoyage tissulaire adaptées pour étudier les structures cardiaques complexes dans les cœurs de rongeurs, ce qui présente un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.

Abstract

La microscopie à feuillet de lumière (LSM) joue un rôle central dans la compréhension de la structure tridimensionnelle complexe (3D) du cœur, fournissant des informations cruciales sur la physiologie cardiaque fondamentale et les réponses pathologiques. Nous nous penchons ici sur le développement et la mise en œuvre de la technique LSM pour élucider la micro-architecture du cœur dans des modèles murins. La méthodologie intègre un système LSM personnalisé avec des techniques de nettoyage des tissus, atténuant la diffusion de la lumière dans les tissus cardiaques pour l’imagerie volumétrique. La combinaison d’un LSM conventionnel avec des approches d’assemblage d’images et de déconvolution multivues permet de capturer l’ensemble du cœur. Pour résoudre le compromis inhérent entre la résolution axiale et le champ de vision (FOV), nous introduisons une méthode de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) pour minimiser la lumière floue et éclairer uniformément le cœur dans le sens de la propagation. Entre-temps, les méthodes de nettoyage des tissus telles que iDISCO améliorent la pénétration de la lumière, facilitant la visualisation des structures profondes et assurant un examen complet du myocarde dans l’ensemble du cœur. La combinaison du LSM proposé et des méthodes de nettoyage des tissus présente une plate-forme prometteuse pour les chercheurs dans la résolution des structures cardiaques dans les cœurs de rongeurs, avec un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.

Introduction

L’insuffisance cardiaque reste la principale cause de mortalité dans le monde, principalement en raison du manque de capacité de régénération des cardiomyocytes matures1. L’architecture complexe du cœur joue un rôle crucial dans sa fonction et donne un aperçu des processus de développement. Une compréhension approfondie de la structure cardiaque est essentielle pour élucider les processus fondamentaux de la morphogenèse et du remodelage cardiaques en réponse à l’infarctus du myocarde. Des progrès récents ont démontré que les souris néonatales peuvent restaurer la fonction cardiaque après une blessure, alors que les souris adultes n’ont pas une telle capacité de régénération2. Cela établit une base pour l’étude des indices associés aux anomalies structurelles et fonctionnelles dans les modèles murins. Les méthodes d’imagerie traditionnelles, telles que la microscopie confocale, présentent des limites techniques, notamment une profondeur de pénétration limitée, un schéma de balayage ponctuel lent et des dommages photographiques dus à une exposition prolongée à la lumière laser. Ceux-ci entravent l’imagerie tridimensionnelle (3D) complète du cœur intact. Dans ce contexte, la microscopie à feuillet de lumière (LSM) apparaît comme une solution puissante, offrant les avantages d’une imagerie à grande vitesse, d’une réduction des dommages photographiques et de capacités exceptionnelles de sectionnement optique 3,4,5. Les caractéristiques uniques de la LSM en font une méthode prometteuse pour surmonter les limites des techniques conventionnelles, fournissant des informations sans précédent sur les processus de développement et de remodelage cardiaques 6,7,8.

Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie d’imagerie qui combine une LSM avancée avec des approches de clarification tissulaire adaptées9, permettant l’imagerie de cœurs de souris entiers sans avoir besoin d’un marquage spécifique et d’une section mécanique. Nous proposons en outre que l’imagerie LSM conventionnelle puisse être améliorée par des techniques de déconvolutionmultivue 10 ou de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) 11,12,13,14,15 pour améliorer la résolution axiale. De plus, l’intégration de l’assemblage d’images avec l’une ou l’autre de ces méthodes peut surmonter efficacement le compromis entre la résolution spatiale et le champ de vision (FOV), faisant ainsi progresser l’imagerie des cœurs de souris adultes. L’incorporation de nombreuses approches de nettoyage des tissus, y compris les méthodes hydrophobes, hydrophiles et à base d’hydrogel, permet une pénétration plus profonde de la lumière pour capturer la morphologie de l’ensemble du cœur 16,17,18,19.

Bien que plusieurs méthodes de clarification soient compatibles avec les systèmes LSM actuels, l’objectif est de minimiser la diffusion des photons et d’améliorer la pénétration de la lumière dans les tissus, comme le cœur, en remplaçant les lipides par un milieu qui correspond étroitement à son indice de réfraction. iDISCO a été choisi comme représentant20,21 et adapté à l’imagerie par autofluorescence dans ce protocole en raison de son traitement rapide et de sa grande transparence (Figure 1A). Collectivement, l’intégration de l’approche LSM avancée avec des techniques de nettoyage des tissus offre un cadre prometteur pour démêler l’anatomie cardiaque complexe dans les cœurs de rongeurs, avec un potentiel important pour faire progresser notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques.

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Protocol

Les protocoles et les expériences sur les animaux ont été approuvés et menés sous la supervision du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Texas à Dallas (IACUC #21-03). Des souris C57BL6, y compris des nouveau-nés au jour 1 postnatal (P1) et des adultes de 8 semaines, ont été utilisées dans cette étude. Aucune différence n’a été observée entre les mâles et les femelles. L’ensemble de l’acquisition des données et du post-traitement des images a été réalisé à l’aide de logiciels open source ou de plateformes disposant de licences de recherche ou d’enseignement. Les ressources sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.

1. Préparation de l’échantillon et nettoyage des tissus (6 à 10 jours)

  1. Préparez toutes les solutions chimiques de la table des matériaux requises pour la méthode d’élimination des tissus avant d’amorcer la procédure d’élimination des tissus.
    REMARQUE : Effectuez toutes les procédures dans une hotte tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, en particulier lors de la manipulation de produits chimiques toxiques.
  2. Euthanasier les animaux contenant du CO2 en les plaçant dans une chambre de CO2 aux points temporels souhaités, tels que P1 et 8 semaines, pour le prélèvement du cœur entier et immerger le cœur fraîchement isolé à température ambiante (RT) dans 0,2 M KCl pour l’arrêter en diastole16.
  3. Fixez le cœur en l’immergeant dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans une solution saline tamponnée 1x phosphate (PBS) avec une légère agitation sur un rocker pendant la nuit pour préserver l’anatomie cardiaque à 4 °C, voir tableau 1.
    ATTENTION : Le PFA est un produit chimique toxique et doit être effectué sous une hotte.
  4. Lavez le cœur avec 1x PBS à RT pendant 30 min, 3x.
    REMARQUE : Facultatif : Intégrez le cœur dans du gel d’agarose pour créer un assemblage de cœur pour le système LSM personnalisé à l’étape 2, comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez la solution d’agarose à 1 % en dissolvant l’agarose dans du PBS et chauffez le mélange au micro-ondes jusqu’à dissolution complète. Versez la solution dans un moule pour créer une couche inférieure jusqu’à ce que la solution refroidisse à 40 °C.
    2. Placez le cœur dans le moule et remplissez le moule de gel d’agarose jusqu’à ce qu’il se solidifie. Éliminez toutes les bulles dans le gel d’agarose pour minimiser les artefacts dans l’imagerie.
      REMARQUE : L’intégration de l’échantillon réduit le risque de dommages potentiels à l’anatomie cardiaque lors du montage.
      ATTENTION : Utilisez de l’agarose à bas point de fusion et évitez de placer le cœur directement dans de l’agarose chauffée pour atténuer le risque d’exposer l’échantillon à des températures élevées.
  5. Déshydrater le cœur à l’aide de gradients de méthanol mélangé à de l’eau désionisée (figure 1B), en utilisant des concentrations séquentielles de 20 %, 40 %, 60 %, 80 % et 100 %, comme indiqué dans le tableau 1. Répétez l’opération avec du méthanol frais à 100 % 1x pour assurer une déshydratation complète. Déshydrater les cœurs de souris néonatales pendant 1 h dans chaque mélange de méthanol en secouant. Ajustez le temps d’incubation à 2 h pour les cœurs de souris et de rats de 8 semaines.
    ATTENTION : Le méthanol est un produit chimique volatil, irritant et inflammable.
  6. Remplacez et refroidissez le cœur avec du méthanol frais à 100 % pendant 10 min à 4 °C.
  7. Remplacer la solution et blanchir le cœur avec du peroxyde d’hydrogène à 5 % (H2O2) dans du méthanol en utilisant un rapport volumique de 1:5 (30 % H2O2 à 100 % méthanol) pendant une nuit à 4 °C pour éliminer les pigments.
    REMARQUE : L’élimination des pigments permet de minimiser l’absorption des photons, ce qui améliore la qualité de l’image avec une réduction des artefacts.
  8. Remplacer la solution et incuber le cœur dans du méthanol à 100% pendant 1 h à RT.
  9. Délipider le cœur avec la solution contenant 66 % de dichlorométhane (DCM) et 33 % de méthanol pendant 3 h en agitant. Assurez-vous que le cœur coule au fond de la fiole à la fin de cette étape. Sinon, renouveler la solution (66 % DCM / 33 % méthanol) et prolonger le temps d’incubation (par exemple, 1 heure de plus) pour obtenir une délipidation complète. Transférez rapidement le cœur dans une solution fraîche pour éviter la dessiccation, car le DCM est très volatil.
    ATTENTION : Utilisez du polypropylène ou de la verrerie pour l’expérience, car le DCM n’est pas compatible avec le polystyrène.
  10. Utilisez de l’éther dibenzylique (DBE) pour l’adaptation de l’indice de réfraction (RI = 1,56). Pour les cœurs de souris néonatales, le processus d’appariement de l’indice de réfraction prend 2 jours, tandis que pour les cœurs de souris de 8 semaines, il prend 5 jours avec de légères secousses. Remplacez-le par du DBE frais et prolongez le temps d’incubation jusqu’à ce que le cœur atteigne une transparence complète.
    ATTENTION : Le DBE est dangereux. Évitez tout contact avec la peau.

2. Montage de l’échantillon (1 jour)

REMARQUE : Dans le cas où un système LSM commercial est utilisé, suivez son protocole spécifique fourni par la société pour réparer le cœur et sautez les étapes 2.1 à 2.9.

  1. Personnaliser une chambre et un support résistants à la solution d’adaptation de l’indice de réfraction (par exemple, DBE dans l’approche iDISCO adaptée) à l’aide d’une imprimante 3D et de matériaux Onyx (Figure 2A)16.
  2. Fixez un aimant au fond de la chambre pour faciliter une connexion rapide et une localisation précise sous le système LSM (Figure 2B).
  3. Fixez des verres de protection de 25 mm x 50 mm x 0,17 mm à la chambre à l’aide d’une colle silicone transparente et vérifiez l’intégrité de l’étanchéité de la chambre en la remplissant de DBE et en vérifiant les fuites après 1 jour.
  4. Personnalisez un support de pince à l’aide d’une imprimante 3D et fixez un aimant pour monter l’ensemble cœur à l’intérieur de la chambre (Figure 2C) ou insérez une aiguille dans le gel d’agarose pour monter l’ensemble cœur.
  5. Réaliser le développement d’un système LSM interne à l’aide d’une lentille cylindrique et de lasers à semi-conducteurs à diode à ondes continues (DPSS), comme indiqué précédemment16,22. Utilisez la longueur d’onde d’excitation de 532 nm pour capturer l’autofluorescence du myocarde (Figure 2D).
  6. Montez la chambre sur une platine à 6 dimensions et localisez la position optimale où la chambre est perpendiculaire à la direction de propagation du laser.
  7. À l’aide d’un support de pince magnétique, positionnez l’échantillon au milieu de la chambre et connectez le support à une platine motorisée en 4 dimensions (X, Y, Z et lacet ; Figure 2D).
  8. Immergez l’ensemble cardiaque dans la chambre remplie de DBE à l’aide de la platine motorisée et déterminez la portée de balayage le long de l’axe de détection (direction Z).
  9. Déterminez la vitesse de balayage (Vz) du moteur le long de la direction Z en fonction de la taille du pas (S) et du temps d’acquisition d’une image (T) à l’aide de l’équation suivante :
    Equation 1
    REMARQUE : La relation entre la taille du pas et la résolution axiale du système d’imagerie est conforme au théorème d’échantillonnage de Nyquist-Shannon. Par exemple, la taille du pas a été fixée à 1 μm, étant donné que la résolution axiale était de 2,91 μm, comme indiqué dans le rapport précédent16.
  10. Pour vérifier la résolution spatiale et minimiser les problèmes d’opacité potentiels à différentes profondeurs, mesurez la fonction d’étalement ponctuel (PSF) du système en imageant des billes fluorescentes d’un diamètre de 0,53 μm diluées dans un gel d’agarose à faible point de fusion à 1 % avec une concentration de 1:1,5 x 105. Calculez la PSF sur l’ensemble de l’échantillon en mesurant la largeur totale à mi-hauteur (FWHM)16.

3. Assemblage d’images (4-8 h)

  1. Calculez le nombre de tuiles nécessaires pour couvrir l’ensemble du cœur de la souris, en tenant compte du champ de vision limité. Pour chaque tuile, les dimensions correspondent au FOV du système LSM. Par exemple, un cœur de souris nouveau-né d’une section transversale de 3 x 3,6 mm2 nécessite 2 x 2 tuiles pour être couvert dans le LSM personnalisé (figure 3A). En revanche, un cœur de souris de 8 semaines mesurant 5 x 8 mm2 nécessite 3 x 4 tuiles pour couvrir toute la structure cardiaque (figure 3B).
    REMARQUE : L’assemblage d’images est nécessaire si le LSM conventionnel a un FOV limité pour l’imagerie de l’ensemble du cœur.
  2. Capturez des images du cœur à partir de la tuile 1, c’est-à-dire la tuile du coin supérieur gauche du cœur (Figure 3A-B).
  3. Capturez séquentiellement des images des tuiles restantes avec un chevauchement de 10 % entre les tuiles consécutives jusqu’à ce que tout le cœur soit couvert, comme illustré à la figure 3C.
  4. Téléchargez et installez le logiciel open-source Fiji23 . Téléchargez et installez le plugin Fiji, BigStitcher24.
  5. Accédez au menu Aide, sélectionnez Mettre à jour, Gérer le site de mise à jour, puis choisissez BigStitcher. Ensuite, cliquez sur Fermer, puis sur Appliquer les modifications. Une fois le téléchargement du plugin terminé, redémarrez le logiciel Fidji.
  6. Ouvrez le plug-in BigStitcher et importez toutes les tuiles nécessaires dans le répertoire du fichier image. Enregistrez le jeu de données en tant que fichier HDF5.
  7. Organisez les tuiles en choisissant Déplacer la tuile selon la grille régulière, sélectionnez le motif utilisé pour déplacer le cœur et sélectionnez un chevauchement de 10 % entre chaque tuile. Brodez les carreaux à l’aide de l’option Assistant d’assemblage.
  8. Exportez les données assemblées à l’aide d’Image Fusion pour générer un fichier tiff.

4. Déconvolution multivue (5 jours)

  1. Utilisez des billes fluorescentes pour l’enregistrement d’images de reconstruction multivues le long du cœur (Figure 3D).
    1. Préparez la résine25 en mélangeant de l’éther diglycidylique de bisphénol-A (D.E.R. 332), de l’isophorone diamine, de la 5-amino-1,3,3-triméthylcyclohexaneméthylamine (IPDA) et de l’éther diglycidylique de polypropylène glycol (D.E.R 736) à un rapport de volume de 4:1:1.
    2. Centrifuger 10 μL de billes de fluorescence à 161 x g pendant 5 min et ajouter 20 μL de méthanol pour remplacer la solution de stockage des billes. Répétez l’opération 3 fois.
    3. Préparez une solution de 10 mL avec une concentration de billes de 1:1 x 105 en mélangeant la solution de billes à base de méthanol dans la résine préparée à l’étape 4.1.1.
    4. Dégazez la solution dans une chambre à vide pendant 3 h pour éliminer les poches d’air et les bulles.
    5. Versez la solution dans un moule en silicone ou une paille en plastique et attendez 2 à 3 jours jusqu’à ce qu’elle se solidifie. Après 1 jour avant que la résine ne devienne solide, placez le tube de verre à l’intérieur du moule et attendez que le tube se fixe à la résine. Retirez la résine du moule à l’aide du tube en verre (Figure 3D).
    6. Placez le cœur dans le tube de verre, remplissez-le de DBE et montez le tube de verre dans la chambre remplie de DBE.
  2. Capturez des images séquentielles du cœur de la souris avec les perles de la section éclairée en balayant l’ensemble du cœur sur l’axe de détection (axe Z ; Figures 3E-F).
    REMARQUE : Implémentez l’assemblage d’images à l’étape 3 pour générer des piles individuelles d’images si la taille du cœur dépasse le FOV.
  3. Faites pivoter le cœur de la souris de 60° le long de l’axe Y pour capturer les piles suivantes sous plusieurs angles, c’est-à-dire 0°, 60°, 120°, 180°, 240° et 300° (Figure 3E-F).
  4. Ouvrez le plug-in BigStitcher et importez toutes les images via le répertoire du fichier image. Enregistrez le jeu de données en tant que fichier HDF5.
  5. Choisissez Détecter les points d’intérêt et sélectionnez manuellement les perles d’intérêt pour l’enregistrement.
  6. Sélectionnez Modèle de transformation affine pour l’enregistrement. Choisissez Fonction d’étalement de points et attribuez PSF à toutes les vues.
  7. Cliquez sur Multiview Deconvolution et choisissez le type d’itération Efficient Bayesian. Définissez le nombre d’itérations sur 10 et exécutez-lesur 26.
  8. Cliquez sur Image Fusion pour exporter un fichier tiff .
    REMARQUE : Des informations plus détaillées sur la déconvolution multivue peuvent être trouvées dans d’autres rapports ou protocoles 24,27,28.

5. Quincaillerie du système de feuille d’éclairage à balayage axial (1 jour)

  1. Installez une lentille électrique accordable (ETL) sur le plan de Fourier de la lentille cylindrique (CL)27 (Figure 2D) pour balayer le faisceau laser axialement14. Assurez-vous que l’interface liquide dans l’ETL est horizontale pour éviter la distorsion du front d’onde causée par la gravité. Alignez l’ETL avec précision pour minimiser le décentrement du faisceau et les aberrations optiques d’ordre supérieur30.
  2. Installez une carte DAQ sur le poste de travail et connectez un câble BNC à la carte DAQ pour synchroniser l’exposition de la caméra et le balayage ETL.
  3. Ouvrez le boîtier du pilote ETL et retirez le capot (Figure 4).
  4. Soudez le fil de signal du câble BNC à la broche Analog in B, comme indiqué au bas de la carte PCB (Figure 4).
  5. Soudez le fil de terre du câble BNC à la broche GND ; connectez ensuite l’autre extrémité du câble BNC à l’AO (sortie analogique) de la carte DAQ (Figure 4).
  6. Branchez le pilote ETL sur le port USB de la station de travail, connectez-le à l’ETL à l’aide d’un câble Hirose et installez le logiciel Lens Driver Controller.
  7. Changez le mode de fonctionnement dans le logiciel Lens Driver Controller Software sur Analog pour contrôler l’ETL avec un déclencheur généré à partir de la carte DAQ.
  8. Dans le logiciel de la caméra sCMOS, basculez le mode de capture sur Externe (feuille de lumière). Assurez-vous que la direction de balayage des pixels actifs est perpendiculaire à la direction de balayage laser pour faciliter la synchronisation.
  9. Connectez le port de déclenchement externe situé à l’arrière de la caméra sCMOS à l’AO de la carte DAQ à l’aide d’un câble BNC (Figure 4).

6. Synchronisation du système de feuille lumineuse à balayage axial (7 jours)

  1. Définir le temps d’exposition en fonction du rapport signal/bruit de fond (SBR) acceptable qui, pour l’étude proposée, est d’au moins 10. Augmentez le temps d’exposition si le SBR est inférieur à 10.
    REMARQUE : Le temps d’exposition allant de 10 à 50 ms fournit un SBR acceptable dans ce projet.
  2. Définissez le temps d’acquisition d’une image (T) et l’intervalle de ligne (L) en fonction du temps d’exposition (E) de l’appareil photo et de la fréquence ETL (f) à l’aide des équations suivantes :
    Equation 2
    Equation 3
    Où P indique le nombre de colonnes de pixels sur le capteur de l’appareil photo. Les paramètres représentatifs de la référence sont respectivement f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms et L = 243 μs.
  3. Dans le programme LabVIEW, Trigger Generator.vi génère des déclencheurs carrés et triangulaires pour la synchronisation (Figure 5).
    REMARQUE : Le programme LabVIEW personnalisé est disponible auprès des auteurs sur demande raisonnable.
  4. Montez des billes fluorescentes diluées dans du geld’agarose 16 à 1 % à faible point de fusion avec une concentration de 1:1 x 103 pour localiser la position de la taille du faisceau dans l’image (figure 6A).
  5. Dans le programme, identifiez les points de départ et d’arrivée du faisceau laser sous le FOV en modifiant la tension le long de la direction de balayage.
  6. Pour synchroniser la caméra sCMOS et l’ETL, balayez le faisceau laser le long de l’axe X et les pixels actifs le long de l’axe Y pour générer une image 2D (Figure 6B). Les perles plus lumineuses et plus nettes le long de la diagonale de l’image indiquent la synchronisation précise entre le sCMOS et l’ETL.
    REMARQUE : La synchronisation de la vitesse de balayage de l’activation des pixels ETL et sCMOS est essentielle pour la qualité de l’image. Diverses erreurs asynchrones courantes sont résumées à la figure 6C-F.
  7. Après avoir déterminé les paramètres de synchronisation optimaux pour la synchronisation, faites pivoter la caméra sCMOS de 90° autour de l’axe Z pour aligner la direction du pixel actif avec la direction du balayage laser.
  8. Répéter l’étape 2.10 et mesurer la FWHM de la PSF. Utiliser la même méthode que celle indiquée dans le rapport précédent16, avec les résolutions latérales et axiales moyennes de l’ASLM à 2,18 μm et 2,88 μm, respectivement (figure 7).
    REMARQUE : Un éclairage et une résolution uniformes sur l’ensemble du champ de vision sont possibles dans des conditions idéales (Figure 7A-B). Le fonctionnement asynchrone de l’ETL avec la caméra sCMOS, ainsi qu’un désalignement de l’éclairage et de la détection, peuvent entraîner une résolution spatiale non uniforme (Figure 7C-D).
  9. Pour l’imagerie cardiaque, après avoir aligné le système et déterminé les paramètres optimaux pour la synchronisation du système, passez aux étapes 2.6 à 2.9.

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Representative Results

Il a été démontré que la LSM favorise les études cardiaques 31,32,33,34,35,36,37 en raison du risque minimal de photodommages, de la haute résolution spatiale et du sectionnement optique par rapport à d’autres méthodes d’imagerie optique telles que les techniques de balayage en fond clair et en point 6,8,38,39,40 . Ainsi, pour mieux comprendre l’architecture myocardique 3D, nous avons établi le protocole basé sur des approches primaires comprenant le dégagement iDISCO adapté, l’assemblage d’images, la déconvolution multivue et l’ASLM. Bien que nous ayons présenté les résultats à l’aide de modèles murins, il est important de noter que les rats et autres modèles de rongeurs conviennent également aux méthodes proposées. Le protocole de clarification tissulaire adapté permet de rendre transparent le cœur de souris P1 en 4 jours et le cœur de souris de 8 semaines transparent en 7 jours (Figure 1B). Cette étape sert de point de départ pour minimiser l’absorption et la diffusion des photons dans le cœur intact. La déconvolution multivue permet d’améliorer la résolution axiale en fusionnant des images de plusieurs perspectives en un seul modèle. Après avoir enregistré séquentiellement des images à partir de 6 vues du même cœur, la méthode de déconvolution multivues atteint une résolution quasi isotrope avec une diagonale de 4,68 μm et une axiale de 5,06 μm, après 15 h de calcul (Figure 8A). Pour éviter la complexité informatique, nous avons personnalisé un ASLM basé sur ETL pour imager des cœurs de souris néonatales à adultes. Cette méthode nous permet de balayer le myocarde avec un faisceau laser étroitement focalisé, minimisant ainsi le flou de fond et améliorant le contraste de l’image par rapport aux méthodes LSM conventionnelles (Figure 8B). Avec la conception actuelle de l’ASLM, les résolutions latérales et axiales moyennes du système atteignent respectivement 2,18 μm et 2,88 μm, ce qui permet une exploration approfondie de la trabéculation myocardique dans les ventricules. De plus, l’assemblage d’images peut être utilisé indépendamment ou en combinaison avec la déconvolution multivue ou l’ASLM pour étendre le champ de vision pour des échantillons de plus grande taille. L’intégration de l’assemblance avec l’ASLM nous permet de couvrir l’ensemble du cœur de souris âgée de 8 semaines avec une résolution uniforme (Figure 8C), offrant une solution efficace pour étudier la section transversale de l’ensemble du cœur.

Figure 1
Figure 1 : Processus d’élimination des tissus. (A) La méthode hydrophobe implique la déshydratation des tissus, l’extraction des lipides et l’adaptation de l’indice de réfraction en utilisant de l’éther dibenzylique (DBE) comme solvant organique. (B) Immerger le cœur dans un mélange de solution de formaldéhyde à 4 % (PFA) et le déshydrater avec un gradient de mélanges de méthanol et d’eau déminéralisée (DI). Blanchir le cœur avec 5% de H2O2 dans du méthanol à 4 °C. Délipidez le cœur avec une solution de dichlorométhane (DCM) et de méthanol jusqu’à ce que l’échantillon coule au fond du tube. Enfin, incubez le cœur dans DBE afin d’obtenir l’indice de réfraction souhaité. Lignes de quadrillage 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de la microscopie à feuillet de lumière à balayage axial. (A) Chambre imprimée en 3D personnalisée, (B) aimant de chambre, (C) support de pince et (D) système ASLM. Abréviations : CL : lentille cylindrique ; ETL : lentille électronique accordable ; IL : lentille d’éclairage ; DL : lentille de détection ; FW : roue à filtres ; TL : lentille tubulaire. Cette figure a été modifiée de la Réf16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Assemblage d’images et déconvolution multivue. (A-B) L’assemblage d’images est utilisé pour couvrir l’intégralité du cœur de la souris, chaque tuile ayant un chevauchement de 10 % du champ de vision avec les tuiles adjacentes. (C) Modèle de mouvement du cœur de la souris pour l’assemblage d’images. (D) Des billes fluorescentes sont fixées à l’extrémité du tube de verre pour faciliter l’enregistrement de l’image, tandis que le cœur est positionné à l’intérieur du tube de verre contenant le DBE, permettant l’imagerie simultanée du cœur de la souris et des billes fluorescentes. (E) La déconvolution multivue implique l’acquisition d’images à partir de six perspectives distinctes, chacune rassemblant des images provenant de directions uniques. (F) Données brutes du cœur et des perles de la souris P1 à différents angles de 0°, 60°, 120°, 180°, 240° et 300°. Barres d’échelle : 500 μm. Ce chiffre a été modifié au lieu de16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Schéma fonctionnel du système ASLM. Utilisation de la carte DAQ pour la synchronisation des caméras ETL et sCMOS. Le boîtier du pilote ETL a été ouvert pour le soudage des fils de signal et de terre sur le circuit imprimé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Panneau de configuration LabView. Panneau de configuration LabVIEW pour générer des déclencheurs afin de synchroniser l’ETL et les pixels activés de la caméra sCMOS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Synchronisation de la mise au point de la feuille de lumière avec les pixels activés. (A) L’identification des points de départ et d’arrivée de la plage de balayage de la feuille de lumière est réalisée en configurant la tension appropriée pour le déclencheur ETL. (B) Le résultat synchrone des billes fluorescentes est évident le long de la diagonale de l’image. (C-F) La résolution spatiale non uniforme sur l’ensemble du FOV provient du fonctionnement asynchrone de l’ETL avec la caméra sCMOS. L’ETL lance le balayage (C) plus tard ou (D) plus tôt que le pixel activé. (E-F) La zone focale n’est pas parallèle à la diagonale de l’image, ce qui indique une incompatibilité entre les vitesses de balayage et d’activation. L’ETL scanne (E) plus rapidement ou (F) plus lentement que le balayage des pixels actifs dans le sCMOS. Barre d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Dépannage de l’ASLM. (A) La feuille de lumière est placée exactement à la distance focale de la lentille de détection. L’ETL balaie le foyer de la feuille de lumière le long de la direction de propagation tout en se synchronisant avec le pixel activé du capteur sCMOS. (B) Vue XY des billes fluorescentes lorsque l’ETL est correctement aligné et synchronisé. (C-D) Résultats de billes fluorescentes sur le plan focal et floues dans les images en coupe, indiquant le désalignement entre le balayage ETL et la propagation laser. Barres d’échelle : 200 μm et 10 μm dans l’encart. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Imagerie par feuillet lumineux de cœurs de souris. (A) Image volumique du cœur de souris P1 à déconvolution multivue mettant en évidence la trabéculation dans la cavité ventriculaire. (B) Images en coupe transversale du cœur d’une souris âgée de 8 semaines générées par LSM conventionnelle (à gauche) et ASLM (à droite). Les images sont présentées sous forme de données brutes. (C) Combinaison de l’assemblage d’images et de l’ASLM pour l’imagerie d’un cœur de souris âgé de 8 semaines, comprenant 12 tuiles disposées en 3 tuiles horizontalement et 4 tuiles verticalement. Barre d’échelle : 500 μm. Abréviations : VG : ventricule gauche, LA : oreillette gauche, RV : ventricule droit et PR : oreillette droite. Cette figure a été modifiée de la Réf16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Procédure Temps (cœur de souris P1) Time (cœur de souris de 8 semaines) Température
Fixe en 4% de PFA Nuit Nuit 4°C Préparation des échantillons
Laver avec 1x PBS Durée : 30 minutes Durée : 30 minutes RT
Laver avec 1x PBS Durée : 30 minutes Durée : 30 minutes RT
Laver avec 1x PBS Durée : 30 minutes Durée : 30 minutes RT
Encastrer avec du gel d’agarose 1 h 2 h RT
Incuber dans de l’eau 20 % méthanol/80 % DI 1 h 2 h RT Déshydratation
Incuber dans 40 % d’eau méthanol/60 % d’eau DI 1 h 2 h RT
Incuber dans 60 % d’eau méthanol/40 % d’eau DI 1 h 2 h RT
Incuber dans 80 % d’eau méthanol/20 % DI 1 h 2 h RT
Incuber dans 100% méthanol 1 h 2 h RT
Incuber dans du méthanol frais à 100 % 1 h 2 h RT
Incuber dans du méthanol frais à 100 % Durée : 10 minutes Durée : 10 minutes 4°C Dépigmentation
Eau de Javel à 5% H2O2/méthanol Nuit Nuit 4°C
Incuber dans 100% méthanol 1 h 1 h RT
Délipidat avec 66 % de DCM/33 % de méthanol sur l’agitateur 3 h 3 h RT Délipidation
Incuber en DBE sur le shaker 2 jours 5 jours RT Correspondance des instances réservées

Tableau 1 : Étapes personnalisées de nettoyage des tissus pour l’imagerie par autofluorescence.

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Discussion

Les progrès de l’imagerie, du calcul et des méthodes d’élimination des tissus ont fourni une occasion sans précédent d’étudier en profondeur la structure et la fonction cardiaques. Cela présente un grand potentiel pour approfondir notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques à l’aide d’un modèle de cœur de rongeur intact. Contrairement aux études in vivo du cœur de poisson-zèbre utilisant une approche similaire 40,41,42,43, l’intégration de techniques LSM avancées et de méthodes de nettoyage des tissus nous permet de surmonter les défis entre la résolution spatiale et la profondeur de pénétration lors de l’imagerie du modèle de rongeur 9,44. Les techniques de nettoyage des tissus rendent les cœurs optiquement transparents en éliminant les lipides et autres éléments de diffusion de la lumière, ce qui permet une pénétration plus profonde de l’imagerie45. Lorsqu’il est couplé à la LSM, nous sommes capables d’imager le myocarde. Cette combinaison améliore la profondeur de l’imagerie et permet d’observer la microstructure myocardique complexe. Bien que de nombreuses méthodes de nettoyage aient été mises au point18, nous avons adapté l’iDISCO20 pour rendre rapidement le cœur intact transparent par rapport à d’autres méthodes de nettoyage des tissus15, ce qui le rend facilement disponible pour l’imagerie de l’autofluorescence du myocarde. Pour un marquage par fluorescence spécifique, les protocoles originaux iDISCO et Adipo-Clear46 peuvent être combinés avec l’immunocoloration dans ce système d’imagerie personnalisé, malgré l’incubation plus longue. Pendant ce temps, les méthodes qui préservent la fluorescence endogène et nécessitent un temps de traitement plus court sont préférées pour l’étude proposée. Contrairement à d’autres méthodes, cette plateforme offre les avantages suivants. Tout d’abord, nous utilisons un protocole iDISCO adapté pour le nettoyage des tissus, permettant un rendu rapide du cœur transparent en moins d'1 semaine tout en conservant l’autofluorescence du myocarde. Deuxièmement, nous intégrons des méthodes de calcul telles que l’assemblage d’images et la déconvolution multi-vues dans ce système établi de feuille de lumière pour l’imagerie cardiaque. Enfin, nous concevons et synchronisons le système ASLM pour améliorer la résolution axiale sur un grand champ de vision, permettant une imagerie multi-échelle et une analyse de la compaction et de la trabéculation du myocarde à une résolution quasi isotrope.

Pour capturer des images cardiaques du modèle de rongeur, nous avons fourni quatre approches basées sur le LSM : i) la méthode conventionnelle à des fins de dépistage19, ii) l’assemblage d’images, iii) la déconvolution multi-vues et iv) le balayage ASLM. Compte tenu de la variation de la taille du cœur entre les différents modèles, nous avons cherché à aborder le compromis fondamental entre la résolution spatiale, la vitesse d’acquisition et le champ de vision. Alors que l’assemblage d’images permet d’obtenir un grand FOV avec une résolution spatiale compromise, sa combinaison avec la déconvolution multivue ou ASLM offre une résolution quasi isotrope sur l’ensemble du FOV étendu pour couvrir l’ensemble du cœur de la souris adulte. De plus, l’intégration de ces méthodes améliore la qualité de l’image et le contraste dans les tissus profonds, permettant une reconstruction numérique complète des modèles 3D de microstructures telles que la trabéculation myocardique et le compactage à l’intérieur des ventricules. Cependant, le déluge d’ensembles de données, les coûts de traitement de calcul élevés, la nécessité d’un recalage précis des images et le potentiel d’artefacts dans la déconvolution multivue et l’assemblage d’images entravent leurs vastes applications. Bien que l’ASLM soit une alternative émergente, la complexité de la synchronisation du système, les stratégies de balayage laser et la dépendance à la transparence des tissus posent des défis qui peuvent affecter la robustesse du système et augmenter le risque de photolésions cardiaques.

Collectivement, cette méthodologie, y compris l’imagerie LSM et le nettoyage des tissus, fournit un point de départ pour explorer la structure cardiaque des nouveau-nés aux adultes. Il a le potentiel de localiser la distribution des lignées cardiaques spécialisées et leurs fonctions au cours du développement cardiaque47. Avec le développement de l’analyse computationnelle adaptée aux applications cardiaques 6,48,49,50,51,52,53 , ce cadre peut être étendu pour étudier les processus de remodelage cardiaque, en particulier en réponse à l’infarctus du myocarde. En fin de compte, cette stratégie holistique a le potentiel de démêler le mécanisme sous-jacent de la morphogenèse cardiaque et de faire progresser le développement d’interventions thérapeutiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous exprimons notre gratitude au groupe du Dr Eric Olson du UT Southwestern Medical Center pour avoir généreusement partagé les modèles animaux. Nous apprécions tous les commentaires constructifs fournis par les membres de D-incubator à UT Dallas. Ce travail a été soutenu par le programme NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) et UT Dallas STARS (Y.D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Agarose
Low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Deionized water - -
Chemicals for tissue clearing 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans Sigma-Aldrich 118184
D.E.R.™ 332 Sigma-Aldrich 31185
D.E.R.™ 736 Sigma-Aldrich 31191
Dibenzyl ether (DBE) Sigma-Aldrich 33630
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
Fluorescent beads Spherotech FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2) Sigma-Aldrich 216736
Methanol Sigma-Aldrich 439193
Paraformaldehyde (PFA) Thermo Fisher 47392
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich 79383
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Software and algorithms
Amira Thermo Fisher Scientific 2021.2
BigStitcher Hörl et al.22
Fiji-ImageJ Schindelin et al.20 1.54f
HCImage Live Hamamatsu Photonics 4.6.1.2
LabVIEW National Instruments Corporation 2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body Olympus MVX-ZB10 
10X Illumination objective Nikon MRH00105
1X detection objective Olympus MV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS Laser Laserglow Technologies LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser Laserglow Technologies LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser Laserglow Technologies LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector National Instrument BNC-2110
Cylindrical lens Thorlabs ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes Physik Instrumente C-884.4DC
ETL Optotune EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable Optotune CAB-6-300
ETL Lens Driver Optotune EL-E-4i
Filter Chroma ET525/30
Filter Chroma ET585-40
Filter Chroma ET645-75
Filter wheel  Shutter Instrument LAMBDA 10-B
Motorized translation stage Physik Instrumente L-406.20DG10
Motorized translation stage Physik Instrumente L-406.40DG10
Motorized translation stage Physik Instrumente M-403.4PD
NI multifunction I/O National Instrument PCIe-6363
sCMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
Stepper motor Pololu 1474
Tube lens Olympus MVX-TLU

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Almasian, M., Saberigarakani, A., Zhang, X., Lee, B., Ding, Y. Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts. J. Vis. Exp. (205), e66707, doi:10.3791/66707 (2024).

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