Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Summary

Wir haben die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ während der Entwicklung identifiziert. Wir fanden, dass hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind beide generiert und erweitert in der Plazenta in einzigartige Mikroumgebung Nischen. Hier beschreiben wir experimentelle Techniken zur Isolierung und Visualisierung von HSZ in der Maus Plazenta erforderlich.

Abstract

Hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und generieren alle Zelltypen des Blutes Linien über die gesamte Lebensdauer eines Individuums. Alle HSCs entstehen während der embryonalen Entwicklung, nach denen ihre Pool-Größe durch sich selbst erneuernden Zellteilungen wird beibehalten. Die Ermittlung der anatomischen Ursprung der HSC und die kritische Entwicklungsschritte regulieren den Prozess der HSC Entwicklung wurde kompliziert, wie viele anatomische Sites während der fetalen Hämatopoese beteiligt. Kürzlich haben wir festgestellt, die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ, in dem HSC generiert und erweitert in einmaliger Mikroumgebung Nischen (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Folglich ist die Plazenta eine wichtige Quelle für Blutstammzellen bei ihrer Entstehung und erste Expansion.

In diesem Artikel zeigen wir Dissektion Techniken zur Isolierung von murinen Plazenta von E10.5 und E12.5 Embryonen, entsprechend der Entwicklungsstadien der Einleitung von HSK und die Spitze in der Größe der HSC-Pool in der Plazenta, bzw.. Darüber hinaus präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die enzymatische und mechanische Dissoziation von Plazentagewebe in den Single-Zell-Suspension für den Einsatz in der Durchflusszytometrie oder funktionellen Assays. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung von Kollagenase für Einzel-Zell-Suspension der Plazenta auskömmlichen Renditen von HSK gibt. Ein wichtiger Einflussfaktor HSC Ertrag aus der Plazenta ist der Grad der mechanischen Dissoziation vor, und die Dauer der, enzymatische Behandlung.

Wir bieten auch ein Protokoll für die Herstellung von festen gefrorenen Plazentagewebe Abschnitte für die Visualisierung der Entwicklung von Blutstammzellen durch Immunhistochemie in ihrer genauen zellulären Nischen. Als hämatopoetischen spezifische Antigene nicht während der Herstellung der in Paraffin eingebetteten Abschnitte erhalten sind, verwenden wir routinemäßig fixiert Gefrierschnitten für die Lokalisierung der Plazenta HSCs und Vorläuferzellen.

Protocol

1. Embryo und Plazenta Entfernung Dissektion Um zu beginnen, müssen Embryonen zunächst von schwangeren Muttertiere isoliert werden. Die Tiere sind gemäß den vereinbarten Verfahren eingeschläfert – in unserem Fall werden wir eine tödliche Dosis des Anästhetikums Isofluran verwenden Zuerst sprühen den Bauch mit Ethanol und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. Losreißen die Haut mit beiden Händen auf den Bauch aufzudecken und aufgeschnitten das Bauchfell. <li…

Discussion

Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wird für die Isolierung und die Visualisierung von Plazentagewebe und hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen zu ermöglichen. Für einen umfassenden Überblick über erwartete zellulären Ertrag und Anzahl der HSZ in Plazenta und anderen fetalen blutbildenden Organe während der fetalen Entwicklung verweisen wir auf Gekas, et al. 2005. Für die Lokalisierung der Entwicklung von Blutstammzellen und anderen hämatopoetischen Zellen in der Plazenta verweisen wir auf Rhodos, e…

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)