בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה
Summary
זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים במהלך ההתפתחות. מצאנו כי בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הן שנוצר הרחיב בשליה בתוך נישות microenvironmental ייחודי. כאן אנו מתארים ניסיוני בטכניקות נדרש בידוד להדמיה של HSCs את השליה העכבר.
Abstract
בתאי גזע hematopoietic (HSCs) יש את היכולת העצמית לחדש וליצור כל סוגי תאים של שושלות דם במהלך חייו של הפרט. HSCs כל לצוץ במהלך ההתפתחות העוברית, שלאחריו גודל הבריכה שלהם מתוחזק על ידי עצמית חידוש חלוקות תא. זיהוי המקור האנטומי של HSCs והאירועים התפתחותי קריטי בוויסות תהליך של התפתחות HSC כבר מסובך כמו באתרים אנטומיים רבים להשתתף במהלך hematopoiesis העובר. לאחרונה זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים שבהם HSCs נוצרות והורחב נישות microenvironmental ייחודי (Gekas, et al 2005, רודוס, et al 2008). כתוצאה מכך, השליה מהווה מקור חשוב של HSCs במהלך הופעתה שלהם והרחבת הראשונית.
במאמר זה, אנו מראים טכניקות לנתיחה עבור בידוד של השליה Murine מ E10.5 ו E12.5 עוברים, התואמת את שלבי ההתפתחות של תחילת HSCs ואת שיא בגודל של הבריכה HSC את השליה, בהתאמה. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ניתוק האנזימטית מכנית של רקמת השליה לתוך ההשעיה תא יחיד לשימוש cytometry זרימה או מבחני תפקודית. מצאנו כי השימוש collagenase להשעיה תא בודד של השליה נותן תשואות מספיק HSCs. גורם חשוב המשפיע תשואה HSC מן השליה היא מידת הניתוק מכני לפני, ומשך טיפול אנזימטי.
אנו מספקים גם פרוטוקול להכנת קבוע קפוא סעיפים רקמת השליה להדמיה של פיתוח HSCs ידי אימונוהיסטוכימיה בתוך נישות הסלולר המדויק שלהם. כמו אנטיגנים ספציפיים hematopoietic אינם נשמרים במהלך הכנת סעיפים פרפין מוטבע, אנו משתמשים באופן שגרתי חלקים קפואים קבוע localizing HSCs השליה אבות.
Protocol
Discussion
הפרוצדורות המתוארות פרוטוקול זה יאפשר בידוד הדמיה של רקמות השליה גזע hematopoietic ו ובתאים. לסיכום מקיף על תשואה מספר הסלולר צפוי של HSCs בשליה ושאר איברים hematopoietic העובר לאורך התפתחות העובר אנו מתייחסים Gekas, et al. 2005. עבור לוקליזציה של HSCs בפיתוח תאים hematopoietic אחרים השליה אנו מתייחסים רודוס…
Materials
Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)
References
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).
