从胎盘中的造血干细胞的分离和分析
Summary
我们已经确定了在开发过程中作为一个主要的造血器官，胎盘。我们发现，造血干细胞（HSCs）都产生和扩大，在胎盘中的独特的微环境龛。在这里，我们描述了在小鼠胎盘中的造血干细胞的分离和可视化所需的实验技术。
Abstract
造血干细胞（HSCs）有能力自我更新，并生成整个一个人的一生血液谱系的所有类型的细胞。所有的造血干细胞出现在胚胎发育期间，后池的大小是保持自我更新的细胞分裂。已确定的造血干细胞和调节HSC的发展过程中的关键发育事件的解剖来源复杂，很多解剖部位参与在胎儿造血。最近，我们发现胎盘作为一个主要的造血器官的造血干细胞是生成和独特的微环境龛扩大（格卡斯，等2005年，罗德等2008）。因此，胎盘是造血干细胞在它们的出现和最初的扩张的重要来源。
在这篇文章中，我们解剖小鼠胎盘从E10.5和E12.5的胚胎，分别对应启动造血干细胞，并在胎盘的HSC的池的大小高峰期的发育阶段，隔离技术。此外，我们目前的胎盘组织中的酶和机械解离成单细胞停止使用流式细胞仪或功能分析的优化协议。我们已经发现，胎盘单细胞悬浮液胶原酶的使用提供了足够的造血干细胞的产量。从胎盘影响HSC的收益率的一个重要因素是机械分离的程度之前，和持续时间，酶处理。
我们还提供了编制固定冷冻胎盘组织切片的可视化开发造血干细胞免疫组织化学在其精确的细胞龛的协议。由于造血特异性抗原是不是保存在石蜡包埋切片做准备，我们经常使用固定的冰冻切片本地化胎盘造血干细胞和祖细胞。
Protocol
Discussion
在本议定书中所描述的实验程序将允许胎盘组织造血干细胞和祖细胞的分离和可视化。对于预计在胎盘和其他胎儿造血器官的造血干细胞产量和胎儿发育的整个全面的总结，我们指的格卡斯，等。 2005年。对于发展中的造血干细胞和胎盘中的其他造血细胞的本地化，我们是指罗得岛等。 2008年。
Materials
Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)
References
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).
